通过免疫染色对小鼠视网膜血管周细胞进行 3D 可视化

本研究的范围是利用先进的成像技术研究视网膜脉管系统中寄生虫的形态和空间分布。为了提供详细的视图来证明寄生虫的形态特征，该研究描述了一种结合眶后注射荧光剂、免疫荧光染色和组织透明处理的新方法，以推进我们领域的研究。

与小鼠视网膜组织的预清除状态相比，用荧光番茄内酯和PDGFR-β标记的血管和寄生虫在组织清除后背景信号明显减少，有助于更精确地观察它们的空间关系。

我们的结果表明，这些技术对于证明整个视网膜安装视网膜脉管系统中的寄生虫高度兼容。这些组织学技术的结合是从三维视图详细可视化寄生虫形态特征的有效方法。

[导师]首先，将麻醉的小鼠置于右侧卧位，头部朝左。用两根手指轻轻按压眶周区域，露出鼠标的左眼。使用配备 27 号针头的 1 毫升注射器，轻轻刺入眼眶静脉窦约两到三毫米，确保针头的斜角以 45 度角朝前。将 0.1 毫升荧光番茄内分泌素注射到眼眶静脉窦中。眶后注射五分钟后，对小鼠实施安乐死，并用手术剪刀打开胸腔。将一根 24 号针头通过左心室顶点插入左心室两毫米。用 20 毫升 0.9% 生理盐水以每分钟 3 毫升的速度进行灌注，然后使用 20 毫升 4% 生理盐水。在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中注入0.1毫升0.9%甲醛。接下来，将牺牲的老鼠侧放，用剪刀去除覆盖眼睛的皮肤。用剪刀和镊子对眼睛进行核。切断视神经和周围组织并抬起眼睛。将眼睛转移到 12 孔板中，在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液中固定在 4% 甲醛中两小时。固定后，在4摄氏度的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的25%蔗糖中冷冻保护眼睛，直到它沉入溶液底部。使用塑料牧师移液器，将眼睛转移到含有0.1摩尔磷酸盐缓冲液的培养皿中。用锋利的剪刀刺穿角膜边缘，在角膜和虹膜周围剪开，然后丢弃它们。使用镊子取出晶状体和玻璃体液。然后，用细镊子将杯状视网膜从眼睛中心拉开。在干净的培养皿中用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗视网膜。分离杯状小鼠视网膜后，将其与2%Triton X-100溶液在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中在4摄氏度下孵育20小时培养箱中过夜。第二天，将视网膜转移到阻断溶液中，并在 4 摄氏度的摇床上以 72 RPM 旋转过夜。然后，将视网膜放入含有稀释缓冲液中山羊抗PDGFR β一抗的微量离心管中。在四摄氏度下旋转摇床上的管子两天。两天后，在室温下用洗涤缓冲液洗涤视网膜两次。将视网膜放入洗涤缓冲液中，并将其转移到四摄氏度的摇床中过夜。第二天，将视网膜转移到微量离心管中，其中含有每毫升一毫克的驴抗山羊488二抗和每毫升荧光核染色剂DAPI每毫升0.2纳克的溶液。在 4 摄氏度下以 72 RPM 的速度旋转摇床上的管子五个小时。在室温下两次在带有洗涤缓冲液的六孔板中洗涤视网膜一小时。将视网膜在摇床上的洗涤缓冲液中在四摄氏度下孵育过夜。第二天，将视网膜转移到组织透明试剂中，并在37摄氏度下以60 RPM在摇床上轻轻旋转一小时。组织清除后，在干净的培养皿中用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗视网膜。使用弹簧剪刀，做四个放射形切口，达到视网膜半径的约 2/3，形成花瓣形状。压平视网膜并将其安装在显微镜载玻片上，视网膜内部朝上。使用一小块吸水纸去除多余的磷酸盐缓冲液。用垫片圈出安装的视网膜。用新鲜的组织透明化试剂填充间隙，并在上面放一个盖玻片。使用全景组织切片扫描仪扫描标记视网膜的蒙太奇视图。使用配备 2 倍和 10 倍镜头的成像系统拍摄更高放大倍率的图像，数值孔径分别为 0.40 和 0.95。 从标记的视网膜捕获两微米帧中的 50Z 堆栈图像。依次单击“设置起始焦平面”、“设置结束焦平面”、“设置步长”，选择“深度图案”、“图像捕获”和“Z 系列”，以使用投影和形貌模式将所有图像集成到单个对焦图像中。接下来，使用 499 和 519 纳米处的绿色荧光、591 和 618 纳米处的红色荧光以及 401 和 421 纳米处的蓝色荧光捕获图像。依次选择“添加新表面”，选择“体积设置”，选择“源通道”，调整显示，调整表面角度，快照，将Z-Stack共聚焦图像导入分析软件，并以三维图案重建图像。与未组织清除的视网膜相比，组织清除处理后整个安装视网膜的组织透明度有所增加。在组织清除前后，用番茄凝集素标记的视网膜脉管系统和用 PDGFR-β 标记的视网膜寄生虫可见，但组织清除后背景噪声降低。沿着维管树观察到视网膜寄生虫，显示出从视网膜中央到外围区域的渐变分布。来自清除视网膜的三维 Z-Stack 图像显示寄生虫紧紧包裹在不同直径的视网膜血管上，毛细血管中的 PDGFR-β染色更强。