Name: THP-1 细胞中基于电穿孔的 CRISPR-Cas9 介导的基因敲除和单细胞克隆分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学习使用CRISPR-Cas9电穿孔技术对THP-1细胞进行基因敲除和单细胞克隆分离的方法。该方案为研究巨噬细胞抗HIV机制及HT-1酶功能提供了可重复的实验流程。

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我们感谢JP Concordet（MNHN, U1154/UMR7196，巴黎）、G. Bossis（IGMM，蒙彼利埃）和D.&#160;感谢Schlüter（德国汉诺威医学院）分享实验方案并参与讨论。本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号101017572，授予AZ）和ANRS（资助编号ECTZ162721，授予AZ）的资助。传染病模型与创新治疗（IDMIT）研究基础设施得到了以下机构的支持： &#34;未来投资计划（PIA）&#34; 在参考项目 ANR_11_INSB_0008 下。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 使用 CRISPOR 进行向导设计（图 1.1）
注意：可在步骤 4、7 和 10 中使用 SnapGene Viewer 软件对编辑靶位点以及目的基因内 PCR 引物杂交位置进行注释。
<ol>
	<li>前往 Ensembl 网站（www.ensembl.org）。在&#160;搜索 选择物种并输入目标基因名称。点击 开始选择与基因（而非转录本）对应的结果。</li>
	<li>点击 显示转录本表格 然后选择 转录本 ID 对应于金标记的蛋白质编码 生物型 柱。进入转录页面后，点击 外显子 在左侧菜单中。</li>
	<li>向下滚动并点击 下载序列确保文件格式为 FASTA。在 设置 - 包含的序列，取消选择除...以外的所有内容 基因组序列. 
	输入数字 &#34;500&#34; 在 转录本两端的侧翼序列 盒。单击 预览，选择整个序列（仅核苷酸部分，不含标题），然后复制（Ctrl+C).</li>
	<li>打开 SnapGene Viewer 并点击 新 &#62; DNA文件. 粘贴序列（Ctrl+V) 注入到 创建序列 方框。取消勾选 检测常见特征 并选择 线性 在 拓扑结构. 
	重命名文件并点击 创建在左侧菜单中，取消选择 显示酶 （第一个图标）。在窗口底部，选择 序列 表。 
	&#8203;注意：此步骤可用于获取完整的基因序列，包括外显子、内含子以及500 bp的侧翼序列（可选）。后者对于设计用于扩增位于第一外显子内目标位点的PCR引物具有重要意义。</li>
	<li>返回 Ensembl 网站，向上滚动文件预览页面并点击 返回。现在，更改 文件格式 转至 RTF。在 设置 - 包含的序列，取消选择除以下之外的所有内容 外显子在 显示变体，选择 无. 点击 下载 在页面顶部。</li>
	<li>使用 Word 打开下载的文件，该文件包含外显子序列，并以蓝色显示编码序列，起始于起始密码子 ATG。选择拟通过 CRISPR-Cas9 定向编辑所靶向的外显子（选择建议见下文），选中该序列并复制（Ctrl+C).
	<ol>
		<li>靶向的外显子应为早期外显子，或编码蛋白质功能重要结构域的外显子。需注意的是，在靠近3'非翻译区（3' UTR）的晚期外显子中引入提前终止密码子（PTC）可能无法有效触发无义介导的mRNA降解（NMD），从而导致表达出C端截短的蛋白。相反，在靠近天然起始位点的早期外显子中引入PTC则存在发生非法翻译（ITL，亦称替代性翻译起始，ATI）的风险，可能从下游同框的非经典翻译起始位点（TIS）启动翻译，产生意外的N端截短蛋白。为降低这一风险，建议使用ATGpr工具评估替代性TIS的发生可能性。27 (atgpr.dbcls.jp) 和/或 NetStart 1.028 (www.services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/)</li>
		<li>确保目标外显子包含编码序列。然而，选择与起始ATG上游的5'非翻译区（5'UTR）区域结合的sgRNA可能更为有利，以便将其纳入删除片段中。</li>
		<li>理想情况下，靶向的外显子应存在于该基因的所有蛋白质编码转录本变体中。可通过在NCBI基因组数据浏览器（www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/）中搜索目标基因，以确认是否符合该情况。&#160; 
		点击显示窗口中绿色的基因名称将显示转录本变异体（紫色）。外显子以矩形表示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 SnapGene Viewer 中，按下 Ctrl+F，Ctrl+V，然后 进入 搜索外显子序列。按下 Ctrl+T 添加新功能，为其命名，并更改类型为 &#34;外显子&#34; 并点击 好的.</li>
	<li>前往 CRISPOR 网站（http://crispor.gi.ucsc.edu/），将外显子序列粘贴至页面中&#160;步骤 1首先，选择一个参考基因组 步骤 2 以及要靶向的PAM类型 步骤 3，通常为 SpCas9 的 20bp-NGG。点击 提交.</li>
	<li>选择两个sgRNA，使其间隔不超过150 bp，然后在两者之间选择第三个sgRNA。以下为sgRNA选择的一些指导原则：
	<ol>
		<li>MIT特异性评分与脱靶效应相关。评分越高，表明潜在的脱靶位点越少。右侧列显示了三个预测的脱靶位点，按可能性从高到低排序，并列出了其位置（位于外显子、内含子或基因间区域）。通过点击可获取预测脱靶位点的完整列表 显示全部尽可能选择具有 MIT 评分的 sgRNA &#62;80，并优先选择在0、1或2个错配情况下无脱靶效应的sgRNA。此外，应避免选择在外显子内存在脱靶位点的sgRNA，因为此类脱靶最有可能影响表型。</li>
		<li>关于预测的编辑效率，请参考 Doench '16 评分。需注意，较高的 Doench '16 评分仅表明该 sgRNA 更有可能具有编辑效果，实际编辑效率必须通过实验确定。因此，即使不打算将多个 sgRNA 联合使用，也建议同时选择若干个 sgRNA。</li>
		<li>GC 含量过高或过低，以及某些特定序列基序，均可能对 sgRNA 的效率产生不利影响，应予以避免。CRISPOR 会对此类参数进行高亮提示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 1.7，将 sgRNA 序列及其对应的 PAM 序列添加至 SnapGene Viewer 中的基因序列。同时，将 sgRNA 序列（不含 PAM）粘贴至文本文件或 Excel 文件中，以保留订购寡核苷酸时所需的 5'-3' 方向。</li>
	<li>针对目标位点的PCR扩增，设计一对位于其两侧的引物，扩增片段长度应在800至1000 bp之间。本实验方案中使用PrimerQuest设计引物（https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest）。此外，CRISPOR也可提供用于扩增目标基因组区域及潜在脱靶位点的引物列表。在显示全部潜在脱靶位点列表后（步骤1.9.1），点击&#160;脱靶引物 右下角</li>
</ol>
2. 电穿孔试剂和细胞的制备（图1.2）
<ol>
	<li>准备一个24孔培养板，用于电穿孔后回收细胞，每孔加入500 µL RPMI 1640培养基，培养基中添加20%热灭活（56 °C，30分钟）、经0.20 µm滤膜过滤的胎牛血清（FBS）。不要添加抗生素。将培养板置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中备用2 24小时，直至电穿孔。</li>
	<li>如果sgRNA以干粉形式运输，请用TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）重悬，配制成终浓度为100 µM的溶液即 每1 nmol sgRNA加入10 µL TE缓冲液。涡旋混匀30秒，4 °C孵育过夜以确保充分水合；短暂吹打混匀后，将sgRNA储存液于-20 °C保存。根据最终体积分装成若干 aliquot，避免反复冻融。</li>
	<li>将100 µM的储存液用无核酸酶水稀释至终浓度为30 µM，配制工作用sgRNA溶液。涡旋混匀30秒，室温孵育5分钟。</li>
	<li>以1:9的摩尔比组装Cas9:sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP），将三种30 µM sgRNA各取1 µL与0.5 µL的20 µM Cas9溶液同时加入3.5 µL电穿孔试剂盒中提供的重悬缓冲液R中（最终体积为7 µL，对应一个实验条件；根据需要按比例放大）。短暂涡旋混匀，室温孵育5分钟。</li>
	<li>同时，通过将0.5 µL的20 µM Cas9加入6.5 µL重悬缓冲液R中，制备未经编辑的对照样本。短暂涡旋混匀，并在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>向所有样本中加入5 µL重悬缓冲液R，使每种电穿孔条件的终体积为12 µL。</li>
	<li>准备THP-1细胞用于电穿孔。
	<ol>
		<li>通过台盼蓝排斥法检测细胞浓度和活力。将细胞与0.4%台盼蓝染色液按1:2比例稀释。室温孵育30秒后充分混匀，取10 µL加至改良Neubauer计数板的计数室边缘。计数三个大方格内的细胞数，将总数除以100，得到细胞浓度（x10⁶ cells/mL）。6 个/mL 
		注意：细胞的健康状况会影响其对电穿孔的敏感性。应确保在最佳条件下进行细胞培养。细胞在培养箱外的时间应尽量缩短，所有试剂和溶液均需提前配制并预热。</li>
		<li>每种条件下，收集相当于 0.2 x 10 的体积6 细胞并离心（336 × g，5 分钟，20 °C。</li>
		<li>用移液器吸去上清液，并将沉淀重悬于 500 µL PBS 中。再次离心（336 x g，5 分钟，20 °C。</li>
		<li>用移液器小心吸去上清液，并用12 µL RNP溶液（步骤2.6）重悬THP-1细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 电穿孔系统设置与核转染（图1.3）
<ol>
	<li>将移液工作站置于生物安全柜内，在支架上放置电穿孔管，并加入电穿孔试剂盒中提供的 3 mL 电穿孔缓冲液（Buffer E）。</li>
	<li>开启电穿孔仪后，通过触摸屏设置以下电穿孔参数：电压 = 1 500 V，持续时间 = 10 ms，次数 = 3。</li>
	<li>为电穿孔移液器装上吸头，吸取 10 µL RNP/THP-1 溶液（步骤 2.7.4）。将移液器插入电穿孔管中，按下电穿孔仪屏幕上的开始按钮。等待完成提示出现后，将移液器从管中取出。</li>
	<li>将细胞转移至预热的 24 孔板中的一个孔内，并轻轻混匀。将培养板放回加湿培养箱中，静置培养 72 小时。 
	注意：吸取 RNP/THP-1 悬液时应避免产生气泡，否则会影响电穿孔效果。若未观察到可见电弧却出现错误提示，可将电穿孔移液器从管中取出后再次按下开始按钮。然而，若观察到短暂亮光形式的电弧，则可能表明存在气泡，此时即使未显示错误信息，电穿孔过程也很可能失败。</li>
</ol>
4. 电穿孔后72小时THP-1细胞恢复（图1.4）
<ol>
	<li>电穿孔后72小时，计数细胞以评估浓度（步骤2.7.1）。</li>
	<li>若细胞数量充足（即≥0.6 × 106 个细胞/mL），则用添加了20%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基至少按2倍稀释，使细胞浓度调整至每毫升0.3–0.5 × 106 个细胞；否则，继续培养细胞，再恢复72小时。</li>
	<li>传代并扩增细胞，直至获得足够用于基因敲除验证的细胞量。在此期间，可开始进行单细胞克隆的分离（步骤7）。</li>
</ol>
5. 通过T7EI错配检测法验证基因编辑（图1.5）
注意：由于T7EI能够识别大于1 bp的错配，该检测方法可能会低估编辑效率。因此，除非进行适当修改（步骤5.7），T7EI检测不适用于筛选纯合细胞群体（即单细胞克隆）。
<ol>
	<li>测定细胞浓度（步骤 2.7.1），取相当于 0.1 × 106 个细胞的体积转移至 1.5 mL 离心管中。离心（336 × g，5 分钟，20 °C），吸除上清液，并将沉淀重悬于 500 µL PBS 中。再次离心后，用移液器尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀。迅速冷冻样品并储存在 -20 °C。</li>
	<li>提取基因组 DNA 作为 PCR 扩增的模板。
	<ol>
		<li>用 50 µL DNA 提取液重悬沉淀，混匀后将全部液体转移至 0.2 mL PCR 管中。涡旋振荡并短暂离心（脉冲 3 秒）。</li>
		<li>将 PCR 管放入热循环仪中，65 °C 加热 15 分钟，随后 98 °C 加热 10 分钟。</li>
		<li>用 90 µL 超纯水稀释提取的 DNA。涡旋振荡并短暂离心（5,000 × g，3 秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用超纯水稀释 PCR 引物（见材料表），使其终浓度为 10 µM（即 10 pmol/µL）。</li>
	<li>在 0.2 mL PCR 管中配制 PCR 反应体系（参见下方注释）（终体积 = 50 µL，每种条件一份）。通常至少包含两种条件：基因敲除组（KO）和仅表达 Cas9 的未编辑对照组。 
	注释：纯化的基因组 DNA：10 µL；正向与反向引物（10 µM）：各 2.5 µL，终浓度为 500 nM；反应缓冲液（5×）：10 µL。加入前充分涡旋混匀。dNTP 混合液（每种 25 mM）：0.6 µL，每种 dNTP 的终浓度为 0.3 mM；DNA 聚合酶：0.5 µL；超纯水：23.9 µL。涡旋混匀并短暂离心（脉冲 3 秒）。</li>
	<li>将 PCR 管放入热循环仪中，运行以下 PCR 程序： 
	注释：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 30 个循环 [98 °C 变性 20 秒，X °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 45 秒]，最后 72 °C 延伸 2 分钟。扩增结束后取出 PCR 管，涡旋混匀并短暂离心（脉冲 3 秒）。退火温度（X）为引物的熔解温度（Tm）减去 5 °C。</li>
	<li>对于多克隆编辑群体：在新的 0.2 mL PCR 管中加入 17.5 µL PCR 扩增产物和 2 µL NEBuffer 2（10×），终体积为 19.5 µL。涡旋混匀并短暂离心（脉冲 3 秒）。或者，若需筛选单细胞克隆，则将编辑组与未编辑对照组的 PCR 产物（步骤 5.6）等体积混合（1:1）（补充图 1）。</li>
	<li>为形成异源双链，将 PCR 管放入热循环仪中运行以下程序：95 °C 10 分钟；随后以 -2 °C/s 的速率从 95 °C 降温至 85 °C；再以 -0.3 °C/s 的速率从 85 °C 降温至 25 °C；最后在 10 °C 持续冷却并保持。</li>
	<li>异源双链形成后，向每管中加入 0.5 µL T7EI 酶溶液。37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>制备 1.2% 琼脂糖凝胶：
	<ol>
		<li>称取琼脂糖置于玻璃瓶中，加入适量 1× TAE 缓冲液（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.3）。盖上瓶盖但不要拧紧，放入微波炉加热，多次加热直至琼脂糖完全溶解。 
		注释：如需，可轻轻混匀。避免剧烈沸腾，否则会导致液体蒸发，改变琼脂糖浓度。</li>
		<li>加入稀释至 1/20,000 的 DNA 凝胶染料，充分混匀。</li>
		<li>将琼脂糖溶液倒入模具，插入梳子，在室温下静置使其凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 5 µL T7EI 消化产物（步骤 5.9）或未消化的 PCR 产物，与 5 µL 水和 2 µL 6× DNA 上样缓冲液混合，制备凝胶电泳样品。将样品及 DNA 分子量标准上样，在 80 V 条件下电泳 45 分钟（时间可根据预期 DNA 片段大小适当调整）。电泳结束后，使用合适的成像系统采集凝胶图像。</li>
</ol>
6. 通过Sanger测序分析验证基因编辑（图1.6）
<ol>
	<li>为表征基因修饰，对PCR产物（步骤5.4）进行纯化，经Sanger测序后，使用ICE工具分析结果（https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis）。</li>
	<li>判断蛋白是否能在修饰存在的情况下被产生。
	<ol>
		<li>下载ICE分析结果并打开contribs.txt文件。</li>
		<li>将编辑后的序列与野生型对应序列进行比较。定位插入缺失（indel），并确认其出现在靶向的基因组区域。评估其大小。若插入缺失长度不是3的倍数，则会发生移码突变，可能引入提前终止密码子（PTC）。突变的mRNA预期将经历由无义介导的mRNA降解（NMD）过程而被降解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 通过有限稀释法进行单细胞克隆分离（图 1.7）
注意：单细胞克隆的分离并非必需。然而，如果选择进行单细胞克隆分离，则必须对多个克隆进行表征，并将其表型与原始的多克隆群体进行比较。
<ol>
	<li>取一份细胞悬液样品，用培养基将其稀释1/2，测定细胞浓度（步骤2.7.1）。稀释可提高计数的准确性。</li>
	<li>进行2至3次连续稀释，使细胞浓度达到7个细胞/毫升。将100 µL细胞悬液分装至圆底96孔板的每个孔中（即每孔0.7个细胞）。将细胞静置数小时后，在显微镜下观察各孔，识别含有单个细胞的孔。</li>
	<li>定期监测克隆形成和细胞生长情况，并在需要时将细胞转移至更大的培养板或培养瓶中。</li>
</ol>
8. 通过HIV-1限制性实验对THP-1 SAMHD1基因敲除细胞的功能学表征
<ol>
	<li>将THP-1细胞以每孔0.25 × 106个细胞的密度接种于24孔培养板中，每孔加入300 µL含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（完全RPMI）并含有300 ng/mL PMA的RPMI培养基，用于诱导分化。将培养板置于加湿培养箱中（37 °C，5% CO2）培养24小时。</li>
	<li>更换为不含PMA的完全RPMI培养基，将培养板重新放回培养箱中继续培养24小时。</li>
	<li>使用真空泵吸除全部培养基。每孔加入250 µL含有VSVg假型HIV-1-GFP病毒原液的溶液（MOI = 0.5 IFU/细胞），并设置未感染对照组。将培养板置于4 °C环境中孵育2小时，以同步感染过程。</li>
	<li>用RPMI培养基洗涤细胞一次，每孔加入500 µL完全RPMI培养基，在标准条件下孵育48小时（时间可根据需要调整）。</li>
	<li>去除培养基后，用预冷的1×PBS洗涤细胞一次。每孔加入100 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养板置于37 °C培养箱中直至细胞完全脱落（约5分钟即可），然后加入200 µL完全RPMI培养基以终止酶反应。将每孔中的250 µL细胞悬液转移至96孔圆底板中（确保流式细胞仪可兼容该类型培养板）。</li>
	<li>将96孔板离心（757 × g，3分钟，减速度 = 6，20 °C），使用多通道移液器吸除上清液。用100 µL 4%多聚甲醛重悬细胞沉淀，4 °C孵育10分钟。再加入100 µL预冷的1×&#160;PBS。</li>
	<li>通过流式细胞术分析感染率，以GFP阳性细胞比例表示（参见补充图2中的建议设门策略）。</li>
</ol>

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<li>Seki, A., Rutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNP+transfection+for+highly+efficient+CRI+SPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.</a> J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).</li>
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<li>Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+renal+cell+lines+using+CRISPR+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies.</a> Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 888(2018).</li>
<li>Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illegitimate+translation+causes+unexpected+gene+expression+from+on-target+out-of-frame+alleles+created+by+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9.</a> Sci Rep. 6, 39608(2016).</li>
<li>Bowling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+alternate+start+site+allows+N-terminal+nonsense+variants+to+escape+NMD+and+results+in+functional+recovery+by+readthrough+and+modulator+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination.</a> J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).</li>
<li>Inácios, Â, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+mutations+in+close+proximity+to+the+initiation+codon+fail+to+trigger+full+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inversions+and+duplications+of+mammalian+regulatory+DNA+elements+and+gene+clusters+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9.</a> J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162 (4), 900-910 (2015).</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突。

本文描述了一种成功实现CRISPR介导的THP-1细胞系基因编辑的实验方案。该方法依赖于通过电穿孔/核转染将预先组装的sgRNA/Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）导入细胞。选择该策略旨在限制由慢病毒介导的sgRNA/Cas9表达盒整合所可能导致的脱靶效应，避免核酸酶的持续表达。为实现可靠且高效的基因编辑，我们针对目标基因设计了多个sgRNA，以提高产生基因组插入或缺失（indel）的可能性，从而导致蛋白表达丧失和功能性的基因敲除（KO）32。在电穿孔条件的优化上也给予了特别关注，以实现细胞膜通透性的最佳调控，确保sgRNA/Cas9 RNP高效递送，同时避免过度的细胞死亡33。在此过程中，细胞在电穿孔前的培养状态（例如较低的传代次数）是一个关键参数。
通过T7EI错配检测实验在遗传水平上验证了CRISPR-Cas9介导的基因编辑，该方法可对多个样本进行快速且经济的评估，用于Sanger测序前的预筛选。该方法最初是通过比较全长扩增子与切割产物的条带强度，以单个sgRNA评估编辑效率而开发...

THP-1 是一种来源于急性髓系白血病（AML）患者的单核细胞系，其表型特征与原代单核细胞非常相似1与不分裂、寿命有限且表型存在供体间和供体内部变异的原代单核细胞来源巨噬细胞相比，THP-1细胞可近乎无限地培养，且行为更为均一，有利于实验结果的可重复性2,3,4,5,6值得注意的是，THP-1 细胞可通过佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）诱导分化为类似巨噬细胞的表型，因此被广泛使用 体外 用于研究单核细胞/巨噬细胞对炎症信号反应的模型7,8,9,10,11,12,13 或由包括HIV在内的临床相关人类病原体引起的感染14,15,16基因改造THP-1细胞的可能性在众多生物学相关研究领域中具有重要意义。
成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白9（CRISPR-Cas9）是一种原核生物适应性免疫系统，依赖RNA引导的核酸酶降解入侵病毒基因组，现已被重新编程为一种基因工程工具17。基因组编辑过程分为三个步骤：识别、切割和修复。单导向RNA（sgRNA）通过其20个碱基的引导序列与基因组特定位点进行碱基配对，从而招募Cas9核酸酶。在20 bp基因组靶序列下游紧邻的原间隔序列邻近基序（PAM）的存在，会触发Cas9介导的DNA双链解旋，并在第17与第18位核苷酸之间（位于PAM上游3 bp处）进行切割。由此产生的双链断裂（DSB）可通过两条主要修复途径进行处理。若缺乏与损伤位点具有同源性的修复模板，易错的非同源末端连接（NHEJ）途径将引入随机的核苷酸插入和/或缺失（indels），可能导致移码突变和/或提前终止密码子（PTC）的产生。含有PTC的mRNA随后会被无义介导的mRNA降解（NMD）途径识别并降解，最终破坏蛋白质的表达或功能18,19,20。另一种修复机制为依赖模板的同源定向修复（HDR）途径，可精确修复DSB。该机制已被用于实现精准基因编辑，包括基因敲入和碱基替换。值得注意的是，细胞周期状态是影响DSB修复途径选择的重要因素。事实上，NHEJ在细胞周期的所有阶段均具有活性，而HDR则主要局限于S期和G2期21。
THP-1 细胞在悬浮状态下生长， notoriously 难以转染质粒 DNA，该操作可能会影响其存活率和/或分化能力22,23。通常采用携带 Cas9 和 sgRNA 的基于 HIV-1 的慢病毒载体进行转导，以实现目的基因的敲除（KO）24。Cas9/sgRNA 表达盒整合至细胞基因组可确保其长期表达并实现高效基因敲除，但也持续存在脱靶效应的风险25。另一种方法是通过电穿孔递送预先组装的 Cas9:sgRNA 核糖核蛋白复合物（RNPs），该方法通过施加电脉冲在细胞膜和核膜上瞬时形成孔道。在此过程中，维持细胞存活率是一个重要的挑战。
本研究构建了稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的 THP-1 细胞系（THP-1_GFP），用于建立高效的 CRISPR-Cas9 基因编辑实验方案。通过设计同时使用三种单导向 RNA（sgRNA）靶向失活EGFP基因的策略（多导向方法），以 GFP 表达水平作为检测指标，在多种电穿孔条件下评估基因敲除效率，并同步监测细胞增殖情况。基因编辑效果通过 T7 核酸内切酶 I（T7EI）检测和 Sanger 测序结合 CRISPR 编辑推断（Inference of CRISPR Edits, ICE）算法分析加以验证26。最终确定的实验参数可实现高达 95% 的 GFP 表达下降，且 THP-1 细胞在电穿孔后恢复正常的生长速率。该优化条件成功应用于失活内源性基因SAMHD1，并获得了单细胞来源的 THP-1 克隆。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td>_</td></tr><tr><td>0.4 % 台盼蓝</td><td>Beckman Coulter</td><td>383200</td><td>_</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>_</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>_</td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA 上样染料</td><td>Thermo scientific</td><td>R1161</td><td>_</td></tr><tr><td>75 cm&amp;sup2; 带通气盖培养瓶</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>_</td></tr><tr><td>8 联 PCR 管（带盖）</td><td>Life technologies</td><td>AM12230</td><td>_</td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Corning</td><td>353072</td><td>_</td></tr><tr><td>96 孔圆底板</td><td>Corning</td><td>353077</td><td>_</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Euromedex</td><td>D5</td><td>_</td></tr><tr><td>ATGpr</td><td>_</td><td>_</td><td>https://atgpr.dbcls.jp/</td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像系统</td><td>BIO-RAD</td><td>12003153</td><td>_</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>NanoEntek</td><td>DHC-N04</td><td>_</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>_</td><td>_</td><td>http://crispor.gi.ucsc.edu/</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>_</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>EMBL-EBI</td><td>_</td><td>https://www.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>v10.10</td><td>_</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Marker</td><td>Thermo scientific</td><td>SM0323</td><td>_</td></tr><tr><td>基因组数据浏览器（Genome Data Viewer）</td><td>NCBI</td><td>_</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>版本 9.3.1</td></tr><tr><td>Herculase II 融合 DNA 聚合酶</td><td>Agilent</td><td>600679</td><td>_</td></tr><tr><td>ICE CRISPR 分析工具</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis</td></tr><tr><td>Image Lab Touch</td><td>BIO-RAD</td><td>_</td><td>版本 2.4.0.03</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>随 T7EI M0302S 提供</td></tr><tr><td>Neon 转染试剂盒，10 &amp;micro;L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025K</td><td>电穿孔试剂盒，包含枪头、管、缓冲液 R 和 E</td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>_</td></tr><tr><td>NetStart 1.0</td><td>_</td><td>_</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td></tr><tr><td>PCR 引物（EGFP）</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT</td></tr><tr><td>PCR 引物（SAMHD1）</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>_</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>_</td></tr><tr><td>佛波酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>_</td></tr><tr><td>PrimerQuest</td><td>IDT</td><td>_</td><td>https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>_</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 提取液</td><td>Biosearch Technologies</td><td>QE09050</td><td>_</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>_</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>版本 7</td></tr><tr><td>SpCas9 2NLS 核酸酶</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>_</td></tr><tr><td>合成 sgRNA（EGFP）</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG</td></tr><tr><td>合成 sgRNA（SAMHD1）</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU</td></tr><tr><td>注射器 Plastipak 鲁尔锁头</td><td>BD</td><td>301229</td><td>_</td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td>_</td></tr><tr><td>T7 核酸内切酶 I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302S</td><td>_</td></tr><tr><td>TAE 缓冲液 UltraPure，10x</td><td>Invitrogen</td><td>15558026</td><td>400 mM Tris-乙酸盐，10 mM EDTA</td></tr><tr><td>THP-1 细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td>_</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05 %）</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>_</td></tr><tr><td>ZE5 细胞分析仪</td><td>BIO-RAD</td><td>12014135</td><td>_</td></tr></tbody></table>

基于电穿孔的crispr-cas9介导的thp-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

人急性单核细胞白血病（AML）THP-1 细胞系被广泛用作研究人单核细胞来源的巨噬细胞功能的模型，包括其与重要人类病原体（如人类免疫缺陷病毒（HIV））之间的相互作用。与其他永生化的髓系细胞系相比，THP-1 细胞保留了多种完整的炎症信号通路，并表现出更接近原代单核细胞的表型特征，包括在佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（PMA）处理后分化为巨噬细胞的能力。利用 CRISPR-Cas9 技术通过靶向基因敲除（KO）对 THP-1 细胞进行基因工程改造，为深入表征免疫相关机制（包括病毒-宿主相互作用）提供了有力手段。本文介绍了一种基于电穿孔递送预先组装的 Cas9:sgRNA 核糖核蛋白至细胞核的高效 CRISPR-Cas9 基因编辑方案。使用多个在相近位置靶向同一基因座的 sgRNA 可导致大片段 DNA 的缺失，从而提高编辑效率，该效率通过 T7 内切酶 I 检测进行评估。在基因水平上的 CRISPR-Cas9 编辑通过 Sanger 测序结合 CRISPR 编辑推断（ICE）分析进行验证。蛋白耗竭通过免疫印迹联合功能实验得以确认。采用本方案，可在靶向基因座实现高达 100% 的插入缺失（indel）率，并使蛋白表达水平降低超过 95%。如此高的编辑效率使得通过有限稀释法分离单细胞克隆变得十分便捷。

构建了稳定表达GFP报告蛋白的THP-1细胞系（THP-1_GFP）（图2A），并将其用作建立高效CRISPR-Cas9介导基因编辑方案的工具。为此，使用CRISPOR网络工具29&#160;设计了3条靶向EGFP基因的sgRNA（图2B），这些sgRNA与Cas9以9:1的摩尔比形成核糖核蛋白复合物（RNP），随后通过不同参数的电穿孔将RNP递送至细胞中。之后，细胞培养于仅含20% FBS的RPMI培养基中（图2C，上图）或与条件培养基以1:1比例混合的培养基中（图2C，下图）。通过监测细胞增殖及GFP表达水平（作为EGFP基因敲除效率的读数）随时间的变化进行评估。在多种条件下，GFP阳性细胞比例迅速下降，在电穿孔后第7天达到>90%的减少率。在电穿孔后第3天，细胞数量减半，可能是由于电穿孔对细胞活力的负面影响所致。...

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

人急性单核细胞白血病（AML）THP-1 细胞系被广泛用作研究人单核细胞来源的巨噬细胞功能的模型，包括……

我的研究工作重点在于阐明使巨噬细胞对HIV（导致艾滋病大流行的病毒）感染产生抵抗作用的机制。特别是，我们关注一种名为HT-1的酶的作用，该酶可降解NTPs（病毒基因组的基本组成单位）。但这种酶还具有其他功能，我们正致力于阐明这些功能。我们建立了一种对THP1细胞进行基因工程改造的实验方案。这些细胞是研究人类巨噬细胞的成熟替代模型，例如可用于研究HIV-1的复制过程。这些细胞难以转染，从而难以操控其蛋白质含量。因此，我们建立了利用 CRISPR-Cas9 技术操控其基因组的方法，从单导向 RNA（sgRNA）的设计到多克隆和单克隆细胞群体的验证。本实验方案旨在实现对THP1细胞中目的基因的高效编辑，通过将预先组装的Cas9核酸酶与RNA形成的核糖核蛋白复合物电转染至细胞内。该方法中，Cas9的活性在时间上受到限制，从而降低使用慢病毒载体时常出现的脱靶效应风险。在此情况下，Cas9 的表达确实会延长作用时间，因此可能对细胞造成损伤。开始实验时，向 24 孔培养板的每孔中加入 500 µL 不含抗生素的 RPMI 1640 培养基，该培养基需补充 20% 经热灭活并过滤的 FBS。将培养板置于湿润培养箱中孵育过夜。将干燥的单链向导RNA（sgRNA）重悬，配制成终浓度为100微摩尔（µM）的溶液，需按每1纳摩尔（nmol）sgRNA加入10微升（µL）TE缓冲液。涡旋混匀30秒，于4摄氏度（°C）孵育过夜，以确保完全重悬。次日，为配制30微摩尔（µM）的工作浓度sgRNA溶液，首先用移液器轻轻混匀100微摩尔（µM）的储存液，然后用无核酸酶水稀释储存液。涡旋混匀溶液30秒，在室温下孵育5分钟。取三种30 µM sgRNA工作溶液各1 µL，以及20 µM Cas9溶液0.5 µL，加入3.5 µL重悬缓冲液R中稀释，以1:9的摩尔比组装Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物。短暂涡旋混匀，于室温孵育5分钟。制备未编辑的对照组时，向6.5微升重悬缓冲液R中加入0.5微升20微摩尔的Cas9溶液，短暂涡旋混匀，在室温下孵育5分钟。向样品中加入5微升重悬缓冲液R，使每种电穿孔条件下的终体积达到12微升。在细胞计数后，收集相当于0.2×10⁶个THP-1细胞的体积，于20摄氏度下以336×g离心5分钟，用移液器吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升磷酸盐缓冲液（PBS）中。再次离心后，将细胞沉淀重悬于12微升核糖核蛋白溶液中。为建立电穿孔系统，将移液工作站置于生物安全柜内，在安全柜中放置一根电穿孔管，并向电穿孔管中加入3 mL电穿孔试剂盒中的缓冲液E。打开电穿孔仪，通过触摸屏设置电穿孔参数：电压为1,500伏特，持续时间为10毫秒。然后数到三。将电穿孔移液枪装上枪头，吸取10 µL核糖核蛋白THP-1溶液。将移液枪插入电穿孔管中，按下电穿孔仪屏幕上的启动按钮。等待“complete”消息出现后，将移液器从管中取出。将THP-1细胞转移至预热的24孔培养板的一个孔中，并轻轻混匀样品。将培养板放回加湿的培养箱中，静置培养细胞72小时，期间避免扰动。电穿孔并计数细胞后，将相当于0.1 × 10⁶个THP-1细胞的体积转移至1.5毫升离心管中。在20°C下以336 × g离心5分钟，吸除上清液，然后将沉淀重悬于500 µL PBS中。再次离心细胞，尽可能吸除上清液，注意勿扰动沉淀，随后迅速冷冻沉淀。基因组DNA提取时，用50微升DNA提取液重悬沉淀。充分匀浆后，将全部液体转移至0.2毫升PCR管中。涡旋振荡管内液体，然后短暂离心，离心时间为3秒。将离心管放入热循环仪中，于65摄氏度加热15分钟，随后在98摄氏度加热10分钟。接下来，用90微升超纯水稀释提取的DNA，涡旋混匀，并在5000G下短暂离心3秒。用超纯水将PCR引物稀释至终浓度为10微摩尔。在0.2毫升PCR管中配制PCR反应体系。将PCR管放入热循环仪中，并按照指定参数运行程序。针对新0.2毫升PCR管中的多克隆编辑细胞群体进行操作。取17.5微升PCR扩增产物与2微升E缓冲液2混合，终体积为19.5微升。充分涡旋混匀后短暂离心。作为替代方案，若需筛选单细胞克隆，可将编辑细胞与未编辑对照细胞的PCR产物按1:1比例混合。为形成异源双链，将反应管放入热循环仪中，并运行指定程序。异源双链形成后，向管中加入0.5微升T7内切酶1溶液，在37摄氏度孵育30分钟。为准备凝胶电泳样品，取5微升T7内切酶1消化产物或未消化的PCR产物，加入5微升水和2微升6×DNA上样缓冲液，混匀后将样品及分子量标记物加入凝胶孔中，在80伏电压下电泳运行45分钟。CRISPR Cas9介导的EGFP位点基因编辑导致GFP阳性细胞数量急剧下降，电穿孔后第7天减少幅度超过90%。电穿孔后第三天，由于电穿孔引起的应激反应，细胞数量减少了一半，但在完全RPMI培养基中培养至第七天时完全恢复。T7核酸内切酶1检测和琼脂糖凝胶电泳显示，经编辑的细胞中约有75个碱基对的片段缺失，证实了CRISPR对EGFP靶位点的成功编辑。

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学习使用CRISPR-Cas9电穿孔技术对THP-1细胞进行基因敲除和单细胞克隆分离的方法。该方案为研究巨噬细胞抗HIV机制及HT-1酶功能提供了可重复的实验流程。

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