用于研究体外宿主-病原体相互作用的器官型组织模型系统

牙科平台生物膜由数百种微生物组成，这些微生物可以驱动口腔上皮发炎，导致牙龈炎等疾病。我们希望使用器官型组织模型更好地了解这些相互作用。这些系统为以受控方式评估替代治疗方式提供了有用的平台。

因此，近年来测序技术的进步正在改变感染生物学领域。这些技术使我们能够通过在蛋白质组学、转录组学和代谢组学水平评估宿主和微生物特征，使用多种组学技术真正研究宿主病原体的相互作用。我们最近的研究强调了王国间和多微生物相互作用在生物膜相关感染中的重要性。

通过使用体外模型系统，我们已经能够使用 RAM 和光谱学等创新技术研究宿主生物膜相互作用、测试新型抗生物膜疗法并分析微生物群落。使用这些器官型组织模型的未来研究将旨在实现微生物和宿主组织和培养物的多组学特征和分析。我们希望在我们的生物膜模型中揭示和解开宿主与特定细菌和真菌物种之间的复杂相互作用。

首先，从 80 摄氏度中取出含有链球菌物种的多孔珠子的冷冻茎。在 Columbia 血液螺旋钻底板上恢复链球菌物种，含有 5% 无菌去纤维马血。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。

第二天，将 3 到 4 个菌落从平板转移到 10 mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中。将肉汤在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 16 至 18 小时。孵育后，将细胞悬液在 20 摄氏度下以 3， 000 G 离心 5 分钟。

用 10 毫升无菌 PBS 洗涤细胞沉淀。将沉淀重悬于 10 ml PBS 中，并使用设置为 550 纳米的分光光度计单独标准化每种链球菌种类的悬浮液。标准化后，将每种链球菌悬浮液稀释 1 到 10，以达到 1 乘以 10 到 7 个细胞/毫升的幂浓度，在 Todd Hewitt 肉汤和 Roswell Park Memorial Institute 培养基的一对一混合物中。

将 500 微升稀释的细胞悬液移液到含有 13 毫米羟基磷灰石圆盘的 24 孔微量滴定板中。将培养物在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时，以形成生物膜。以类似的方式，在含有 5% 无菌去纤维马血的苛养厌氧螺旋钻基底上培养厌氧微生物。

将每种厌氧微生物标准化为特定的吸光度，并在 Todd Hewitt 肉汤和 Roswell Park Memorial Institute 培养基的一对一混合物中稀释它们。链球菌生物膜成熟后，小心地从孔中去除未粘附的细胞和用过的培养基。向每个孔中加入 500 微升标准化 1 乘以 10 倍，以达到每毫升 7 个细胞的四种厌氧微生物悬浮液的功效。

在 37 摄氏度的厌氧条件下孵育生物膜 24 小时。第二天，从孔中去除未粘附的细胞和用过的培养基。加入 500 微升 Todd Hewitt 肉汤和 Roswell Park Memorial Institute 培养基的无菌一对一混合物。

在厌氧条件下培养生物膜 24 小时。第 7 天，用 500 微升无菌 PBS 洗涤生物膜两次以进行共培养。首先，拆箱并将人类口腔上皮或 HOE 组织和培养基转移到 2 级安全柜中。

将 1 毫升随组织提供的维持培养基添加到 12 孔板的每个孔中。使用无菌镊子，从营养螺旋器和 24 孔运输板中取出含有 HOE 组织的聚碳酸酯插入物。将组织转移到准备好的 12 孔板中。

将组织模型在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时，以使其适应实验室条件。同时，要从羟基磷灰石盘中去除生物膜，请使用 19 号针头和镊子将圆盘从 24 孔板的底部提起。将光盘转移到装有 1 毫升无菌 DPBS 的 bijuu 中。

在超声处理水浴中以 35 kHz 的频率对椎间盘进行超声处理 10 分钟。适应后，用镊子从 12 孔板中取出组织插入物。吸取 100 微升生物膜超声悬浮液直接到组织模型上。

将插入物转移到另一个含有 1 毫升新鲜维持培养基的 12 孔板中。将组织模型在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。对于组织处理，在 2 毫升螺帽 O 形圈管中制备 350 μL RLT 裂解缓冲液，其中含有 1% 离子束巯基乙醇。

向试管中加入大约 100 微升 0.5 毫米酸洗玻璃珠。使用镊子从培养基中取出含有组织的插入物，并从插入物中丢弃任何残留的微生物悬浮液。将插入物倒置在与眼睛齐平的位置，然后使用 19 号针头从插入物底部小心地切开组织和膜。

将组织和膜转移到准备好的 RLT 缓冲液中。使用台式微珠机匀浆器将组织匀浆 30 秒。按照制造商的说明从 RNA 提取试剂盒中从所得裂解物中提取 RNA。

使用低通量和高通量方法收集剩余的用过的组织培养基用于蛋白质组学分析。与未刺激的对照相比，暴露于生物膜超声处理后，HOE 组织中炎症生物标志物的基因表达显着上调。观察到 CCL2 、 CXCL1 和 CSF3 的倍数变化最大。

与对照组织相比，用生物膜超声刺激后，HOE 组织中的 IL8 mRNA 表达增加了 8.67 倍。用过的培养基中的 IL8 蛋白水平从对照组织的 1.005 纳克/毫升增加到生物膜超声处理刺激组织的 4.245 纳克/毫升。