骨骼肌间质细胞外囊泡的酶法分离

本方案旨在从啮齿类动物肌肉组织中分离和纯化骨骼肌间质来源的细胞外囊泡。这类细胞外囊泡将为揭示肌肉生理与疾病机制提供宝贵信息，并有望作为诊断生物标志物和治疗载体加以应用。该标准化方案将有助于分析和比较不同肌肉样本中骨骼肌来源细胞外囊泡的特性，包括产量、大小、内容物组成及功能。

这些结果将增进我们对细胞外囊泡在多种生理和病理过程中作用的理解，并有助于将其应用于诊断生物标志物。我们的实验室将致力于以高效且节省时间的方式，稳定地制备高纯度和高产量的骨骼肌间质来源细胞外囊泡。我们的目标是探索其在病理中的作用及治疗潜力，特别是在神经肌肉疾病背景下的应用。

首先，将已处死的小鼠腿部固定于无菌培养皿中，使腿部前侧朝上。使用解剖剪在小鼠踝关节外侧皮肤上做一个长约5毫米的切口。将解剖剪的一侧刀片插入切口，置于皮肤下方但肌肉组织上方。

然后，沿皮肤向上朝膝盖方向剪开，以延长切口。使用粗头镊子夹住切口处的皮肤并向后拉，以扩大开口，直至肌肉可见。现在，找到位于胫骨外侧、从膝盖延伸至脚踝的胫骨前肌（TA 肌肉）。

使用锋利的镊子夹住并小心剥离覆盖在胫骨前肌（TA肌）上的结缔组织。在踝关节附近，辨认出与TA肌相连的TA肌腱，以及位于TA肌腱外侧相邻位置的较细小的趾长伸肌（EDL）肌腱。使用解剖剪将两条肌腱切断。

使用粗头镊子夹住两条肌腱。用另一对镊子小心地分离肌腱，将胫骨前肌（TA）与趾长伸肌（EDL）分开。然后，用粗头镊子夹住新切断的肌腱，提起胫骨前肌（TA）肌肉。

使用解剖剪在靠近膝关节处切断趾长伸肌腱，去除肌肉组织。然后松开腿部，将小鼠翻转，使腿部后侧朝上。由于部分皮肤已被移除，使用解剖剪剪除踝关节附近残留的皮肤。

用粗头镊子夹住切开的皮肤，向上朝膝盖后方剥离，暴露腓肠肌。使用解剖剪在踝关节附近切断腓肠肌腱。用粗头镊子夹住腓肠肌腱，向上提起，以暴露腓肠肌的底面。

然后，在靠近膝关节处，于腓肠肌下方找到较小的比目鱼肌肌腱，此处腓肠肌仍保持连接。使用解剖剪切断比目鱼肌肌腱，使比目鱼肌向上收缩。用尖头镊子夹住已切断的比目鱼肌肌腱，轻轻提起，以将比目鱼肌从腓肠肌的下方分离。

使用解剖剪在腓肠肌切断端处剪断比目鱼肌的末端，将两块肌肉完全分离。用解剖剪在靠近膝关节处剪断腓肠肌的末端，并将其置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中。去除膝关节以下的四块肌肉后，将小鼠翻转，使腹侧朝上。

将小鼠腿部置于90度角，使股四头肌处于屈曲状态。使用解剖剪剪断靠近膝关节的肌腱。随后，为将股四头肌与股骨分离，沿肌肉与骨骼之间进行剪切，直至仅剩近端肌腱仍与肌肉相连。

使用解剖剪切断近端肌腱，并移除股四头肌。用 PBS 多次冲洗所有移除的肌肉，以去除毛发和血液等污染物。使用纸巾轻轻吸干肌肉。

首先使用尖头镊子、碎屑镊子、解剖刀或剪刀轻轻去除肌肉样本中的肌腱。然后用剪刀或解剖刀沿肌纤维方向，从一端肌腱到另一端纵向切割肌肉，切成约一毫米厚的小块。制备消化酶缓冲液时，将两毫克胶原酶与含有1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基混合，使终浓度为每毫升含两单位酶。

混合后，将溶液通过0.2微米滤器过滤。将肌肉组织分装成若干等份，每份含20毫克肌肉。向每份组织中加入1毫升已配制的缓冲液，进行酶解消化并孵育。

准备并标记新的1.5毫升微量离心管。取下5毫升注射器的活塞，安装0.45微米滤器。将注射器接头旋入0.45微米滤器的上端，并将滤器的下端置于已标记的微量离心管中。

然后，在4°C条件下以1000 G离心10分钟，使沉淀物形成。使用P-200移液器将上清液转移至注射器中。将推杆重新插入注射器后，缓慢推动上清液使其通过滤膜，并收集到已标记的1.5毫升微量离心管中。

再次取出注射器活塞。使用P-200移液器，向注射器内加入约200微升PBS。重新插入活塞，并缓慢推动200微升PBS通过滤膜，以冲洗残留的上清液进入已标记的微量离心管中。

将过滤后的溶液转移至新的1.5毫升微量离心管中，该离心管适用于最高200,000 G的转速。关闭管盖后，将离心管放入微量超速离心机的转子中，确保平衡。启动微量超速离心机，设置在100,000 G、4摄氏度条件下运行1小时。将装有离心管的转子放入微量超速离心机内。

关闭盖子并启动真空泵以开始程序。当真空度达到二级时，按下启动按钮，等待离心过程完成。离心循环结束后，在取出转子和离心管之前，点击真空按钮对腔室重新加压。

使用 P-200 微量移液器小心吸除每支试管中的上清液。然后，使用同一支 P-200 微量移液器向每支试管中加入 50 µL 的 PBS。