一种快速、简单的外部成虫定量工作流程 黑腹果蝇 结构

我们的实验室致力于研究细胞内pH动态如何调节细胞行为。我们关注那些与癌症进展相关的行为，因为已知大多数癌症中细胞内pH值均有所升高。我们进行了大量显微成像研究，并开发了用于量化这些图像数据的实验方案。

我们对受pH调控的细胞通路和过程有了更多了解。大多数癌细胞系具有较高的细胞内pH，且许多表现出自噬水平升高，但我们此前并不知道这两者之间存在关联。我们最近的研究表明，在基因正常的细胞中，较高的细胞内pH足以增加自噬。

我们的实验室是少数几个研究细胞内pH值或pHi如何在整体动物模型中调控细胞行为的实验室之一。我们发现，pHi升高会促进细胞增殖、侵袭性细胞迁移以及组织紊乱。最近，我们发现较高的pHi会促进自噬，这是一种细胞自我吞噬的现象。

我们正在解决因扫描电镜（SEM）样品制备成本高昂且操作复杂而导致的使用受限问题，这一限制使许多实验室难以开展相关工作。在圣何塞州立大学，我们缺乏开展扫描电镜研究的资源，因此开发了一种更易于获取且成本较低的实验方案，使我们能够在无需昂贵设备的情况下获取高分辨率图像。

本方案结合了昆虫学中常用的传统技术，提供了一种经济高效且操作简便的扫描电子显微镜替代方法。该方法可轻松调整，用于获取果蝇不同部位或其他标本的高分辨率图像。首先，选择所需果蝇品系，并将其放入含有果蝇培养基的试管中。

将小瓶置于 25 摄氏度下孵育，直至果蝇发育成熟且成虫即将羽化。随后，用二氧化碳麻醉成虫，并将其置于二氧化碳操作垫上。通过修剪一根鹅毛，使其适配于 1 毫升血清移液管的锥形末端，制备一根羽毛果蝇分拣器。

用羽毛将果蝇分开，并挑选出具有直翅的个体。随后，向一个1.7毫升的微量离心管中加入1毫升70%乙醇。将选好的果蝇转移至该管中，并将管子置于冰上。

使用专用的冲孔工具，从65磅的档案级卡纸上裁剪出小型三角形尖头。然后使用Dumont 5号精细镊子将每个尖头的顶端弯曲成90度角。

使用Dumont 5号精细镊子将果蝇从微量离心管中取出。用无绒纸巾轻轻吸去果蝇表面多余的乙醇。在解剖显微镜下，将每只果蝇置于索引卡上，使其左侧朝上。

使用移液管，在索引卡片上将一到两滴皮胶与一到两滴去离子水混合。用镊子夹住已准备好的卡片尖端的宽端，将弯曲的尖端蘸入胶水混合液中，以沾取少量胶水。将卡片尖端的弯曲部分粘附于果蝇腹部右侧第二和第三腹节区域的腹面。

在胶水干燥前，调整果蝇使其前后轴与卡片尖端的弯曲部分垂直。将一枚3号固定针插入卡片尖端的宽端，并将其固定在昆虫装针板上。用相应的基因型标记每根针或每排针。

为了获得点状固定的果蝇眼睛的高分辨率照片，开启堆叠成像系统。然后将数码单反相机机身与70至200毫米的远摄镜头连接，并通过77毫米镜头转接器连接20倍复消色差显微镜物镜。确保通过漫射器使用闪光灯对样本进行照明。

使用 StackShot 控制器和微距轨道控制相机的 Z 轴位置。将固定在支点上的果蝇放置在万向支架台上，使果蝇的眼睛朝向镜头。用镊子小心调整果蝇头部位置，以获得最佳对齐效果。

将相机连接至笔记本电脑，并调整采集参数。设置放大倍数为20倍，快门速度为1/200秒，光圈f/2.8，ISO为400。然后，将生成的图像序列保存位置设置为所需的文件夹。

现在，在 StackShot 控制单元上调整自动距离模式下的对焦堆叠设置。将步长设为 5 µm，并通过设定对焦堆叠的起始和终止位置来计算步数。将相机置于自动拍摄模式，以实时预览模式观察样本。

移动轨道，使样本最近的部分处于焦点位置。然后，移动至最远的感兴趣区域并调整焦距。将相机恢复至手动拍摄模式，并从 StackShot 控制单元开始图像采集。

成像后，在引用的焦距叠加软件中打开获取的图像文件。选择“Stack”（叠加），然后对所有图像或Pmax进行对齐和叠加，以生成叠加图像。然后点击“File”（文件）并保存输出图像，将最终的叠加图像保存为tif文件。

完成对固定在针上的果蝇眼睛成像后，选择眼面居中、对齐良好、光照适宜且周边模糊最少的堆叠图像进行分析。在 Fiji 软件中打开 500 微米比例尺图像，使用直线工具测量比例尺的长度。

单击“分析”和“测量”以记录对应于500微米的像素距离。然后计算每微米的像素数，并利用该数值将像素测量结果转换为微米测量结果。在Fiji中打开堆叠图像文件。

从工具栏中选择放大镜以放大焦点区域。用眼睛及其周围的头部角质层充满整个屏幕。接下来，从工具栏中选择自由选择工具，沿最外排小眼的轮廓勾勒出视网膜区域。

若要移除选区的一部分，请按住 option 键并选择要移除的像素。若要向选区中添加内容，请按住 option 和 shift 键，然后选择要添加的像素。要计算面积，请选择“分析”菜单中的“测量”功能。

新窗口将显示面积、平均值、最小值和最大值参数。将数据复制并粘贴到电子表格中，以便记录并将像素单位转换为微米测量值。在 GMR-DNhe2 果蝇中过表达 DNhe2 导致成年果蝇的眼睛显著小于野生型成年果蝇。

GMR-DNhe2 果蝇的眼区面积与野生型果蝇相比减少了 41%，与 GMRGAL4 杂合果蝇相比减少了 48%。在携带 Atg1 等位基因 3 的杂合子 GMR-DNhe2 果蝇中，眼大小得到恢复，从 74.28 平方微米恢复至 129.9 平方微米。