用于定量体外成体 果蝇 结构的快速、简单的工作流程

在这里，我们提出了一种快速、低成本的工作流程，用于对成年 果蝇 眼睛进行高分辨率成像，以量化模式和生长缺陷。我们描述了通过点安装、高分辨率图像采集和图像分析进行样品制备的方案。

我们的实验室对了解细胞内 pH 动力学如何调节细胞行为感兴趣。我们对导致癌症进展的行为感兴趣，因为我们知道大多数癌症的细胞内 pH 值都会升高。我们进行了大量显微镜检查并制定协议来量化这些图像中的数据。

我们正在更多地了解受 pH 调节的细胞途径和过程。大多数癌细胞系具有较高的细胞内 pH 值，并且许多癌细胞系的自噬水平增加，但我们不知道这有联系。我们最近表明，遗传正常细胞中较高的细胞内 pH 值足以增加自噬。

我们的实验室是为数不多的几个研究细胞内 pH 或 PHI 如何调节整个动物模型中细胞行为的实验室之一。我们发现 PHI 增加会促进细胞增殖、侵袭性细胞迁移和组织紊乱。最近，我们发现较高的 PHI 会促进自噬，这是细胞同类相食的一种形式。

我们正在解决 SEM 样品制备的高成本和复杂性造成的差距，这限制了许多实验室的可访问性。在圣何塞州立大学，我们缺乏 SEM 的资源。因此，我们开发了一种更易于访问且价格合理的协议，使我们能够在不需要昂贵设备的情况下捕获高分辨率图像。

该协议结合了昆虫学中使用的传统技术，并为扫描电子显微镜提供了一种经济高效且用户友好的替代方案。它可以轻松适应捕获果蝇不同部分或不同标本的高分辨率图像。首先，选择所需的果蝇菌株并将其放入装有果蝇食物的小瓶中。

在 25 摄氏度下孵育小瓶，直到果蝇长大并且成虫接近。接下来，用二氧化碳麻醉成年苍蝇，并将它们放在二氧化碳垫上。通过修剪鹅毛以适合 1 毫升血清移液管的锥形端来准备羽毛蝇分选器。

用羽毛对苍蝇进行分类，并选择翅膀笔直的个体。接下来，将 1 毫升 70% 乙醇加入 1.7 毫升微量离心管中。将选定的果蝇转移到试管中，并将试管置于冰上。

使用专门的尖头冲头。从 65 磅的档案卡纸上剪下小三角形点。然后使用 Dumont 5 号细尖镊子将每个点的尖端弯曲成 90 度角。

使用 Dumont 5 号细尖镊子从微量离心管中取出果蝇。用无绒纸巾轻轻吸干果蝇，以去除多余的乙醇。将每只果蝇的左侧放在解剖显微镜下的索引卡上。

使用移液管，在索引卡上将 1 到 2 滴皮革胶与 1 到 2 滴去离子水混合。用镊子在宽端拿起准备好的卡尖，将弯曲的尖端轻拍到胶水混合物中，以涂抹少量胶水。将卡尖的弯曲尖端涂抹在果蝇右腹部的第 2 段和第 3 段周围的前侧。

在胶水干燥之前，调整门襟，使其前后轴垂直于卡尖的弯曲尖端。将 3 号安装销插入卡点的宽端，并将其固定到防虫针座上。用相应的基因型标记每个针或针行。

要获取点安装果蝇眼睛的高分辨率照片，请打开堆叠成像系统。然后设置一个 DSLR 相机机身，将 70 至 200 毫米长焦镜头通过 77 毫米镜头适配器连接到 20 倍 Apo 显微镜物镜。确保通过扩散器用闪光灯照亮标本。

使用 StackShot 控制器和宏滑轨控制摄像机的 Z 轴定位。将点安装的飞架放在通用载物台稳定器上，眼睛朝向镜头。调整头部位置，小心使用镊子以实现最佳对齐。

将相机连接到笔记本电脑并调整采集设置。将放大倍率设置为 20 倍、快门速度、1/200 秒、光圈 f/2.8 和 ISO 400。然后，设置将生成的图像堆栈保存到所需文件夹的位置。

现在，在自动距离模式下调整 StackShot 控制单元上的焦距堆栈设置。将步长设置为 5 微米，并通过设置焦点堆栈的开始和停止位置来计算步数。在实时取景模式下查看标本，相机处于自动拍摄模式。

移动导轨，使标本最近的部分聚焦。然后，移动到最感兴趣的特征并调整焦点。将相机返回到手动拍摄模式，并从 StackShot 控制单元开始图像采集。

成像后，在引用的焦点堆叠软件中打开获取的图像文件。选择 Stack（堆栈），然后对齐并全部堆叠或 Pmax 以生成堆叠图像。然后点击 文件 并保存输出图像 将最终的堆叠图像保存为 tif 文件。

对针式安装的果蝇眼睛进行成像后，选择堆叠图像进行分析，其中眼睛居中并对齐，具有足够的照明和最小的周边模糊。在 Fiji 软件中打开 500 微米比例尺图像。使用直线工具测量比例尺的长度。

单击 Analyze and Measure 以记录像素距离，相当于 500 微米。然后，计算每微米的像素数，并使用它将像素测量值转换为微米测量值。在 Fiji 中打开堆叠图像文件。

从工具栏中选择放大镜以扩大焦点区域。用眼睛和周围的头部角质层填充屏幕。接下来，从工具栏中选择手绘选择工具，并在最外层的 ommatidia 行之后勾勒出视网膜区域。

要删除选区的一部分，请按住选项按钮并选择要删除的像素。要添加到选区，请按住 option 和 shift 按钮，然后选择要添加的像素。要计算面积，请选择 Analyze and Measure （分析和测量）。

新窗口将显示面积、平均值、最小值和最大值参数。将数据复制并粘贴到电子表格中，以便进行记录并从像素转换为微米测量。与野生型成蝇相比，在 GMR-DNhe2 果蝇中过表达 DNhe2 导致成虫眼睛显著变小。

与野生型果蝇相比，GMR-DNhe2 果蝇的眼面积减少了 41%，与 GMRGAL4 杂合果蝇相比，眼面积减少了 48%。在 Atg1 等位基因 3 的 GMR-DNhe2 果蝇杂合子中恢复了眼睛大小，使其从 74.28 平方微米增加到 129.9 平方微米。