Name: 基于分子对接和去泛素化酶探针技术的中药化合物抑制 UCHL3 活性的筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 了解基于分子对接和去泛素化酶探针技术的计算方法，用于从中药丹参中筛选UCHL3抑制剂丹酚酸。该方法结合生物信息学技术验证小分子与靶蛋白的相互作用。

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本工作由北京市自然科学基金［资助编号 7244498］资助。

1. 下载小分子的结构 丹参 Bge 与 UCHL3
<ol>
	<li>下载小分子文件。
	<ol>
		<li>打开 TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com），输入&#160;丹参 （药材名称），然后点击 搜索 ，并在结果列表中点击丹参根 。</li>
		<li>逐项点击 下载 ，并将二维结构以 .mol2 格式 保存 。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下载蛋白质文件。
	<ol>
		<li>打开 PDB 数据库（https://www.rcsb.org/），&#160;输入 UCHL3，然后点击 搜索。在筛选条件中点击 Homo sapiens，然后点击 搜索。</li>
		<li>选择具有小分子-蛋白质共结晶结构的 1XD3 ，点击 下载 文件，并选择 PDB 格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分子对接
<ol>
	<li>保存文件。
	<ol>
		<li>在桌面上创建一个名为 danshen_UCHL3 docking 的新文件夹，并将化合物保存到该文件夹中 丹参 此文件夹中的 Bge 和 UCHL3 结构。请使用英文命名文件夹，否则文件将无法导入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置路径。
	<ol>
		<li>打开 Maestro 软件，点击 文件，选择 更改工作目录，点击 桌面，双击以选择 丹参_CUHL3 对接文件夹，然后单击 选择选项.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小分子处理
	<ol>
		<li>导入小分子结构。
		<ol>
			<li>点击 文件 和 导入结构 选项。点击 桌面，双击 对接文件夹，然后单击 丹参 Bge 结构 文件。然后，单击 打开 导入所有小分子。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备小分子。
		<ol>
			<li>点击 任务 并选择 LigPrep 选项。在显示的 LigPrep 窗口，单击 项目表 在 使用结构来自 选项，检查 从三维结构确定手性 在计算选项下选择该选项，其余软件设置保持默认。</li>
			<li>更改作业名称为 丹参_ligprep1，然后点击 运行 执行小分子处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质结构处理
	<ol>
		<li>导入蛋白质结构。
		<ol>
			<li>点击 文件 和 导入结构 选项，点击 桌面 并双击 danshen_CUHL3 分子对接文件 文件夹.</li>
			<li>点击 UCHL3 蛋白结构 文件，然后单击 开放 导入蛋白质结构文件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备蛋白质。
		<ol>
			<li>选择连接 UCHL3 和小分子的两个共价键，并使用以下方法将其删除 删除 按钮，然后选择删除后不完整的两个蛋白质残基。单击 构建 按钮，选择 其他编辑，然后点击 Gly75 C 按钮，选择 Cys95 突变残基 和 CYS.</li>
			<li>点击 任务 并选择 蛋白质制备工作流程 选项。其余软件设置均保持默认。将作业名称更改为 UCHL3 蛋白预处理，然后点击 运行 进行蛋白质加工。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置对接箱。
		<ol>
			<li>点击 任务，选择 受体网格生成，并选择 选择以鉴定配体 分子。在工作区中选择小分子，一个以该小分子坐标为中心的粉色对接框将出现。</li>
			<li>保持默认设置，将任务命名为 1XD3_danshen_glide_grid，然后单击 运行. 
			注意：在1XD3中，小分子与蛋白质形成共价键。必须去除该共价键才能将小分子与蛋白质分离；否则，在受体网格设置过程中无法选中小分子。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行分子对接。
	<ol>
		<li>点击 任务 并选择 配体对接 选项。选择 受体网格， 点击 从文件，然后点击 浏览选择 1XD3_danshen_glide_grid.zip 文件，然后单击 开放.</li>
		<li>点击 使用配体从 作为 文件，然后点击 浏览. 点击 丹参_ligprep1 文件，选择 danshen_ligprep1-out.maegz 文件，然后单击 打开.</li>
		<li>点击 设置 并选择 精准度 作为 SP 选项，将作业名称更改为 丹参_UCHL3_滑动对接_SP，然后单击 运行.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>查看对接结果。
	<ol>
		<li>点击 文件 和 导入结构 选项。点击 桌面 并双击 丹参_CUHL3 对接文件夹.</li>
		<li>双击 丹参_UCHL3_ glidedock _SP 文件，单击 danshen_UCHL3_glidedock_SP_pv.maegz 文件，然后单击 开放.</li>
		<li>点击 表格 选项，然后在对接评分下查看分数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可视化丹参素与UCHL3的相互作用。
	<ol>
		<li>双击 danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz 文件并打开它 在 Maestro 中在条目列表中，按住 移位 并同时选择 丹参素与蛋白质.</li>
		<li>右键单击并选择 合并 以创建一个 新结构. 选择 新结构，右键单击，选择 导出，然后点击 结构，为文件命名 丹参素_UCHL3，并导出它 以 .pdb 格式.</li>
		<li>选择 融合结构 在面板中，单击 任务，选择 2D 结构式绘制工具，并获得丹参素与UCHL3相互作用的二维结构图。</li>
		<li>导入 danshensu_UCHL3.pdb 将文件导入 PyMOL 软件，并根据从 Maestro 获得的二维结构进行可视化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. UCHL3 蛋白的纯化
<ol>
	<li>构建pHUE-UCHL3原核表达质粒
	<ol>
		<li>从NCBI获取重组蛋白UCHL3基因的编码序列（isoform2）。通过同源重组将获得的基因片段插入pHUE-10HIS载体中，并转化至DH5α感受态细胞。提取质粒DNA以获得目标构建体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重组蛋白的诱导与纯化
	<ol>
		<li>细菌培养：
		<ol>
			<li>将重组质粒转化至BL21 (DE3)感受态细胞，并涂布于含氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)琼脂平板上。于37 °C过夜培养。</li>
			<li>挑取单克隆菌落，接种至12 mL含50 µg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37 °C过夜培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转化与诱导
		<ol>
			<li>用新鲜培养基将过夜培养的菌液稀释至2%。当OD600达到0.4–0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mM，在16 °C低温诱导12小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>菌液收集
		<ol>
			<li>将菌液转移至无菌离心管中，在2200 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，将菌体沉淀于-80 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>超声破碎
		<ol>
			<li>用25 mL缓冲液1（50 mM HEPES pH 7.5，200 mM NaCl，1 mM EDTA）重悬菌体（体积为收集菌液的1/20）。在以下条件下进行超声处理：开启4秒，关闭6秒，能量设定为60%，持续15分钟。加入1% Triton X-100，在4 °C裂解30–60分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>上清与沉淀分离
		<ol>
			<li>在4 °C、9000 × g条件下离心样品30分钟。收集上清液，并通过0.45 µm膜滤器过滤。保留50 µL上清液作为输入样品。</li>
			<li>用缓冲液1重悬沉淀，加入适量5×上样缓冲液（25% 1M Tris-HCl [pH 6.8]，10% 十二烷基硫酸钠，0.5% 溴酚蓝，41.67% 甘油，10% DL-二硫苏糖醇），于100 °C煮沸10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白纯化
	<ol>
		<li>柱平衡
		<ol>
			<li>将1 mL NiNTA镍树脂装入层析柱，静置10分钟，随后依次用含10 mM、500 mM和10 mM咪唑的缓冲液2（50 mM HEPES pH 7.5，50 mM NaCl）各5个柱体积进行平衡。</li>
			<li>用移液器沿柱壁缓慢加入5 mL（约5个柱体积）10 mM咪唑溶液，此过程无需控制流速。</li>
			<li>当液体刚好覆盖填料且即将流尽时，依次加入5个柱体积的500 mM咪唑溶液和10 mM咪唑溶液进行平衡。当剩余的10 mM咪唑溶液刚好覆盖填料时，关闭流速控制器，停止平衡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>蛋白纯化
		<ol>
			<li>以0.5 mL/min的流速（&#60;每滴15秒）将过滤后的蛋白上清液过柱，收集穿流组分。使用缓冲液2配制含0.5 M NaCl的10 mM、30 mM、50 mM和100 mM咪唑浓度梯度。</li>
			<li>按咪唑浓度由低到高依次洗脱，用移液器沿柱壁缓慢加入约5个柱体积的洗脱液，无需控制流速。用洁净的1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集1 mL。</li>
			<li>收集前五管后，从每管取1 µL洗脱液与1 µL Bradford试剂反应。若反应液保持蓝色，则继续洗脱；若变为透明，则在该浓度停止洗脱，切换至下一浓度。</li>
			<li>使用100 mM咪唑洗脱后，用10个柱体积的0.5 M NaCl冲洗层析柱，无需控制流速，也不收集洗脱液。</li>
			<li>最后用500 mM咪唑进行洗脱（&#60;每滴15秒）。用移液器向柱中加入1 mL洗脱液，保持上述慢速洗脱条件。用1.5 mL离心管收集1 mL洗脱液，重复此操作10次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用考马斯亮蓝染色评估纯化蛋白。
		<ol>
			<li>取前期获得的沉淀、纯化前上清液及收集的10管蛋白样品各10 µL，加入适量5×上样缓冲液，于100 °C加热5分钟进行定量。</li>
			<li>配制1 mg/mL、500 µg/mL和100 µg/mL的牛血清白蛋白（BSA）标准溶液，加入适量5×上样缓冲液，于100 °C加热5分钟。</li>
			<li>对样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，在低速摇床上用考马斯亮蓝染色液室温（RT）染色过夜。</li>
			<li>次日将凝胶转移至脱色液（40%乙醇，10%乙酸，50% H2O）中脱色，必要时可轻微加热。待背景透明后，在成像仪下观察，根据BSA标准品水平定量纯化蛋白，并通过是否存在单一蛋白条带评估纯度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>蛋白储存：将蛋白分装至离心管中，每管50 µL，液氮速冻后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. UCHL3 活性检测（Ub-AMC 检测）
<ol>
	<li>蛋白质制备
	<ol>
		<li>将蛋白质在冰上解冻，于室温下以 1000 × g 离心样品 3 分钟，并使用 BCA 法测定蛋白质浓度。用缓冲液 1 将蛋白质稀释至 40 nM 的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分组设置
	<ol>
		<li>将缓冲液 1 设为对照组，UCHL3 设为实验组。在 96 孔板中每孔加入 200 µL 各样品，每组设置 3 个重复孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测
	<ol>
		<li>测量前立即快速向各孔中加入 Ub-AMC，并剧烈震荡 2–5 秒。Ub-AMC 的使用浓度为 250 nM。在 37 °C 条件下，以 380 nm 激发波长和 460 nm 发射波长测定吸光度值，每 30 秒读数一次，持续 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. HA-Ub-VS（HA-Ub-VS 试验）对 UCHL3 活性抑制的检测
<ol>
	<li>蛋白质制备
	<ol>
		<li>将蛋白质在冰上解冻，于室温下以1000 × g 离心3分钟，使用BCA法测定蛋白质浓度。将蛋白质稀释至10 µg/mL的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小分子化合物的制备
	<ol>
		<li>称取丹参素，并用高纯水梯度稀释至5 mM、1 mM、100 µM、10 µM和1 µM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分组设置
	<ol>
		<li>设置纯蛋白质组和不含小分子药物的组作为阴性对照组。以PR619（去泛素化酶抑制剂）作为阳性对照组，其余组作为小分子药物处理组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>根据分组情况，依次向各药物处理组中加入9 µL UCHL3和1 µL相应浓度的丹参素。向阳性对照组中加入1 µL PR619（使用浓度为50 µM）。阴性对照组使用高纯水和Buffer 1补齐体积。</li>
		<li>涡旋充分混匀后，于37 °C孵育30分钟。将反应样品置于冰上，加入HA-Ub-VS至终浓度为1 µM，再次涡旋充分混匀，于37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>加入适量5×上样缓冲液，在100 °C金属浴中加热10分钟。将样品在室温放置5分钟后上样至凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>SDS-PAGE 胶的制备
	<ol>
		<li>用超纯水冲洗一组玻璃板，将玻璃板放入夹紧槽中，再置于透明板上。加入超纯水，密封性检查10分钟。</li>
		<li>根据胶配制表配制分离胶。</li>
		<li>倒出胶板中的高纯水，并用滤纸吸干残留水分。迅速且均匀地加入已配好的12%分离胶。然后加入1 mL异丙醇，静置约30分钟，直至胶完全凝固。</li>
		<li>根据胶配制表配制上层浓缩胶。</li>
		<li>去除分离胶上方的异丙醇，用高纯水洗涤3次，并用滤纸吸干。迅速加入已配好的3%浓缩胶，插入1.0 mm 15孔梳子，静置约30分钟。 
		注意：保持梳子与胶面垂直，确保无气泡产生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电泳
	<ol>
		<li>垂直拔出梳子，向电泳装置内槽加入足量电泳缓冲液，确保液体覆盖样品孔。</li>
		<li>将蛋白Marker和已制备的实验样品置于室温，充分涡旋混匀后短暂离心。向最左侧第一个样品孔加入3 µL蛋白Marker，随后每个孔加入10 µL实验样品。</li>
		<li>向电泳槽外槽加入适量电泳缓冲液，盖上槽盖，连接电源。确保电源连接正确。</li>
		<li>打开电源，设置电压为80 V，待样品浓缩成线状后，当样品进入分离胶并开始分离时，将电压升至120 V。 
		注意：过程中确保底部无气泡产生；若出现气泡，可将电泳装置向一侧倾斜以排出气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转膜
	<ol>
		<li>使用塑料刀撬开胶板，剪去左上角（样品加样起始处）一角以标记方向。将凝胶及所需滤纸浸泡于转膜缓冲液中1–2分钟。</li>
		<li>根据目标蛋白所需大小测量并裁剪聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。将PVDF膜浸入甲醇中活化20秒至1分钟，随后与凝胶一同浸入转膜缓冲液中。</li>
		<li>向转膜装置中加入少量转膜缓冲液，用滚轮润湿半干转膜仪。从下至上依次放置：三层滤纸、凝胶、PVDF膜、再三层滤纸。</li>
		<li>每放置一层后，用滚轮去除气泡。用转膜缓冲液润湿盖板后盖上装置。 
		注意：确保有足够转膜缓冲液，在每层放置完成后可适量补充。提前做好标记，区分凝胶加样侧的左右方向，并识别膜的正反面。每层放置后应轻柔滚压以去除气泡。</li>
		<li>打开电源，确认极性正确。调节电流至190 mA，设定时间为45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭
	<ol>
		<li>用TBST（含1% Tween20）配制5%脱脂奶粉溶液作为封闭液。将PVDF膜正面朝上放入杂交盒中，加入10 mL封闭液，在室温低速摇床上轻轻摇动封闭1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用抗体稀释液1按1:1000比例稀释一抗，取10 mL加入新的孵育盒中。将孵育盒置于4 °C冰箱中，在摇床上过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>次日回收孵育盒中的一抗，加入适量TBST溶液，在摇床上洗涤5分钟，重复3次。</li>
		<li>用5%脱脂奶粉溶液按1:5000比例稀释二抗。取1 mL二抗滴加至湿润的杂交盒底部。将PVDF膜蛋白面朝下贴附于二抗液滴上，于室温低速摇床上孵育1.5小时。</li>
		<li>加入适量TBST溶液，在摇床上洗涤5分钟；重复3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显影
	<ol>
		<li>取等体积的化学发光试剂A和B，震荡并充分混匀。避光保存。</li>
		<li>将显影液均匀滴加至PVDF膜表面，轻轻晃动以确保膜被溶液均匀覆盖。</li>
		<li>将膜放入凝胶成像系统，设置曝光时间、曝光次数及其他相关参数。 
		注意：显影液必须完全覆盖条带，且显影过程应在暗环境中进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Virtual Screening and Validation of UCHL3 Inhibitors Using Molecular Docking

作者声明无利益冲突。

去泛素化酶（DUBs）通过从底物或聚泛素链上移除泛素，在调控整个泛素系统稳态中发挥关键作用37。近年来，这些酶作为药物开发靶点也受到广泛关注13。然而，小分子药物开发过程中仍存在诸多挑战。例如，涉及数以万计小分子库的高通量筛选会导致高昂的成本和巨大的工作负担38。中药具有数千年的临床应用历史，且拥有坚实的中医理论基础，其天然产物在人类疾病预防与治疗以及新药发现与设计中发挥着不可替代的作用25。
本文报道了一种将分子对接与泛素特异性蛋白酶探针技术相结合的方法，用于筛选可抑制特定去泛素化酶（DUB）靶点的中药天然产物。结果表明，在中药丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的小分子化合物库中，丹参素对UCHL3具有较高的对接活性。体外实验显示，丹参素能够以竞争性方式抑制HA-Ub-VS对UCHL3的活性。该结合生物信息学与分子实验的方法可广泛应用...

泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰过程，该过程由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶将泛素分子共价连接到靶蛋白上，而整个泛素化过程可由去泛素化酶（DUBs）逆转1,2,3,4。由于DUBs在生理和病理过程中具有重要作用，因此被认为是药物研发的重要靶点5,6。
人类中已鉴定出超过100种去泛素化酶（DUBs）7,8。它们通常作为异肽酶发挥作用，负责切割泛素C末端与底物蛋白或另一个泛素分子中赖氨酸残基之间的异肽键9,10。目前，这些酶主要分为七大类：泛素特异性蛋白酶（USPs）、卵巢肿瘤蛋白酶（OTUs）、Jab1/Mov34/Mpr1 Pad1 N末端+结构域蛋白酶（JAMMs）、含泛素基序相互作用的新型去泛素化酶家族蛋白酶（MINDYs）、泛素C末端水解酶（UCHs）、马查多-约瑟夫病结构域蛋白酶（MJDs）以及含锌指结构的泛素蛋白酶1（ZUP1）9。除属于锌金属蛋白酶家族的JAMMs外11，其余DUBs均为半胱氨酸蛋白酶，其特征是具有由催化性半胱氨酸、组氨酸和第三个酸性残基组成的催化三联体12,13。这种特异性为开发靶向酶活性位点或邻近变构口袋的小分子抑制剂提供了可能。
在去泛素化酶研究领域，表征其活性仍存在重大挑战14,15。基于活性探针的表征方法是研究去泛素化酶（DUB）抑制剂的关键途径之一16。通过在细胞裂解液或重组蛋白中使用基于活性的探针与抑制剂进行竞争性实验，可实现对DUB活性的表征，从而推动靶向这些酶的小分子抑制剂的开发。Ub-AMC 是早期用于检测DUB活性的探针，其泛素C末端连接有一个荧光基团17,18。当DUB发挥催化作用时，AMC被大量释放，其检测光的荧光强度相应增强。该探针已广泛应用于DUB抑制剂的高通量筛选19,20。HA-Ub-VS探针也被用于测定DUB活性21。该探针在泛素C末端含有一个乙烯基砜基团，使其成为DUB的自杀性底物。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，可通过蛋白质印迹法（western blotting）检测有活性的DUB22,23,24。
中药（Traditional Chinese Medicine, TCM）使用药用植物已有2000多年的历史。从天然产物中开发新药具有重要的医学意义，其中关键的研究方向在于鉴定活性成分并阐明其作用机制25。Salvia miltiorrhiza Bge 是一种广泛用于治疗多种疾病的草本植物，包括癌症、心血管疾病、肝脏疾病和神经系统疾病26。目前，该植物中已知含有丹参酮（tanshinone）27、丹参素（Danshensu）28、丹参酸（tanshinic acid）29等小分子化合物。这些化合物具有抗血栓、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性，因此在科研中具有很高的研究价值26。近期研究发现，丹参素（Danshensu）可作为SARS-CoV-2 3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease, 3CLpro）的共价抑制剂30，能够与3CLpro活性位点的C145残基形成共价键，表明Salvia miltiorrhiza Bge中可能存在潜在的小分子蛋白酶抑制剂。
泛素C端水解酶L3（Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3, UCHL3）属于去泛素化酶（DUBs）中的UCH家族中的半胱氨酸蛋白酶。它依赖于半胱氨酸95、组氨酸169和天冬氨酸184等保守残基，以有效催化其功能31,32。UCHL3在多种分子通路中发挥关键作用，包括细胞周期、同源重组以及蛋白质连接的DNA断裂修复33。此外，它在多种癌症中表达上调，如卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌34。基于这些研究，UCHL3似乎是治疗疾病的一个有前景的靶点。目前已鉴定出多种UCHL3的小分子抑制剂，并正在向临床应用推进35,36。
本研究中，采用分子对接方法研究小分子与靶标之间的相互作用 丹参 Bge 和 UCHL3。随后，一个 体外 使用DUB特异性探针Ub-AMC和HA-Ub-VS的实验鉴定出丹参素为UCHL3的小分子抑制剂。分子对接结果也预测了丹参素的潜在结合位点，提示其作用机制。

<table><tbody><tr><td>30% 丙烯酰胺</td><td>北京雷博尔生物科技有限公司</td><td>A3291</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>中国医药集团有限公司</td><td>10002616</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体&amp;nbsp;#7074</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Plus</td><td>碧云天</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 蛋白定量试剂盒</td><td>碧云天</td><td>P0006</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra 一步法克隆试剂盒</td><td>诺唯赞</td><td>C115-01</td><td></td></tr><tr><td>丹参素</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>B20254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Ameresco, Inc.</td><td>21K2356571</td><td></td></tr><tr><td>电泳系统</td><td>六一生物技术</td><td>112-0630</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His 标签蛋白纯化试剂盒（NTA-Ni 琼脂糖磁珠）</td><td>碧云天</td><td>P2247S</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF 膜，卷状，26 cm × 3.3 m</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>麦克林</td><td>I811925</td><td></td></tr><tr><td>M5 预染蛋白 Marker</td><td>美迪科生物技术有限公司</td><td>MF-212-01</td><td></td></tr><tr><td>Maestro</td><td>Schr&amp;ouml;dinger&amp;rsquo;s</td><td>https://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>中国医药集团有限公司</td><td>10014108</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>MyFug&amp;nbsp;mini 离心机</td><td>Sigma</td><td>Z764183</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 无需稀释快速金标 BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>A55860</td><td></td></tr><tr><td>PR-619</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>26065S</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot 一抗稀释缓冲液</td><td>麦克林</td><td>P917820</td><td></td></tr><tr><td>重组人 HA-泛素乙烯砜蛋白，CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>U-212-025</td><td></td></tr><tr><td>重组人泛素 AMC 蛋白，CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>U-550-050</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Ameresco, Inc.</td><td>205-788-1</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Ameresco, Inc.</td><td>2545C134</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>北京雷博尔生物科技有限公司</td><td>0777-1</td><td></td></tr><tr><td>UCHL3 (D25E6) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8141T</td><td></td></tr></tbody></table>

基于分子对接与去泛素化酶探针技术筛选抑制uchl3活性的中药化合物

Screening Traditional Chinese Medicine Compounds for Inhibiting UCHL3 Activity Based on Molecular Docking and Deubiquitinating Enzyme Probe Technology

去泛素化酶&#160;(DUBs) 在调控泛素化稳态中发挥关键作用，其中 UCHL3 是一种典型的半胱氨酸型 DUB，深度参与多种生理与病理过程。因此，开发靶向泛素C末端水解酶L3（UCHL3）的小分子抑制剂具有重要意义。本实验方案旨在建立针对以 UCHL3 为代表的半胱氨酸型 DUB 小分子抑制剂的虚拟筛选及体外验证流程。首先，利用分子对接技术对 UCHL3 的潜在抑制剂进行虚拟筛选，并可视化药物与蛋白靶点之间的相互作用。随后，通过体外活性抑制实验验证筛选得到的化合物——丹参素（Danshensu）的抑制效果。实验中使用泛素-7-氨基-4-甲基香豆素（Ub-AMC）和血凝素标记的泛素乙烯基砜（HA-Ub-VS）作为探针进行体外活性检测，这些探针可与小分子抑制剂竞争结合 DUB，从而评估 UCHL3 的酶活性。结果表明，丹参素在分子对接中与 UCHL3 具有良好的结合亲和力，并能与 HA-Ub-VS 竞争性地抑制 UCHL3 的活性。这些发现为进一步研发靶向 UCHL3 的治疗药物提供了重要参考。

为了筛选出丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）中能够有效抑制UCHL3的小分子，我们对从TCMSP网站获取的小分子与UCHL3进行了分子对接。对接结果中排名前30的小分子及其得分如表1所示，所有小分子的对接结果见补充表1。我们选择丹参素作为代表性小分子进行研究。如图1所示，丹参素与UCHL3分别与ARG-186、HIS-169、VAL-166和ASN-93形成氢键，其对接得分为-4.75 kcal/mol，表明具有良好的结合活性。
为了验证丹参素对UCHL3的抑制活性，我们随后纯化了UCHL3的重组蛋白 体外，如图所示 图 2A接下来，进行Ub-AMC水解实验以评估纯化的UCHL3蛋白的酶活性。如图所示， 图2B与对照组相比，在380 nm激发光和460 nm发射光条件下，UCHL3组...

本实验采用分子对接结合探针技术的方法，预测并验证中药小分子与蛋白质靶标之间的相互作用。

基于分子对接与去泛素化酶探针技术筛选抑制UCHL3活性的中药化合物

去泛素化酶（DUBs）在调控泛素化稳态中发挥关键作用，其中UCHL3是一种典型的半胱氨酸型去泛素化酶，具有复杂的……

我们的研究重点是从中药天然产物中筛选具有生物活性的小分子化合物。我们探索了如何利用工具分子和生物信息学技术，从丹参中鉴定去泛素化酶的小分子抑制剂。用于表征去泛素化酶活性的工具分子包括 Ub-TAMRA、Ub-RHO、Ub-VME、Ub-PA 等。我们首次发现丹参素是一种去泛素化酶UCHL3的小分子抑制剂。[旁白] 首先，在计算机上打开TCMSP数据库。输入中药名称丹参。然后点击搜索，并从结果列表中选择Radix Salviae。依次点击每一项，并逐一下载其二维结构。将二维结构保存为.mol2格式。接下来，打开PDB数据库并输入UCHL3，然后点击搜索。点击Homo sapiens，再在“Refinements”中点击搜索。选择具有小分子蛋白共结晶结构的1XD3，点击“Download Files”，并选择PDB格式进行下载。打开名为“danshen UCHL3 docking”的文件夹，其中包含丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）化合物和UCHL3结构的保存文件。接下来，打开Maestro软件。点击“File”，然后选择“Change Working Directory”。点击“Desktop”，双击“danshen_UCHL3_docking”文件夹，然后点击“Choose”。接着点击“File”并选择“Import Structures”。导航至桌面，打开docking文件夹，选择Salvia miltiorrhiza Bge的结构文件，点击“Open”以导入小分子。接下来，点击“Tasks”并选择“LigPrep”选项。在LigPrep窗口中，在“use structure from”选项下选择“Project Table”。然后在“Computation”部分勾选“Determine chiralities from three dimensional structure”选项。其余设置保持默认。将任务名称更改为danshen_ligprep1，然后点击“Run”以执行小分子处理。为导入蛋白结构，点击“File”并选择“Import Structures”。然后导航至桌面，双击“Danshen UCHL3 docking”文件夹。点击UCHL3蛋白结构文件，选择“Open”以导入蛋白结构文件。对于GLY 75，选择连接UCHL3与小分子的两个共价键，使用“Delete”按钮将其删除。接着选择不完整的蛋白残基，点击“Build”按钮，然后点击“C”按钮。类似地，对于CYS 95，选择连接UCHL3与小分子的两个共价键，并使用“Delete”按钮将其删除。然后点击“Build”按钮，选择“other edits”，并选择“Mutate Residue”和“CYS”。接下来，点击“Tasks”并选择“Protein Preparation

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

基于分子对接和去泛素化酶探针技术的中药化合物抑制 UCHL3 活性的筛选

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’...

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。...

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

HCN通道与其辅助亚基之间的相互作用已被确定为重度抑郁症的治疗靶点。本文介绍了一种基于荧光偏振的方法，用于筛选该蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。...

识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌...

体外分析E3泛素连接酶功能

本文介绍了一种基于荧光素酶的报告基因检测方法的详细实验方案，该方法采用半自动化、高通量筛选模式。...

基于细胞的自噬相关4B半胱氨酸肽酶抑制剂药物筛选

本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。...

通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

本方案描述了采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱联用技术（UHPLC-Q-Orbitrap...

益气清解方治疗IgA肾病物质基础的UHPLC-Q-Orbitrap高分辨质谱联合网络药理学研究

灌肠是一种用于治疗重症急性胰腺炎（SAP）的中医治疗手段。该疗法通过肛门将中药液体注入直肠和结肠，并使药液在肠道内保留，经由肠黏膜吸收。本研究旨在为SAP患者建立标准化的灌肠操作流程。...

中药灌肠治疗重症急性胰腺炎患者

本研究介绍了一系列从植物中制备解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）样品的方法，并详细描述了解吸电喷雾电离装置的组装与安装、质谱成像数据采集及数据处理的流程。该方案可应用于多种条件下获取植物中的空间代谢组信息。...

使用解吸电喷雾电离质谱成像技术可视化中药空间代谢组中鉴定的代谢物

了解基于分子对接和去泛素化酶探针技术的计算方法，用于从中药丹参中筛选UCHL3抑制剂丹酚酸。该方法结合生物信息学技术验证小分子与靶蛋白的相互作用。

基于分子对接与去泛素化酶探针技术筛选抑制UCHL3活性的中药化合物

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