Name: 骨骼肌间质细胞外囊泡的酶分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学习使用酶解和差速超速离心法从啮齿动物骨骼肌组织中分离高纯度间质细胞外囊泡的方法。该技术为研究肌肉稳态、神经肌肉疾病机制及开发诊断生物标志物提供重要基础。

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本工作由美国国防部W81XWH2210261项目（资助对象：Yao Yao）资助。

本方案通过机械剥离、酶解离、过滤和差速超速离心法从骨骼肌组织中分离细胞外囊泡（EVs）。该方法可用于分离单个或联合的啮齿类动物肢体肌肉群中的EVs，包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌（SOL）、腓肠肌（GAS）和股四头肌（QUA）。动物实验已获得佐治亚大学机构动物护理与使用委员会批准，研究遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南。动物饲养于佐治亚大学动物与乳品科学系的动物设施中。本研究使用野生型（C57BL/6J）成年雄性小鼠，组织取自3月龄处死的小鼠。所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 小鼠肌肉群的机械分离
<ol>
	<li>用 CO 处死小鼠2，随后进行颈椎脱位（遵循机构批准的方案）。剃除后肢两侧的毛发。</li>
	<li>将小鼠腿部固定于无菌培养皿中，使腿部前侧朝上（图1A).</li>
	<li>使用解剖剪在小鼠踝关节外侧皮肤上做一个5 mm的小切口。</li>
	<li>将剪刀的一侧刀刃小心插入切口，置于皮肤下方，但不得进入深层肌肉组织。随后，沿皮肤向上朝膝盖方向剪开，以延长切口长度。</li>
	<li>用粗头镊子夹住切口处的皮肤，扩大切口直至肌肉可见。</li>
	<li>定位胫骨外侧从膝部延伸至踝部的趾长伸肌11，并使用尖头镊子夹住并剥离覆盖在肌肉上的薄层结缔组织（图1B).</li>
	<li>在踝关节附近，辨认胫骨前肌（TA）末端的两条肌腱：其中一条直接与TA肌肉相连，另一条为趾长伸肌（EDL）肌腱，较细小，位于TA肌腱外侧相邻位置。使用解剖剪将两条肌腱切断。</li>
	<li>用粗头镊子夹住两条肌腱。然后，用另一把粗头或尖头镊子将肌腱分开，从而将趾长伸肌（TA）与趾长伸肌（EDL）分离。图1C).</li>
	<li>用粗头镊子夹住新切断的肌腱提起跟腱（TA）。然后使用解剖剪在靠近膝关节处剪断跟腱，从而分离肌肉。重复此操作以分离趾长伸肌（EDL），并将两块肌肉置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。</li>
	<li>松开腿部，将小鼠翻转，使其背侧朝上。</li>
	<li>腿部皮肤现已部分去除，使用解剖剪在踝关节附近剪开皮肤。然后用粗头镊子夹住皮肤并向上朝膝关节后方剥离，暴露腓肠肌（GAS）。</li>
	<li>使用解剖剪在踝关节附近切断腓肠肌腱（GAS tendon）图1D).</li>
	<li>用粗头镊子夹住腓肠肌（GAS）肌腱并向上提起，以暴露腓肠肌的下面。</li>
	<li>在靠近膝关节处（GAS 仍保持连接的位置）的 GAS 下方找到细小的 SOL 腱。使用解剖剪切断 SOL 腱，导致 SOL 向上收缩（图1E).</li>
	<li>用尖头镊子夹住切断的腓肠肌（SOL）肌腱，轻轻提起，从而将SOL从腓肠肌（GAS）的下方分离。</li>
	<li>用解剖剪刀切断腓肠肌断端所连接的比目鱼肌末端，从而分离这两块肌肉。将比目鱼肌保留在冰上预冷的PBS中。</li>
	<li>在靠近膝关节处切断股动脉，将其置于冰上的磷酸盐缓冲液中。</li>
	<li>去除膝关节以下所列的四块肌肉后，将小鼠翻转，使腹侧面朝上。</li>
	<li>如有需要，使用尖端粗糙的镊子进一步剥离皮肤，以暴露股外侧肌（QUA）。将小鼠腿部置于90°位置，使股外侧肌处于屈曲状态。使用解剖剪剪断靠近膝关节的肌腱。
	<ol>
		<li>通过在肌肉与骨骼之间进行切割，将股四头肌（QUA）与股骨分离，直至股四头肌仅由近端肌腱相连图1E然后，切断近端肌腱并移除股外侧肌。将股外侧肌置于冰上的磷酸盐缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保肌肉离断后，胫骨和腓骨清晰暴露（图1F).</li>
	<li>用 PBS 多次冲洗肌肉组织，以去除毛发和血液等污染物（图1G然后用纸巾轻轻擦干肌肉。使用分析天平称量肌肉重量，该数据将用于后续计算每克肌肉收集的EV含量。</li>
</ol>
2. 脱落肌肉组织块的酶解离
<ol>
	<li>使用尖头镊子、碎屑镊子、手术刀或剪刀轻轻去除肌肉样本上的肌腱（图2A）。</li>
	<li>去除肌腱后，沿肌纤维方向（从一端肌腱至另一端肌腱）用剪刀或手术刀将肌肉纵向切成厚度约为1 mm的肌肉块，以增加表面积与体积之比（图2B，C）。 
	注意：切割过程中应尽量减少肌纤维的损伤。对于胫前肌（TA）、腓肠肌（GAS）和股四头肌（QUA）等较大的肌肉，相比趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌（SOL）等较小的肌肉，需进行更多切口，以确保所有肌肉样本的表面积与体积之比大致相等（图2D）。</li>
	<li>为每只小鼠准备10 mL新鲜的消化酶缓冲液（DEB），并在使用前置于冰上保存。
	<ol>
		<li>配制DEB时，将2 mg胶原酶II酶溶解于1 mL含1%青霉素-链霉素溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。混合后通过0.2 µm滤膜过滤溶液。</li>
		<li>确保DEB的酶活性超过250单位。涡旋振荡DEB直至溶液充分混匀，且胶原酶II酶粉末不可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肌肉组织分装成若干份，每份含20 mg肌肉组织，然后向每份中加入1 mL DEB，用于酶解离。</li>
	<li>将DEB与肌肉组织的混合物置于摇床中，在37 °C、100转/分钟（rpm）的条件下孵育12小时（图2E）。</li>
</ol>
3. 过滤和低速离心以富集骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EV）
注意：将制冷离心机设定为 4 °C 并运行至达到设定温度。所有需要的离心管和样品在使用前均应置于冰上保存。
<ol>
	<li>完成酶消化步骤后，确保肉眼中不可见明显的肌肉块（图3A）。在冷藏离心前，从DEB-肌肉混合液中取出10 µL溶液，转移至0.2 mL离心管中，以备进行细胞活力检测。</li>
	<li>准备并标记新的空的1.5 mL微量离心管。安装一个0.45 µm滤器，并取一个5 mL注射器，抽出活塞（请勿丢弃），将注射器接口旋入0.45 µm滤器的上端。将滤器放置好，使其下端插入新标记的空离心管中（图3D）。使用0.2 µm滤器过滤1x PBS缓冲液。</li>
	<li>将混合液在4 °C条件下以1,000 x g离心10分钟，以沉淀任何残渣（图3B）。使用P200移液器将上清液（约1 mL）转移至注射器中（图3C、E）。</li>
	<li>重新插入注射器活塞，缓慢推动上清液使其通过滤器，并收集到新标记的1.5 mL微量离心管中（图3F）。</li>
	<li>再次取出活塞，用移液器将约200 µL的1x PBS加入注射器中。</li>
	<li>重新插入活塞，缓慢推动200 µL的1x PBS通过滤器（图3G），以冲洗滤器中残留的上清液并收集至已标记的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>对其他样品管重复过滤过程，每个组织样品使用新的滤器。</li>
	<li>过滤完成后，确保溶液透明，无残留肌肉块（图3H）。</li>
</ol>
4. 骨骼肌来源细胞外囊泡纯化的差速超速离心法
注意：将制冷离心机设定为 4 °C 并运行至达到设定温度。将所有需要的离心管和样品置于冰上，并准备好使用。
<ol>
	<li>将过滤后的溶液转移至新的1.5 mL微量离心管中（适用于最高200,000 × g离心力）。用额外的1× PBS平衡所有微量离心管，确保体积相等，然后放入微型超速离心机中。</li>
	<li>确认所有离心管体积相等后，盖紧管盖，并将离心管放入微型超速离心机的转子中进行平衡（图4A）。</li>
	<li>打开微型超速离心机，设置运行条件为100,000 × g、4 °C，离心1小时（图4B）。</li>
	<li>将装有离心管的转子放入微型超速离心机中，关闭盖子，并启动真空系统（图4C）。</li>
	<li>当真空度达到2级时，按下启动按钮，等待离心过程完成（图4D）。</li>
	<li>微型超速离心机运行结束后，点击真空按钮使离心腔重新加压，然后取出转子和离心管。将离心管保持在冰上，并直立放置，避免扰动沉淀物。</li>
	<li>使用P200移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀物（图4E）。</li>
	<li>弹出移液器吸头，然后在用P200移液器去除上清液后，向离心管中加入50 µL的1× PBS。对于GAS和QUA样品，可加入最多500 µL的1× PBS以促进溶解（图4F）。</li>
	<li>使用P20移液器（若加入500 µL则使用P200移液器）轻轻吹打，重悬沉淀物，直至其完全分散且不可见。</li>
	<li>盖紧离心管，短期储存（少于一周）置于4 °C，长期储存置于-80 °C，若样品将立即用于纳米流式细胞术、Western blot或其他检测，则将离心管放回冰上。</li>
</ol>

Optimized Isolation of Skeletal Muscle-Derived EVs for Research and Therapeutics

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该方案首先根据已有方案从小鼠后肢分离肌肉组织，或获取人死后肌肉组织16。随后的骨骼肌细胞外囊泡（SkM-EVs）分离步骤主要包括三个部分：温和酶消化组织以释放间质中的SkM-EVs，过滤和低速离心，以及超速离心。最后，采用多种技术对分离得到的SkM-EVs进行表征分析。
鉴于不同肢体肌肉在大小、肌纤维类型以及对外界刺激的抵抗能力方面存在显著差异17，本实验方案提供了从每一块单独肌肉中分离骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EVs）的详细步骤，包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌（SOL）、腓肠肌（GAS）以及股四头肌（QUA）。用于从小鼠体内分离肌肉组织并从这些肌肉组织中解离细胞的技术，借鉴自先前用于从成年啮齿类动物肌肉中分离完整肌纤维和干细胞的方法11,18。
随后，使用胶原酶对组织进行酶解消化，以松解细胞...

细胞外囊泡（EVs）是细胞释放到细胞外环境中的纳米级膜结合颗粒。这些EVs可通过被受体细胞摄取，传递核酸、蛋白质和脂质，从而调控多种信号通路。特别是来源于骨骼肌的EVs（SkM-EVs），已被证实可通过传递成肌调节性miRNA或转录因子，在肌肉退变、再生和生长过程中发挥重要作用1,2,3,4。随着对SkM-EV亚群及其特性的认识不断深入，这些囊泡在作为早期诊断生物标志物5,6以及神经肌肉疾病治疗靶点方面展现出广阔前景。这一快速发展的领域为病理机制研究和临床应用提供了令人期待的机遇。
目前关于骨骼肌细胞外囊泡（SkM-EVs）的研究主要集中于通过ex vivo培养后从细胞培养上清液中获取的EVs2,7,8，这引发了人们对细胞系在连续传代后靶细胞特性保真度的担忧，以及EVs特征在人工环境中易发生改变的问题。因此，有必要直接从肌肉组织中分离SkM-EVs，以避免ex vivo培养带来的影响，更真实地反映体内状态。尽管已有多种从肌肉组织中分离EVs的方法被建立9,10，但各研究在实验方案细节上仍存在显著差异，影响了结果的一致性和可比性。迫切需要建立一套标准化的SkM-EV分离与表征流程，以确保相关研究结果的可靠性。
基于骨骼肌的生理特性，我们建立了一种从啮齿类动物骨骼肌样本中分离和纯化骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EVs）的实验方案，该方法结合了机械剥离、酶解消化、过滤以及差速超速离心技术。通过纳米流式细胞术、BCA 蛋白定量分析和 Western blot 检测等综合分析表明，该方案可在较短时间内稳定地获得高纯度和高产量的 SkM-EVs。该方法适用于多种状态下的骨骼肌样本，包括急性与慢性肌肉损伤模型。此外，经过适当优化后，该技术也可用于人类患者或其他动物模型的肌肉组织。标准化 SkM-EV 的分离流程对于确保 SkM-EV 质量的一致性至关重要，有助于对 EVs 的特征（如产量、粒径、携带物组成及功能）进行有效比较，并推动其作为诊断生物标志物的潜在应用，同时加深我们对 SkM-EVs 在多种生理与病理过程中作用机制的理解。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 微型离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管（C）&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3448</td><td>透明、有刻度、非无菌</td></tr><tr><td>BD 5 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&amp;nbsp;</td><td>鲁尔锁紧头</td></tr><tr><td>细胞计数板，用于细胞计数仪的双腔室</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>清洗液</td><td>NanoFCM公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶II</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（10倍浓缩液）（无钙、无镁）</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td><td>最终使用稀释倍数为1x</td></tr><tr><td>DPBS/改良型（1x）</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD 纯水远程分配器</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRXSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 微型离心机转子</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 通用程序烘箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51028112</td><td>重力对流，2.3立方英尺，120伏</td></tr><tr><td>MemGlow-488 探针</td><td>Cytoskeleton公司</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>Millipak Special Millipore</td><td>Millipore Sigma</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips ER LTS 1000&amp;micro;L F 768G/8</td><td>Rainin</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips ER LTS 20&amp;micro;L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips ER LTS 200&amp;micro;L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>质控微珠</td><td>NanoFCM公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT 固定角转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>45539</td><td>11,000 转/分钟</td></tr><tr><td>S16 exo 65-155 nm 微珠</td><td>NanoFCM 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>SPI，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall mX 150+ 微型超速离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50135641</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>康宁</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>SPI，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15 mL 离心管</td><td>Avantor</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13 滤器</td><td>Cytiva</td><td>6782-1304</td><td>0.45 &amp;micro;m 孔径大小</td></tr><tr><td>野生型 C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号 #000664</td><td></td></tr></tbody></table>

骨骼肌间质细胞外囊泡的酶法分离

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的脂质双分子层包裹的纳米颗粒，用于运输蛋白质、RNA和DNA等生物活性物质，介导细胞间通讯。研究EV在肌肉稳态与疾病中的细胞间相互作用，有望加深我们对肌肉发育、再生及萎缩过程的理解。然而，目前分离骨骼肌来源EV（SkM-EVs）的方案在实现高纯度和高得率方面仍面临挑战，主要原因是难以在不破坏细胞膜的前提下有效地从肌肉组织中释放EV。本文介绍了一种高效的SkM-EV分离方案，包括机械剥离、酶解消化、过滤和超速离心等步骤。这些步骤经过优化，可增强EV从肌肉组织中的释放，获得高纯度的SkM-EVs。随后通过纳米流式细胞术、BCA蛋白定量分析和Western blot分析对分离得到的SkM-EVs的数量和质量进行表征。该方案有望为获取组织来源的EV建立一个可靠的平台，推动基础研究、疾病诊断及药物递送领域的发展。

按照本方案，成功从小鼠野生型的多个肌肉群中分离出骨骼肌来源的细胞外囊泡（SkM-EVs），包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌（SOL）、腓肠肌（GAS）以及股四头肌（QUA）。随后通过纳米流式细胞术对这些SkM-EVs进行了表征，其特征总结见表1。值得注意的是，每1 g肌肉组织即可获得高达1.18e14 ± 4.86e13个SkM-EVs，粒子平均粒径为73.93 nm ± 2.70 nm，中位粒径为72.55 nm ± 2.42 nm。粒径分布的方差为13.28 nm ± 1.71 nm（图5），完全符合公认的细胞外囊泡定义12,13。
为确保分离得到的骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EVs）的完整性，采用荧光生成型膜探针MemGlow-488对SkM-EV样本中的脂质结构进行标记（图5），结果显示...

本方案旨在通过机械剥离、酶解离、过滤和差速超速离心法，从啮齿类动物肌肉组织中分离和纯化骨骼肌间质细胞外囊泡（SkM-EVs）。该方法具有良好的重复性和可靠性。所获得的SkM-EVs有助于研究肌肉稳态及肌肉相关疾病，并有望作为诊断生物标志物或治疗载体加以应用。

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的脂质双层包被的纳米颗粒，用于运输蛋白质、RNA和DNA等生物活性物质，……

本方案旨在从啮齿类动物肌肉组织中分离和纯化骨骼肌间质来源的细胞外囊泡。这类细胞外囊泡将为揭示肌肉生理与疾病机制提供宝贵信息，并有望作为诊断生物标志物和治疗载体加以应用。该标准化方案将有助于分析和比较不同肌肉样本中骨骼肌来源细胞外囊泡的特性，包括产量、大小、内容物组成及功能。这些结果将增进我们对细胞外囊泡在多种生理和病理过程中作用的理解，并有助于将其应用于诊断生物标志物。我们的实验室将致力于以高效且节省时间的方式，稳定地制备高纯度和高产量的骨骼肌间质来源细胞外囊泡。我们的目标是探索其在病理中的作用及治疗潜力，特别是在神经肌肉疾病背景下的应用。首先，将已处死的小鼠腿部固定于无菌培养皿中，使腿部前侧朝上。使用解剖剪在小鼠踝关节外侧皮肤上做一个长约5毫米的切口。将解剖剪的一侧刀片插入切口，置于皮肤下方但肌肉组织上方。然后，沿皮肤向上朝膝盖方向剪开，以延长切口。使用粗头镊子夹住切口处的皮肤并向后拉，以扩大开口，直至肌肉可见。现在，找到位于胫骨外侧、从膝盖延伸至脚踝的胫骨前肌（TA 肌肉）。使用锋利的镊子夹住并小心剥离覆盖在胫骨前肌（TA肌）上的结缔组织。在踝关节附近，辨认出与TA肌相连的TA肌腱，以及位于TA肌腱外侧相邻位置的较细小的趾长伸肌（EDL）肌腱。使用解剖剪将两条肌腱切断。使用粗头镊子夹住两条肌腱。用另一对镊子小心地分离肌腱，将胫骨前肌（TA）与趾长伸肌（EDL）分开。然后，用粗头镊子夹住新切断的肌腱，提起胫骨前肌（TA）肌肉。使用解剖剪在靠近膝关节处切断趾长伸肌腱，去除肌肉组织。然后松开腿部，将小鼠翻转，使腿部后侧朝上。由于部分皮肤已被移除，使用解剖剪剪除踝关节附近残留的皮肤。用粗头镊子夹住切开的皮肤，向上朝膝盖后方剥离，暴露腓肠肌。使用解剖剪在踝关节附近切断腓肠肌腱。用粗头镊子夹住腓肠肌腱，向上提起，以暴露腓肠肌的底面。然后，在靠近膝关节处，于腓肠肌下方找到较小的比目鱼肌肌腱，此处腓肠肌仍保持连接。使用解剖剪切断比目鱼肌肌腱，使比目鱼肌向上收缩。用尖头镊子夹住已切断的比目鱼肌肌腱，轻轻提起，以将比目鱼肌从腓肠肌的下方分离。使用解剖剪在腓肠肌切断端处剪断比目鱼肌的末端，将两块肌肉完全分离。用解剖剪在靠近膝关节处剪断腓肠肌的末端，并将其置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中。去除膝关节以下的四块肌肉后，将小鼠翻转，使腹侧朝上。将小鼠腿部置于90度角，使股四头肌处于屈曲状态。使用解剖剪剪断靠近膝关节的肌腱。随后，为将股四头肌与股骨分离，沿肌肉与骨骼之间进行剪切，直至仅剩近端肌腱仍与肌肉相连。使用解剖剪切断近端肌腱，并移除股四头肌。用 PBS 多次冲洗所有移除的肌肉，以去除毛发和血液等污染物。使用纸巾轻轻吸干肌肉。首先使用尖头镊子、碎屑镊子、解剖刀或剪刀轻轻去除肌肉样本中的肌腱。然后用剪刀或解剖刀沿肌纤维方向，从一端肌腱到另一端纵向切割肌肉，切成约一毫米厚的小块。制备消化酶缓冲液时，将两毫克胶原酶与含有1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基混合，使终浓度为每毫升含两单位酶。混合后，将溶液通过0.2微米滤器过滤。将肌肉组织分装成若干等份，每份含20毫克肌肉。向每份组织中加入1毫升已配制的缓冲液，进行酶解消化并孵育。准备并标记新的1.5毫升微量离心管。取下5毫升注射器的活塞，安装0.45微米滤器。将注射器接头旋入0.45微米滤器的上端，并将滤器的下端置于已标记的微量离心管中。然后，在4°C条件下以1000 G离心10分钟，使沉淀物形成。使用P-200移液器将上清液转移至注射器中。将推杆重新插入注射器后，缓慢推动上清液使其通过滤膜，并收集到已标记的1.5毫升微量离心管中。再次取出注射器活塞。使用P-200移液器，向注射器内加入约200微升PBS。重新插入活塞，并缓慢推动200微升PBS通过滤膜，以冲洗残留的上清液进入已标记的微量离心管中。将过滤后的溶液转移至新的1.5毫升微量离心管中，该离心管适用于最高200,000 G的转速。关闭管盖后，将离心管放入微量超速离心机的转子中，确保平衡。启动微量超速离心机，设置在100,000 G、4摄氏度条件下运行1小时。将装有离心管的转子放入微量超速离心机内。关闭盖子并启动真空泵以开始程序。当真空度达到二级时，按下启动按钮，等待离心过程完成。离心循环结束后，在取出转子和离心管之前，点击真空按钮对腔室重新加压。使用 P-200 微量移液器小心吸除每支试管中的上清液。然后，使用同一支 P-200 微量移液器向每支试管中加入 50 µL 的 PBS。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

骨骼肌间质细胞外囊泡的酶分离

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通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习使用酶解和差速超速离心法从啮齿动物骨骼肌组织中分离高纯度间质细胞外囊泡的方法。该技术为研究肌肉稳态、神经肌肉疾病机制及开发诊断生物标志物提供重要基础。

骨骼肌间质细胞外囊泡的酶法分离

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