Name: 模拟性别肯定激素疗法的大鼠模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 了解模拟性别肯定激素疗法的大鼠模型建立方法，通过皮下注射睾酮或雌二醇联合醋酸环丙孕酮，利用肝脏CPS作为性别特异性生物标志物评估疗效，为跨性别健康研究提供重要工具。

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本研究遵循欧盟指令2010/63/EU、意大利2014年3月4日第26号立法法令以及经济合作与发展组织（OECD）良好实验室规范（GLP）原则。研究方案已获意大利卫生部批准（授权编号：806/2021-PR）。实验选用16只性成熟的年轻Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半（雄性体重304 ± 13 g，雌性体重190 ± 7 g，年龄8–9周），每笼饲养2只，在标准实验室条件下饲养（温度22 ± 0.5 °C，相对湿度50%–60%，光照-黑暗周期12小时交替，每小时换气12–14次），自由饮水和进食 随意摄取在所有笼具中，为每只动物提供木制啃咬块以进行环境丰富化，并每周更换一次。
注意：选择8-9周龄的动物是因为性别肯定激素治疗（GAHT）可在青春期（Tanner分期2至3期）开始，这在啮齿类动物中相当于8-9周龄，且该治疗可能持续很长时间，甚至贯穿跨性别者的一生9。
1. 分组与动物护理
<ol>
	<li>使用8至9周龄的年轻成年雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠作为模型，因为大鼠是经合组织（OECD）推荐的首选物种（例如，指南421生殖/发育毒性筛选试验），也是OECD指南407（啮齿类动物重复给药28天口服毒性研究，已更新用于检测内分泌干扰物的参数）中提出并考虑的唯一啮齿类动物物种。</li>
	<li>使用 G*Power 软件进行组规模计算。针对 dFM 和 dMF 模型，均设置四个实验组：一个对照组（C）和三个接受不同剂量 GAHT 治疗的动物组。组规模计算基于治疗剂量组与对照组之间的两两比较，采用 Mann-Whitney 检验，双尾显著性水平 α = 0.0167（对应于对三种治疗剂量与对照组之间的三次比较应用 Bonferroni 校正后 α = 0.05），检验效能 1-β = 0.80。
	<ol>
		<li>计算得到的大鼠分组数量如下： 
		对于dFM模型，每组动物数量n=4，依据Kinnear等人的方法。18 表明经过2周治疗后，以下&#160;对照组：0.2 ± 0.3 ng/mL，激素治疗组：16 ± 5 ng/mL（均值 ± 标准差），对应Cohen's d = 4.46，表示效应量极大。 
		&#8203;dMF模型：每组动物数n=3，依据Gómez等人的方法19 表明经过2周治疗后，以下情况出现&#160;水平：对照组为1.901 ± 0.413 ng/mL，激素治疗组为0.043 ± 0.023 ng/mL（均值 ± 标准误），对应Cohen's d = 6.35的效应量（效应极大）。</li>
		<li>为使两个模型对齐，每性别/组选择 n=4 只动物，总共 N = 32 只动物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经过1周的适应期后，按性别将大鼠分为两个实验组（dMF和dFM，每组4只），每组包含一个对照组（对照雄性，CM；对照雌性，CF）和三个选定的性别肯定激素治疗（GAHT）处理组。</li>
	<li>每天监测大鼠2次（上午8:30和下午4:00），以检查其总体健康状况及因GAHT给药可能引发的攻击性行为。每周测量2次体重（bw）和饲料消耗量，使用具备动态称重功能的分析天平，该功能适用于实验动物体重测定。 
	注意：为评估潜在攻击性，负责动物福利的兽医每天检查大鼠两次（上午和下午晚些时候）。</li>
	<li>在dFM实验模型中，测量阴蒂直径&#160;所有大鼠在治疗开始前即刻（第0点）和治疗结束时（第13点）使用数字测量仪进行精确测量。</li>
	<li>在处死前称量所有动物的体重，并在dMF模型中，处死后立即取出附睾以进行精子计数。</li>
</ol>
2. 剂量选择与制备
<ol>
	<li>对dFM大鼠使用以下三种激素剂量：每周5、10.5和22.5 mg/kg，&#160;对于dMF模型，使用以下三种选定的剂量水平（DL）：DL1 E2 0.045 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg，DL2 E2 0.09 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg，以及DL3 E2 0.18 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg。 
	注意：所有剂量的选择均基于跨性别者临床治疗中主要的人类临床指南15，并参考了文献中有限的可用数据。</li>
	<li>每周在化学安全通风橱中配制所有储备溶液。将所有物质正确混合至芝麻油中作为溶媒，确保其完全溶解。 
	注意：对于两种模型，均使用剂量换算计算器（https://dosecal.cftri.res.in/），输入待换算的剂量、设定剂量对应的物种、实验动物物种以及需换算剂量的体重。对于dFM模型（表3），参照人类激素治疗方案，每周最大睾酮（T）剂量为100 mg20。换算至大鼠的剂量为每周10.5 mg/kg T。第二个剂量为大鼠每周22.5 mg/kg18。第三个剂量为每周5 mg/kg，该剂量通过保持两个计算剂量之间2.1倍的比例确定。对于dMF模型，参见表4，剂量方案基于人类推荐治疗方案21以及来自体内（in vivo）研究的可用数据14,19,22。</li>
</ol>
3. 动物处理
<ol>
	<li>通过捏起并提起注射部位的皮肤形成类似帘状结构，进行皮下注射T&#160;（用于dFM模型）和E2&#160;联合CPA&#160;（用于dMF模型）。然后将1 mL注射器的针头平行于动物背部刺入皮下。进入后，缓慢注入所需体积（T为100 µL；E2+CPA为200 µL）23。
	<ol>
		<li>动物处理方式如下：对于dFM模型，每周两次皮下注射溶于芝麻油（溶剂）中的T&#160;庚酸酯，持续2周（每次T皮下注射100 µL）。对于dMF模型，每周五次皮下注射溶于芝麻油（溶剂）中的E2联合醋酸CPA，持续2周（每次注射200 µL）。对照组（C组）大鼠仅给予等量溶剂（芝麻油），处理方式相同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 血液采样、处死与组织采样
<ol>
	<li>经过2周的处理后，在处死动物前，使用气态麻醉系统对所有动物进行麻醉。在透明的聚苯乙烯诱导室中，以1.5 L/min的流速，通过2%至3.5%异氟烷与100%氧气混合气体诱导麻醉，直至动物反射消失。将大鼠仰卧位放置于加热垫上，并在整个经心采血过程中，通过标准大鼠鼻罩维持1.5%至3.5%的异氟烷浓度作为维持剂量。</li>
	<li>准备一支装有21G针头的5 mL注射器，并消除其内部真空。通过手指探查心脏位置，将针头垂直刺入大鼠侧胸壁，进针点约位于肘部弯曲处水平，介于第5和第6肋骨之间。当针头进入心室后，血液会因毛细作用进入注射器。缓慢且持续地回拉注射器活塞，直至血液被抽出。</li>
	<li>采血完成后，将大鼠放入CO2安乐死舱内，以每分钟置换舱体容积30%-70%的速率通入CO2，实施窒息安乐死。2-3分钟后，通过监测呼吸和心跳确认动物死亡24。</li>
	<li>处死后，将每只动物仰卧置于解剖台上，前肢朝上，后肢朝下，并用固定针固定。在动物腹侧表面喷洒消毒液。</li>
	<li>切除以下器官：睾丸、附睾、子宫、卵巢、肝脏和甲状腺。称重后，将这些器官分别置于含35 mL 10%缓冲福尔马林（所有器官）或布因氏液（仅睾丸）的50 mL管中；或分别放入冻存管（每管一个器官），立即在液氮中冷冻，随后于-80 °C保存。
	<ol>
		<li>首先，用剪刀沿中线从耻骨向上腹部方向剪开皮肤。从腹中线切口处沿两侧后肢内侧表面各作一横向切口，暴露腹腔脏器&#160;。</li>
		<li>首先取出生殖器官；在雄性大鼠中，取出位于腹腔内阴囊鞘内的成对卵圆形睾丸。剪开并轻压阴囊鞘，使睾丸充分暴露，然后轻轻夹取。用镊子夹住周围脂肪组织，将睾丸从脏器中分离。切除后，称重并将睾丸置于布因氏液中，用于组织病理学分析。</li>
		<li>在雌性大鼠中，先轻柔夹取子宫，然后从内脏脂肪组织中剪下位于两侧子宫角末端的卵巢。切除后，称重卵巢。</li>
		<li>在雌性和雄性大鼠中，接着转向腹腔右侧，此处为肝脏所在位置。肝脏为多叶状器官，可辨识多个部分：左内叶（较小）、左外叶（主要）、右内叶（较小）、右外叶（主要）、尾状叶和方叶25。用镊子夹住肝脏，注意避免破损。用镊子夹住剑突，用剪刀完全剪断膈肌。</li>
		<li>用镊子提起剑突，将肝脏从腹腔中取出。用剪刀将肝脏与膈肌分离。随后称重肝脏并妥善保存。</li>
		<li>进行甲状腺摘取时，使用剪刀沿动物颈部垂直剪开，去除皮肤和肌肉组织，小心修剪气管末端，甲状腺即位于气管周围。取出后保存甲状腺以供后续分析26。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤进行精子计数。
	<ol>
		<li>切除睾丸后，取出附着于相应睾丸后缘并包埋于阴囊内的附睾。</li>
		<li>本实验中，精液样本取自右侧附睾尾部。采集时，用剪刀清除附睾尾部的脂肪和结缔组织，将其与其余部分分离后放入含有1 mL DMEM的培养皿（35 mm × 10 mm）中。用剪刀剪碎，并用巴斯德移液管吹打，以促进内容物释放。</li>
		<li>将所得全部液体转移至15 mL离心管中，用DMEM补足至10 mL（稀释倍数1:10=0.1）。吹打混匀，制成悬浮液。轻微震荡后，取10 µL悬浮液加入血细胞计数板。加样后静置3分钟，开始计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 酶联免疫吸附测定（ELISA）实验
<ol>
	<li>在2 mL离心管中采集血液样本（每只动物约2-5 mL），室温静置1小时使其凝固。将所有血液样本在4 °C条件下以3000 × g离心15分钟，重复两次。</li>
	<li>离心后的血液呈多层结构，分为三种不同颜色的层次。最上层为血浆（通常呈黄色或透明），是血液的液体部分；血浆下方的一层可能呈白色或灰色，为白细胞层（Buffy coat）；最底层含有红细胞，颜色可能为深红色或鲜红色。为测定性激素水平，使用移液器收集所有样本的血清（避免接触白细胞层或红细胞层），分装成500 µL的等分试样，并于-80 °C保存。</li>
	<li>在两种模型中均采用ELISA法检测和/或定量样本中蛋白质、抗体或抗原的存在，以测定性激素水平。采用直接法，并依照各ELISA试剂盒的说明书操作。本研究中检测了大鼠血清中以下激素的水平：E2（大鼠雌二醇ELISA）、T（小鼠/大鼠睾酮ELISA）、TSH（大鼠ELISA试剂盒）和T4（大鼠ELISA试剂盒）。</li>
</ol>
6. 组织病理学分析
<ol>
	<li>按照以下步骤制备组织学切片。</li>
	<li>在取出子宫、卵巢、甲状腺和肝脏样本时，立即用10%缓冲福尔马林固定至少48小时。 
	警告：在化学通风橱中操作。避免吸入该物质/混合物。避免产生蒸气/气溶胶。</li>
	<li>将样本在流动水中冲洗1小时，然后保存于80%乙醇（C2H5OH）中直至处理，以防止细胞死亡引起的原生质结构改变。</li>
	<li>用Bouin溶液固定睾丸，该溶液由15 mL饱和苦味酸溶液、5 mL浓福尔马林（33%-40%）和1 mL冰醋酸组成，固定48小时。用80%乙醇冲洗样本。 
	警告：在化学通风橱中操作。</li>
	<li>使用自动组织处理机进行石蜡包埋。包埋过程结束后，将样本置于已倒入熔化石蜡的小金属容器中，并在冷冻板上冷却，形成切片用蜡块。根据所需的切面方向进行定位。</li>
	<li>随后使用旋转式切片机对样本进行切片。用小毛刷收集5–6 µm厚的切片，在37 °C水中展平数秒后，将其贴附于载玻片上。将载玻片垂直放置数分钟以沥干，并在36 °C烘箱中干燥至少1小时。</li>
	<li>按以下方法进行苏木精-伊红染色。
	<ol>
		<li>将切片浸入萜烯类透明剂（二甲苯替代品）中5分钟，以脱蜡。</li>
		<li>依次将切片浸入下列梯度乙醇溶液中进行再水化。每种溶液浸泡2分钟：100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、50%乙醇和蒸馏水。 
		注意：此处可作为实验流程的暂停点，切片可在室温水中放置数小时。也可选择将切片在4 °C水中保存。</li>
		<li>将切片放入Mayer苏木精染液中染色5分钟。立即转移回盛有自来水的容器中，继续浸泡5分钟。将自来水缓慢注入容器远离组织切片的对角角落。定期更换容器中的水，直至水中不再出现紫色染料。 
		注意：为防止切片从载玻片上脱落，切勿将水流直接冲向切片。</li>
		<li>将切片浸入1%伊红Y水溶液中染色2分钟。转移至蒸馏水中15秒。随后依次将切片浸入下列梯度乙醇溶液中进行脱水。每种溶液浸泡15秒：50%乙醇、80%乙醇、95%乙醇。</li>
		<li>将切片浸入100%乙醇中1分钟，更换为新鲜100%乙醇再浸1分钟。将切片浸入萜烯类透明剂（二甲苯替代品）中2分钟，再更换为新鲜萜烯类透明剂（二甲苯替代品）继续浸2分钟。每次取出一张切片，加盖盖玻片。</li>
		<li>在组织切片上滴加封片介质，并将盖玻片从载玻片底部加盖。 
		注意：确保封片介质使盖玻片自然贴合到位。若盖玻片不平整，可轻轻敲击使其平整。用纸巾吸除多余的封片介质。</li>
		<li>将擦拭布浸入萜烯类透明剂（二甲苯替代品）中，擦拭载玻片背面以去除滴落的介质。将载玻片平放在可移动的固体表面（如硬纸板）上。按照步骤6.7.6的方法为其余所有切片加盖盖玻片。在通风橱内室温下静置，使切片干燥并让封片介质完全硬化。 
		警告：在化学通风橱中操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色完成后，用盖玻片封片，并使用光学显微镜进行观察。组织病理学改变根据其分布、严重程度和形态学特征进行描述。</li>
	<li>采用半定量方法进行损伤评分，使用5分制评估量表（0至4分），依据Shackelford等人27提出并总结的标准，具体如下： 
	0级：无改变 
	1级：轻微改变。组织中仅能勉强观察到效应，范围小且罕见。受影响组织区域小于或等于10%。 
	2级：轻度改变。表现为较小的组织学改变。当组织或其结构的受累范围在11%至20%之间时使用此等级。 
	3级：中度改变。组织中改变明显。该等级表示组织或其结构的受累范围在21%至40%之间。 
	&#8203;4级：显著改变。组织或其结构发生广泛的组织学改变。受累范围达41%至100%。</li>
	<li>对子宫、卵巢、睾丸和甲状腺进行定量组织形态计量学分析。使用应用于光学显微镜的图像分析系统观察组织切片，并按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>子宫：使用2倍物镜测量右侧子宫角每个横切面的总面积、外层和内层肌层以及子宫腔的面积。计算子宫内膜和肌层的面积，以及子宫内膜与肌层面积的比值28。</li>
		<li>卵巢：选取位于卵巢中央位置的一个完整切面，以显示处于不同发育阶段的卵泡；使用4倍物镜计数初级卵泡、次级卵泡、黄体、格拉夫卵泡和闭锁卵泡。根据Fortune29的方法对卵泡进行分类。此外，测量每个样本的卵巢面积及其卵泡密度（卵泡数/卵巢面积 × 100）30。</li>
		<li>睾丸：使用10倍物镜测量每个样本中的20个曲细精管；同时测量总管腔面积、总面积、纵向直径和横向直径28。</li>
		<li>甲状腺：测量以下参数：卵泡密度（在特定面积内卵泡数量的比值，使用10倍物镜）；间接滤泡上皮细胞高度（在五个随机选择的滤泡中，滤泡面积与胶质面积的平均比值，使用40倍物镜）；滤泡上皮面积与细胞核数量的平均比值（在同一滤泡中评估滤泡成熟度）；滤泡上皮细胞高度（在五个随机选择的滤泡中，每个滤泡测量五个细胞高度的平均值，使用64倍物镜）31。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 基因表达
<ol>
	<li>对于两种模型，均使用保存在 -80 °C 的肝组织样本进行基因表达分析。按照试剂盒说明书，从动物组织裂解液开始，进行总 RNA 的纯化。
	<ol>
		<li>为获得肝组织裂解液，先用组织研磨器研磨组织样本（10 mg），加入 600 µL 裂解缓冲液（RL BUFFER，试剂盒提供），继续研磨直至样本完全均质化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取后立即使用荧光分光光度计对获得的 RNA 进行定量，并评估其质量（是否存在降解或蛋白质残留）。在 260 nm 和 280 nm 波长下进行分光光度吸光度测定，分别对应核酸和蛋白质的吸收峰。</li>
	<li>在测定总 RNA 浓度后，根据 cDNA 合成试剂盒的说明书，将每份样本中含 1 µg 总 RNA 的适当体积反转录为 cDNA。</li>
	<li>通过 RT-PCR 分析所获得的 cDNA。
	<ol>
		<li>为分析目的基因的表达，针对每个目标基因以及组成型表达的参考基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）设计特异性正向和反向引物。使用在线工具 Primer-BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）筛选最佳引物，确保其仅特异性结合目标基因，并由商业供应商合成寡核苷酸。所用引物对的序列见&#160;表5。</li>
		<li>用无 RNA 酶的去离子水将冻干引物重悬，配制成终浓度为 100 mM 的储存液。使用专用试剂盒进行 qPCR 分析。反应体系终体积为 20 µL，将已退火的 cDNA 按 1:40 稀释后使用。每个样本设两个复孔，加入 96 孔 PCR 板中。</li>
		<li>在实时荧光定量 PCR 仪上按照以下程序运行 qPCR：95 °C 预变性 10 min；随后 40 个循环：95 °C 变性 15 s，58 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min。反应结束后进行熔解曲线分析，温度从 55 °C 升至 95 °C（每 1 °C 升温保持 30 s），以验证扩增产物的特异性。使用仪器配套软件获取各样本的阈值循环数（Cycle Threshold, Ct）。根据 Pfaffl 公式32，以 ΔΔCt（delta delta Ct）法表示结果： 
		ΔCt 目标基因 = Ct 对照组 - Ct 处理组 
		ΔCt 参考基因 = Ct 对照组 - Ct 处理组 
		ΔCt = ΔCt 目标基因 - ΔCt 参考基因</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>使用电子表格进行数据管理。使用统计分析软件进行数据分析。使用特定软件设计图表。</li>
	<li>将体重增加、饲料消耗量、绝对和相对器官重量、血清激素水平、组织形态计量数据以及基因表达数据表示为均值 ± 标准差。采用非参数Kruskal-Wallis检验进行分析，随后进行事后两两比较（Mann-Whitney检验）。</li>
	<li>采用双向Fisher精确检验分析组织学数据，以识别与对照组之间的显著差异，包括归入某一类别的样本（不涉及严重程度分级的总体发现发生率）。使用Cochran-Armitage趋势检验识别剂量-反应趋势。当p值 &#60; 0.05时，认为组间差异具有统计学意义。</li>
</ol>

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作者声明，本研究的开展不存在任何可能产生利益冲突的商业或财务关系。

建立模拟性别肯定激素治疗（GAHT）的啮齿类动物模型，对于研究跨性别者可能存在的特异性易感性和脆弱性，以及通常持续其一生的长期治疗结局至关重要。
由于文献中类似研究数量有限，本实验的关键在于选择建立模型所用的剂量；这些剂量应足够低，以确保在动物中长期给药时不会引起不良反应、毒性或死亡。另一个关键点是选择最佳给药途径，同时需考虑人类临床实践中常用的给药方式。事实上，在dFM模型中，睾酮（T）的给药途径遵循跨性别男性中的临床实践15；而在dMF模型中，给药途径却与跨性别女性的临床实践不一致15。因此，仍需进一步实验以建立更为可靠的方法。这两个大鼠模型旨在尽可能模拟人类治疗方案，可提供关于两种性别肯定激素治疗（GAHT）对包括生殖功能、甲状腺稳态&#160;和肝脏代谢在内的多种身体功能影响的关键数据，部分填补了现有研究空白。
可采用多种额外措施来改进这两个模型，使其更加稳健并更易于向人类转化。例如，可通过植入可释放E2的聚合物储库进行皮下...

个体在心理上对自身为男性、女性、非男非女、兼具两性或介于两者之间的感知1 称为性别认同。它可能与生理性别一致（顺性别），也可能不一致（跨性别 - TG）。跨性别男性指出生时为女性但自我认同为男性的个体；跨性别女性指出生时为男性但自我认同为女性的游戏副本2据估计，目前全球有2500万跨性别者3，其中大多数患有性别不安，这是一种心理状况，表现为个体的性别认同与其出生时被指定的性别之间存在不一致4，这可能导致社会歧视以及在社交中遇到困难&#160;工作和家庭中的压力，常导致抑郁、焦虑和应激5因此，跨性别者通常会接受性别肯定激素治疗（GAHT）和/或性别肯定手术。跨性别男性的GAHT以睾酮（T）给药为特征。表1），对于跨性别女性，则使用雌激素（E2）联合抗雄激素（表2)6.
性别肯定激素治疗通常持续个体一生，持续作用于内分泌系统7,8因此，分析性别肯定激素治疗（GAHT）对跨性别者健康的影響及其潜在的长期效应非常重要。此外，跨性别者与一般人群一样，会暴露于化学污染物——特别是内分泌干扰物（ED）——之中&#160;以性别肯定激素治疗（GAHT）的方式作用于内分泌系统，导致过度刺激9.
勃起功能障碍（ED）是指&#160;一类通过干扰生物体内天然激素的分泌、活化、合成、释放及结合等不同激素与代谢过程，从而影响生物体自身和/或其后代的化学物质。由于内分泌干扰物（ED&#160;在环境、食品和日常用品（如塑料瓶和容器、金属食品罐内衬、洗涤剂、阻燃剂、食品、玩具、化妆品和农药等）中广泛存在，人群在一生中会持续暴露于这些物质10此外，即使低剂量暴露于内分泌干扰物（EDs）也可能导致组织和器官损伤，且在实验动物和人类中，暴露于内分泌干扰物常出现性别特异性效应。11以食品接触材料的暴露为例，&#160;双酚A（BPA）因其雌激素效应，与女性子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征以及生育力下降等健康风险相关12在男性中，BPA 可降低&#160;水平并降低精子质量13此外，农药还与女性乳腺癌风险升高以及男性显著的生育问题相关。13目前尚无特异性工具可用于研究环境污染物（包括内分泌干扰物）对跨性别者（TG）的毒理学影响。9.
本研究旨在描述两种转基因动物模型的建立方法及所选参数：去雄化-雌性化模型（dMF）和去雌化-雄性化模型（dFM）。具体而言，根据当前人类治疗方案，评估了激素给药的合适剂量水平、时间和给药途径14。此外，鉴定并表征了可明确界定这两种模型的组织和功能生物标志物。同时，详细描述了治疗在动物中的有效性和耐受性、长期研究中最适宜标志物的选择，以及用于上述目的的相关技术。
为了对模型进行表征，分析以下终点指标：睾酮（T）血清水平（在两种模型中评估性别肯定激素治疗（GAHT）成功与否的最佳生物标志物9,15）；雌二醇（E2）血清水平（两种模型）；促甲状腺激素（TSH）和甲状腺素（T4）（dMF模型）；精子计数（dMF模型）；阴蒂尺寸（dFM模型）；生殖器官、肝脏和甲状腺的组织病理学分析（两种模型）。此外，还分析以下性别特异性肝脏细胞色素P450同工酶（CYP450s，两种模型）的基因表达16,17：CYP2C11（特异性表达于雄性肝脏）、CYP3A18（在雄性肝脏中的表达量是雌性的25倍）、CYP2C12（特异性表达于雌性肝脏）以及CYP2C6（主要在雌性肝脏中表达，但在雄性中也有较低水平的表达）。

<table><tbody><tr><td>分析天平 ABJ 320-4NM</td><td>Kern</td><td>Z741091</td><td></td></tr><tr><td>Bouin 氏液</td><td>Biooptica</td><td>05-M01008</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>适用于 eppendorf</td></tr><tr><td>醋酸环丙孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3412</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM 培养基</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExcelTaq 2X 快速 q-PCR 预混液（SYBR，ROX），200 次反应</td><td>Smobio&amp;nbsp;</td><td>TQ1210</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件版本 5.0&amp;nbsp;（Windows 版）</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Biooptica</td><td>05-06002/L</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Biooptica</td><td>05-10007/L</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIS-BR</td></tr><tr><td>JMP 10 统计分析软件</td><td>SAS Institute&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机 Microm</td><td>Thermo Scientific</td><td>HM 325</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Microphot FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠/大鼠睾酮 ELISA 试剂盒</td><td>Biovendor</td><td>RTC001R</td><td>96T</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>ND-1000</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Biooptica</td><td>087910</td><td></td></tr><tr><td>便携式天平 SCOUT STX2202</td><td>OHAUS</td><td>&lt;br/&gt; 30253064</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>由 PrimerBlast 设计</td></tr><tr><td>大鼠雌二醇 ELISA 试剂盒</td><td>Biovendor</td><td>RTC009R</td><td>96T</td></tr><tr><td>大鼠促甲状腺激素（TSH）ELISA 试剂盒</td><td>ELK Biotechnology</td><td>ELK2283</td><td>96T</td></tr><tr><td>大鼠促甲状腺激素（TSH）ELISA 试剂盒</td><td>ELK Biotechnology</td><td>ELK2283</td><td>96T</td></tr><tr><td>SensiFAST cDNA 合成试剂盒</td><td>Bioline</td><td>BIO-65053</td><td>50 次反应</td></tr><tr><td>芝麻油</td><td>ACROS</td><td>AC241000010</td><td></td></tr><tr><td>雄性和雌性 Sprague Dawley 大鼠&amp;nbsp;</td><td>Envigo</td><td></td><td>8/9&amp;nbsp;周龄</td></tr><tr><td>标准饲料</td><td>Mucedola</td><td>4RF18</td><td></td></tr><tr><td>甲状腺素（T4）ELISA 试剂盒</td><td>ELK Biotechnology</td><td>ELK8716</td><td>96T</td></tr><tr><td>十一酸睾酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3006</td><td></td></tr><tr><td>荧光定量 PCR 仪 LineGene 9600 Plus Bioer</td><td>Aurogene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织处理仪</td><td>Shandon Excelsior ES, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>总 RNA 提取试剂盒</td><td>Norgen</td><td>17200</td><td>50 柱</td></tr><tr><td>Victor 3 多功能酶标仪&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-雌二醇-17-戊酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1631</td><td></td></tr></tbody></table>

建立模拟性别确认激素治疗的大鼠模型

Establishment of Rat Models Mimicking Gender-affirming Hormone Therapies

跨性别（TG）人群是指性别认同与出生时被指定的生理性别不一致的个体。他们通常会接受性别肯定激素治疗（GAHT），这是一种医学干预手段，可使其获得更符合自身性别认同的第二性征，并在改善多种社会心理变量方面表现出稳定效果。然而，GAHT作用于多个身体系统，已记录到一些副作用，但其全面识别与特征描述尚不充分。因此，在风险评估框架下，接受GAHT的跨性别者可被视为易感人群亚群，应予以特别关注，例如通过使用针对性的动物模型进行研究。本研究描述了建立两种模拟GAHT的大鼠模型的操作流程：去雄化-女性化模型（dMF），用于模拟跨性别女性的GAHT；去雌化-男性化模型（dFM），用于模拟跨性别男性的GAHT。这些模型已&#160;通过与人类性别肯定激素治疗（GAHT）相同的给药途径，为期两周给予相同激素：对dMF个体给予β-雌二醇联合醋酸环丙孕酮，对dFM个体给予睾酮。治疗期间每日观察大鼠健康状况及潜在攻击性行为。处死时采集血液和靶组织样本并保存，用于生化、分子及组织病理学分析。同时评估性别特异性参数，如精子计数和阴蒂尺寸。此外，鉴定并表征大鼠肝脏中特有或优势表达的CYP450同工酶，作为验证GAHT效果及建立模型的新生物标志物。甲状腺作为内分泌系统的关键靶器官，其受累情况亦被探讨。

如 Tassinari 等人14 和 Tammaro 等人33 所证明，以下结果展示了性别肯定激素治疗（GAHT）在大鼠中的成功应用以及模型的适用性。
未记录到死亡或异常行为（如攻击性），也未观察到任何毒性或痛苦的临床症状（如活动减少、毛发竖立和外观凌乱）14.
成年雄性大鼠以及处于动情期和动情前期的雌性大鼠血浆睾酮（T）浓度分别为 5.71 ± 0.84 ng/ml、1.24 ± 0.29 ng/ml 和 0.80 ± 0.36 ng/ml34。性腺完整的雄性大鼠循环睾酮（T）平均水平为 3.5 ± 0.5 ng/mL35。两种模型中对照组大鼠测得的睾酮（T）和雌二醇（E2）水平均处于文献报道的生理范围之内33。雌性大鼠雌二醇（E2）的生理范...

本方案描述了通过皮下注射睾酮或雌二醇联合醋酸环丙孕酮（用于跨性别者的性别肯定激素治疗）建立两种啮齿类动物模型的方法：剂量设定、相关生物标志物的确定以及治疗效果的评估。

跨性别（TG）人群是指性别认同与出生时被指定的性别不一致的个体。他们通常会接受性别肯定激素治疗……

我们的研究建立了动物模型，以模拟跨性别个体的性别肯定激素治疗，即对跨性别男性使用睾酮，对跨性别女性使用雌激素联合抗雄激素治疗。我们正在探究接受此类治疗的个体对环境化学物质的易感性是否与一般人群相当，以及激素治疗是否存在长期副作用。该模型在其领域内具有独特性，因为目前尚缺乏可用于评估接受激素治疗的跨性别人群对化学物质潜在差异性易感性及其副作用的数据和工具。我们研究中的一个重要发现是利用性别特异性的肝脏CPS作为评估激素治疗效果的标志物。这一方法在本研究中首次建立，为验证模型的准确性和有效性提供了一个有价值的工具。本方案旨在解决当前对激素治疗长期效应认知不足的问题。同时，本研究还探讨日常接触的食物和环境化学物质是否会随着时间的推移与激素治疗产生相互作用或改变其治疗效果。未来，我们将探索该模型是否适用于长期测试，并将研究其他生物标志物，例如精细的行为学检测，以更准确地评估治疗效果。[指导教师] 首先捏起并提起注射部位的皮肤，以注射溶解于芝麻油中的睾酮，或雌二醇联合醋酸环丙孕酮。将1毫升注射器的针头平行于动物背部刺入。当针头进入体内后，根据实验模型，缓慢注入100微升睾酮或200微升雌二醇联合醋酸环丙孕酮。给药两周后，将每只麻醉的大鼠仰卧置于加热垫上。接着，准备一支5毫升注射器，安装21号针头，并确保排尽其中的空气。用手指定位心脏位置。轻轻清洁胸壁，将针头垂直于身体，在屈曲肘部对齐的位置、第五与第六肋骨之间，小心刺入侧胸壁。当针头到达心室时，血液将通过毛细作用进入注射器。缓慢且持续地回抽注射器活塞，直至血液被抽出。处死后，将每只动物仰卧放置于解剖台上，前肢朝上，后肢朝下。用大头针固定四肢，然后在动物腹侧表面喷洒消毒液，以备解剖。使用剪刀从耻骨沿中线向上腹部剪开。从腹中线切口处，沿两侧后肢内侧表面各作一横向切口，暴露腹腔脏器。在雄性大鼠中，切除位于腹腔内阴囊鞘膜内的睾丸。按压阴囊鞘膜以确保睾丸突出，然后轻柔抓取。使用镊子夹住脏器脂肪，再小心将睾丸从脏器组织上剪下。在将睾丸储存于Bois溶液进行组织病理学分析前，称量其重量。在雌性大鼠中，轻柔抓取子宫。在两侧子宫角末端识别卵巢，并将其从周围内脏脂肪组织中剪离。切除后称量卵巢重量。接着，用镊子夹住肝脏，确保其不破裂。用镊子夹住剑突，用剪刀完全剪断膈肌。用剪刀将肝脏与膈肌分离。用镊子提起剑突，将肝脏从腹腔中取出。切除后称量肝脏重量，并妥善保存。使用剪刀沿动物颈部垂直剪开。去除皮肤和肌肉组织，暴露气管，甲状腺即位于此处。轻柔修剪气管两端，以分离甲状腺。切除睾丸后，抓取附着于睾丸后缘并包埋于阴囊内的附睾。为采集精液，使用剪刀去除右侧附睾尾部的脂肪和结缔组织，进行清洁。将附睾尾部分离出来，放入含有1毫升DMEM的培养皿中。用剪刀剪碎附睾尾部，使用移液枪轻轻吹打内容物，促进精子释放。随后，将收集的液体转移至15毫升离心管中，并用DMEM定容至10毫升，使稀释倍数达到1:10。吹打混匀，制成悬浮液。轻柔振荡后，取10微升悬浮液加入血细胞计数板（Neubauer计数室）中进行计数。

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生物学

模拟性别肯定激素疗法的大鼠模型的建立

本文演示了在大鼠和小鼠中进行卵巢切除术，以及通过硅胶胶囊和口服 Nutella 补充...

卵巢切除术与17β-雌二醇替代在大鼠和小鼠中的可视化演示

雌激素等性腺激素在多种实验范式中调节记忆形成，包括恐惧消退记忆。本方案描述了一组用于研究性腺激素在自然动情周期雌性动物消退过程中特异性作用的方法，包括动情周期监测和外源性雌激素给药。...

研究自然动情周期雌性大鼠条件性恐惧消退的实验方案

许多治疗方法和基因突变会影响性成熟和生育能力的时间。本方案描述了一种非侵入性方法，用于在性成熟动物中开展生育力研究之前，评估小鼠和大鼠的青春期起始时间。...

通过确认小鼠和大鼠青春期启动及进行生育力检测来评估生殖能力

我们描述了一种具有多囊卵巢综合征样特征的精瘦型小鼠模型的建立过程 二氢睾酮缓释颗粒用于研究多囊卵巢综合征的病理生理学及其子代特征...

一种用于研究多囊卵巢综合征的高雄激素小鼠模型

该冲突模型用于评估暴露于成瘾性药物或其他可能影响抑制控制能力的因素后，抑制控制功能的损害情况。实验中同时呈现性刺激和厌恶障碍物，雄性大鼠必须克服障碍物才能接近性奖励。...

雄性大鼠奖赏寻求行为的冲突模型

临床上，绝经期女性雌激素缺乏可能加剧脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生。我们通过双侧背部外侧切口行双侧卵巢切除术，在apoE-/-小鼠中建立了体内雌激素缺乏模型。该小鼠模型可用于筛选绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。...

一种用于筛选绝经后心血管功能障碍外源性雌激素治疗的体内雌激素缺乏小鼠模型

本文旨在提供一种利用将病毒悬液多次注射到受精卵的卵周隙中，从而在大鼠胚胎中进行慢病毒转基因的技术方法。通过将雌性大鼠与具有不同显性毛色的可育雄性品系交配，以获得假孕的代孕母鼠。...

利用慢病毒载体方法制备转基因大鼠

许多子宫内膜异位症的啮齿类动物模型受限于技术复杂性、可重复性差，和/或需要使用免疫缺陷动物或特殊报告基因小鼠。我们提出了一种简化的病灶诱导系统，该系统可应用于任何实验小鼠，具有独立可验证的客观评分系统，且无需进行卵巢切除术或存活手术。...

使用自然动情周期小鼠建立同系小鼠子宫内膜异位症模型

本研究详细阐述了涉及雌性大鼠的实验设计中需要考虑的关键因素。从更广泛的意义上讲，这些数据有助于减少偏见，并推动开发更具包容性的诊断和干预工具。...

利用阴道灌洗法监测啮齿类动物动情周期：并不存在所谓的正常周期

本文描述了一种快速、稳定地对啮齿类动物进行睾丸切除术和卵巢切除术以维持其存活的方法。...

小鼠睾丸切除术和卵巢切除术以降低性激素产生

本研究提供了一种可重复且标准化的方法，用于建立表现为单纯性肥胖（通常伴有脂肪性胰腺）的肥胖大鼠模型。同时包括胰腺组织取样和免疫组织化学的详细实验方案。...

建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法学开发与验证

了解模拟性别肯定激素疗法的大鼠模型建立方法，通过皮下注射睾酮或雌二醇联合醋酸环丙孕酮，利用肝脏CPS作为性别特异性生物标志物评估疗效，为跨性别健康研究提供重要工具。

建立模拟性别确认激素治疗的大鼠模型

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