THP-1 细胞中基于电穿孔的 CRISPR-Cas9 介导的基因敲除和单细胞克隆分离

我的研究活动侧重于了解使巨噬细胞对 HIV（导致艾滋病大流行的病毒）感染产生抵抗力的机制。我们特别关注称为 HT-1 的酶的活性，该酶降解 NTP，NTP 是病毒基因组的组成部分。但这种酶还有其他活性，我们试图阐明。

我们建立了对 THP1 细胞进行基因工程改造的方案。这些细胞是人类巨噬细胞研究的成熟替代物。例如，HIV-1 的复制。

这些细胞难以转染以纵其蛋白质含量。因此，我们建立了使用 CRISPR-Cas9 技术纵其基因组的方法。从 SG RNA 的设计到多克隆和单克隆细胞群的验证。

我们的方案旨在实现对 THP1 细胞中目标基因的高效编辑，该基因将使用由 Cas9 核酸酶能量 RNA 制成的预组装核糖核蛋白复合物进行电穿孔。在这种方法中，Cas9 活性在时间上受到限制。这降低了产生靶标效应的可能性，而这种效应是在使用 lenti 载体时经常出现的。

在这种情况下，Cas9 表达确实会延长时间，因此可能会对细胞造成损害。首先，用 500 微升不含抗生素的 RPMI 1640 培养基填充 24 孔培养板的每个孔，并补充有 20% 热灭活和过滤的 FBS。将板置于加湿的培养箱中过夜。

要将干燥的单向导或 sgRNA 再水化至终浓度为 100 微摩尔，请在每 1 纳摩尔 sgRNA 中加入 10 微升 TE 缓冲液。将溶液涡旋 30 秒，并在 4 摄氏度下孵育过夜，以确保完全再水化。第二天，为了制备 30 微摩尔的工作 sgRNA 溶液，首先用移液管短暂匀浆 100 微摩尔的 sgRNA 原液，然后在不含核酸酶的水中稀释茎。

将溶液涡旋 30 秒，并在室温下孵育 5 分钟。在 3.5 微升重悬缓冲液 R 中，将三种 30 微摩尔 sgRNA 的工作溶液和 0.5 微升 20 微摩尔 Cas9 溶液稀释 1 微升，以组装 Cas9 sgRNA 核糖核蛋白，增加 1 比 9 摩尔比。短暂涡旋并在室温下孵育 5 分钟。

要制备未经编辑的对照，请将 0.5 μL 20 μmol Cas9 溶液添加到 6.5 μL 重悬缓冲液 R.Vortex 中，并在室温下孵育 5 分钟，向样品中加入 5 μL 重悬缓冲液 R，以达到每个电穿孔条件下 12 μL 的最终体积。为了在细胞计数后制备 THP-1 细胞，收集相当于 6 个 THP-1 细胞的 0.2 乘以 10 次方的体积，并在 20 摄氏度下以 336G 离心 5 分钟，使用移液管吸出上清液，并将沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。再次离心并将细胞沉淀重悬于 12 μL 核糖核蛋白溶液中。

要设置电穿孔系统，请将移液器站放在生物安全柜下，并在柜内放置电穿孔管，将电穿孔试剂盒中的 3 毫升缓冲液 E 添加到电穿孔管中。打开电穿孔设备并使用触摸屏设置电穿孔参数，电压为 1， 500 伏。持续时间为 10 毫秒。

数字到三个。为电穿孔移液器配备吸头，吸出 10 微升核糖核蛋白 THP-1 溶液。将移液器插入电穿孔管，然后按电穿孔设备屏幕上的开始。

等待消息 complete 出现，然后从试管中取出移液器。将 THP-1 细胞转移到预热的 24 孔培养板的孔中，并轻轻匀浆样品。将板放回加湿培养箱中，让细胞静置 72 小时。

电穿孔和细胞计数后，将相当于 6 个 THP-1 细胞的 0.1 倍 10 倍的体积抽取到 1.5 毫升试管中。将细胞在 20 摄氏度下以 336G 离心 5 分钟，吸出上清液，然后将沉淀重悬于 500 μL PBS 中。再次离心细胞，在不干扰沉淀的情况下吸出尽可能多的上清液，然后卡住，冷冻沉淀。

对于基因组 DNA 的提取，用 50 μL DNA 提取溶液重悬沉淀。匀浆并将整个体积转移到 0.2 毫升 PCR 管中。涡旋试管并短暂离心 3 秒脉冲。

将试管放入热循环仪中，在 65 摄氏度下加热 15 分钟，然后在 98 摄氏度下加热 10 分钟。接下来，用 90 μL 超纯水稀释提取的 DNA，涡旋并以 5000G 短暂离心 3 秒。在超纯水中稀释 PCR 引物至终浓度为 10 μmol。

在 0.2 ml PCR 管中制备 PCR 混合物。将 PCR 管放入热循环仪中，并使用指定的设置运行程序。对于新的 0.2 mL 试管中的多克隆编辑群体。

将 17.5 μL PCR 扩增子与 2 μL E 缓冲液 2 混合，最终体积为 19.5 μL。涡旋溶液并短暂离心，或者，为了筛选单细胞克隆，将来自编辑和未编辑的对照细胞的 PCR 产物以一比一的比例混合。对于异质双链体形成，将试管放入热循环仪中并运行给定的程序。

异源双链体形成后，向试管中加入 0.5 μL T 7 核酸内切酶 1 溶液，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。为了制备用于凝胶电泳的样品，将 5 μL T7 核酸内切酶 1 消化产物或未消化的 PCR 产物与 5 μL 水和 2 μL 6 xDNA 上样染料混合，将样品和分子量标准加载到凝胶中，并在 80 伏电压下运行凝胶 45 分钟。CRISPR Cas9 介导的 EGFP 基因座基因编辑导致 GFP 阳性细胞急剧下降，到电穿孔后第 7 天减少 90% 以上。

到电穿孔后第 3 天，由于电穿孔诱导的应激，细胞数量减少了一半，但在完全 RPMI 培养基中到第 7 天完全恢复。T7 核酸内切酶和琼脂糖凝胶电泳显示编辑细胞中大约 75 个碱基对片段的丢失，证实了 EGFP 靶位点的 CRISPR 编辑。