用于研究芸苔属植物耐缺氧性的卷心菜原生质体系统的开发
2024年9月20日
该协议描述了一种高效的卷心菜叶肉原生质体系统。测试了各种缺氧处理，该系统显示缺氧反应基因的高度激活，有助于研究 十字花科 蔬菜耐洪的遗传和分子机制。
我们正在研究卷心菜在分子水平上对低氧的反应。由于卷心菜很难获得，我们正在开发一种使用分离的卷心菜细胞的系统。通过将这些备用细胞（也称为原生质体）暴露在低氧条件下，我们可以很容易地研究它们的应激反应。
使用悬浮在溶液中的原生质体来研究低氧反应是很棘手的。最大的挑战是为我们的对照样品保持足够的氧气。我们想出了一种将液体中的氧气泵出的方法。
我们已经通过缺氧标志物的报告基因测定验证了该方法。我们检查了处理低氧的不同方法，发现脱氧剂包效果最好。它易于使用且有效，非常适合研究原生质体在低氧条件下的行为。
由于可用工具的限制，在缺氧条件下研究叶类作物的分子机制一直具有挑战性，但随着最近的进展，我们通过使用缺氧处理的卷心菜原生质体系统取得了巨大进展。这种新方法正在帮助我们了解低氧如何在分子水平上影响这些植物。未来，我们计划将原生质体系统与免疫沉淀和报告基因测定相结合，以说明卷心菜在洪水胁迫期间参与的分子调控途径。
我们的目标是确定耐洪性的关键调节因子，我们希望这将有助于培育具有更高耐洪性的卷心菜新品种。首先，用商业植物基质填充 48 孔塞盘的圆形方形孔，然后将 Fuyudori 和 228 颗卷心菜种子播种到生长介质中约 1 厘米深。要制备 12.5 毫升酶溶液，请在 55 摄氏度下预热含有 10 毫摩尔 MES 和 0.6 摩尔甘露醇的溶液。
然后加入 1.5% 纤维素酶 R-10 和 0.75% macerozyme R-10。搅拌溶液并继续在 55 摄氏度下加热 10 分钟。让酶溶液冷却至室温。
然后加入 10 毫摩尔氯化钙和 0.1% 牛血清白蛋白。使用 0.22 微米注射器过滤器，将酶溶液灭菌到 9 厘米的培养皿中。生长两到三周后，在第二叶期收集卷心菜幼苗用于叶肉原生质体分离。
从 5 到 8 棵卷心菜幼苗中收集第二个新扩展的真叶。使用锋利的剃须刀片，将叶子切成 0.5 到 1.0 毫米的条状。立即将叶条转移到新鲜制备的酶溶液中。
将卷心菜叶条在黑暗中真空渗透 30 分钟。真空浸润后，将叶条在黑暗中浸入酶溶液中 4 至 16 小时。第二天，用等体积的 W5 溶液稀释含有原生质体的溶液以停止酶消化。
要释放原生质体的悬浮液，请在轨道振荡器上轻轻旋转混合物。然后通过 70 微米的细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 锥形管中。将原生质体溶液在 4 摄氏度下以 150 G 离心 2 分钟。
以大约每秒 1 毫升的流速沿管壁加入 10 毫升 W5 溶液，以洗涤沉淀的原生质体。最后一次离心后，将原生质体重悬于 W5 溶液中，并将试管置于冰上 30 分钟。然后一次去除 1 毫升上清液，直到去除所有上清液。
将原生质体重悬于冰预冷的 MMG 溶液中。使用血细胞计数器测量原生质体浓度。使用 MMG 溶液将最终浓度调整为 4 乘以 10 到每毫升 5 原生质体的幂。
分离和过夜消化后，Fuyudori 原生质体的产量为 1.04 乘以 10 的 7 次方，228 的原生质体产量为 4.00 乘以 10 的 6 次方。Fuyudori 和 228 个品种的原生质体转染效率均高于 40%，如 GFP 报告基因所示。分离卷心菜原生质体后，将 100 微升 4 乘以 10 倍的原生质体与 10 微升质粒混合，并将混合物置于冰上 10 分钟。
将等体积的新鲜制备的 PEG 溶液加入原生质体溶液中，轻轻混合。将原生质体混合物在室温下避光孵育 10 分钟。然后加入 440 微升 W5 溶液终止反应。
将转染的原生质体在 4 摄氏度下以 150 G 离心 2 分钟。将沉淀重悬于 750 微升富氧 W5 溶液中。将重悬的原生质体转移到预先编码有 1% 牛血清白蛋白的六孔组织培养板中。
对于耗氧袋诱导的缺氧，将含有 W5 原生质体溶液的板放入 3.5 升厌氧罐中。然后在罐子中加入两个脱氧剂包，以创造一个缺氧环境。处理后，将原生质体在 4 摄氏度下以 150 G 离心 2 分钟。
丢弃上清液并将收集的原生质体冷冻在液氮中，然后再进行双荧光素酶测定。与对照相比，脱氧剂包诱导的 BoADH1 启动子活性增加了 7.0 倍，表现出最高的缺氧反应。BoSUS1L 启动子活性增加了 5.6 倍以上，其中脱氧剂包处理在处理中显示出最大的诱导性。
概述
本研究探讨了卷心菜原生质体在低氧条件下的分子反应，这种条件模拟了淹水应激。通过开发一个新的原生质体系统来增强对缺氧反应基因的研究，研究旨在阐明十字花科蔬菜耐淹性的遗传机制。
关键研究组成部分
研究领域
- 植物应激反应
- 蔬菜耐淹性
- 遗传和分子机制
背景
- 卷心菜难以获得，需要像原生质体这样的细胞系统。
- 植物缺氧反应的研究受到现有技术的限制。
- 了解分子机制可以改进育种工作，以提高耐淹性。
使用的方法
- 使用酶解法开发分离的卷心菜原生质体系统。
- 将原生质体暴露于受控的低氧条件下，以模拟缺氧。
- 利用报告基因检测法来验证缺氧反应基因的激活。
主要结果
- 成功建立了一个具有高转染效率的原生质体系统。
- 暴露于吸氧处理的原生质体显示出缺氧反应基因表达的显著增加。
- 通过双重萤火虫荧光素酶检测法验证了关键缺氧标记物的诱导。
结论
- 该研究突出了一种有效的方法来分析卷心菜对低氧的分子反应。
- 研究结果可能有助于开发耐淹性更强的卷心菜品种。
常见问题
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
