Name: 小鼠骨髓来源的中性粒细胞的 ATAC-Seq 文库制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习小鼠骨髓中性粒细胞ATAC-Seq文库制备方法，通过免疫磁珠分选获得高纯度细胞，优化染色质可及性分析流程，助力免疫表观遗传学研究及疾病治疗靶点发现。

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本工作得到了R&amp;北京市教育委员会“高水平人才引进计划”（KZ202010025041）及中国医学科学院北京协和医学院（基金编号：CX24PY29）

以下所有动物实验均遵守中国国家伦理和动物福利指南及相关法规，并已获得中国北京首都医科大学动物护理研究伦理委员会的批准（sjtkl11-1x-2022(060)）。
1. 骨髓细胞（BMC）悬液的制备
<ol>
	<li>选取6-8周龄、体重19-21 g的雄性C57BL/6J小鼠。使用CO2麻醉舱处死小鼠，在深部反射消失后进行颈椎脱位，随后在解剖垫上用70%乙醇喷雾消毒小鼠体表。</li>
	<li>使用小型剪刀和镊子小心分离股骨与髋关节及胫骨的连接，去除附着的皮肤和骨骼肌，并在10 cm培养皿中用冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗股骨。</li>
	<li>剪除股骨两端的骨骺，将连接于2 mL注射器的28 G针头轻轻插入骨髓腔，用含2%胎牛血清（FBS）的冷PBS冲洗骨髓。</li>
	<li>重复上一步骤，直至冲洗出的深红色液体变为透明。通常需要冲洗三次。 
	注意：避免将针头插入骨髓腔过深，以确保获得最佳的细胞产量。</li>
	<li>使用70 µm细胞筛将细胞悬液过滤至荧光激活细胞分选（FACS）管（5 mL）中。</li>
	<li>使用不含多聚甲醛的商用红细胞裂解缓冲液裂解骨髓细胞（BMCs）中的红细胞。
	<ol>
		<li>将试管在25 °C下以500 x g离心5分钟，小心吸除上清液，底部保留约100 µL液体，轻弹试管使沉淀松散。</li>
		<li>加入2 mL由10倍浓缩红细胞裂解缓冲液稀释而成的裂解液，通过倒置试管三次混匀。随后在500 x g下离心5分钟，弃去上清液，并通过轻弹试管重悬细胞沉淀。</li>
		<li>用含10% FBS的RPMI 1640培养基洗涤细胞两次，并重悬于2 mL体积中。 
		注意：当遇到未分散的细胞团块时，建议使用200 µL移液器吸头挑出团块，而不是将细胞悬液再次通过70 µm细胞筛过滤。此方法可减少细胞损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用台盼蓝染色法测定各样本的细胞活力及活细胞总数。</li>
</ol>
2. 使用抗Ly6G磁珠对中性粒细胞进行免疫磁标记
<ol>
	<li>将骨髓细胞（每只小鼠约 2 x 107 个活细胞）重悬于 2 mL 含 10% FBS&#160;的 RPMI 1640 培养基中，在 25 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 
	注意：由于 ATAC-seq 仅需 1 x 105 个细胞，因此从同一只小鼠获得的多余中性粒细胞可用于其他表观基因组分析（如 ChIP-seq 和 Hi-C）或免疫功能评估（如细胞因子产生、吞噬作用和中性粒细胞胞外诱捕网 NETs）。</li>
	<li>吸除大部分上清液，残留约 100 µL，并轻轻敲击离心管以松动沉淀。</li>
	<li>加入 30 µL Ly6G 磁珠，通过轻柔敲击与骨髓细胞混匀。 
	注意：磁珠使用前应涡旋振荡至少 10 秒。在将磁珠加入骨髓细胞后，不建议再进行涡旋振荡。</li>
	<li>在 25 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 2 mL PBS 重悬磁珠和细胞，然后在 25 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除大部分上清液，残留约 100 µL，并轻轻敲击离心管以松动沉淀。再加入 PBS 至终体积为 1 mL。 
	注意：处理未分散的细胞团块时，建议使用 200 µL 移液器吸头挑出团块，而不是通过 70 µm 细胞筛过滤细胞悬液。该方法可减少细胞损失。</li>
</ol>
3. 采用免疫磁珠细胞分选法分离中性粒细胞
<ol>
	<li>用 PBS 预处理 MS 柱。
	<ol>
		<li>将 MS 柱置于兼容的磁性激活细胞分选（MACS）分选器的磁场中，并在 MS 柱流出液下方放置一个空的 5 mL 管。</li>
		<li>用 500 µL PBS 冲洗柱子。待 PBS 完全流入 MS 柱后，重复此步骤。 
		注意：PBS 应通过 MS 柱逐滴缓慢流入下方的 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管中。确保无空气进入柱子，因气泡可能堵塞柱子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将磁性标记的骨髓细胞（BMC）悬液以每次 500 µL 的方式加入 MS 柱中，柱内储液区一空立即补充。 
	注意：确保细胞悬液中无细胞团块。如有需要，可在本步骤前于 MS 柱下方放置一个新的 5 mL FACS 管，用于收集未标记的细胞（如单核细胞和淋巴细胞）。 
	注意：注意观察液滴流速。流速过慢可能提示分选柱发生堵塞。</li>
	<li>每次柱内储液区排空后，加入 500 µL PBS 洗涤 MS 柱，重复该过程两次。 
	注意：过早加入 PBS 可能阻碍部分细胞进入分选柱，从而影响细胞分选的纯度。</li>
	<li>收集磁性标记的中性粒细胞。
	<ol>
		<li>当柱内储液区排空后，将柱子从磁场中取出，并小心地将其置于一个 5 mL 管上。 
		注意：在移除柱子前，确保柱内无残留液体，以防在操作过程中因液滴流出导致中性粒细胞损失。可用移液器去除柱内残留液体。</li>
		<li>向柱子中加入 2 mL PBS，然后立即用力将推杆插入柱子，以洗脱磁性标记的中性粒细胞。 
		注意：为获得足够的中性粒细胞，应确保足够的洗脱体积，并在插入推杆时动作迅速。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板对分离的细胞进行计数。取分选后的 100 µL 细胞悬液，通过流式细胞术分析，确定所分离中性粒细胞的纯度。</li>
</ol>
4. 细胞核提取
<ol>
	<li>将含有中性粒细胞的 50,000 个单细胞悬液在 0.2 mL 离心管中于 4 °C 条件下以 500 ×g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。</li>
	<li>用 50 µL 预冷的裂解缓冲液（参见表 1）重悬中性粒细胞，使用移液器轻轻混匀溶液，并在冰上孵育 10 分钟。 
	注意：如果样品体积小于 5 µL，可直接加入裂解缓冲液。细胞悬液浓度不得超过 1 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液并收集细胞核。在进行后续操作前将离心管置于冰上。 
	注意：为尽量减少样品损失，应标记离心后沉淀所在管壁的一侧，并在去除上清液时从相对的一侧轻轻吸出液体。</li>
</ol>
5. 利用转座酶进行核小体锚定的标签化反应
<ol>
	<li>根据DNA文库制备试剂盒的说明（参见表2），在聚合酶链式反应（PCR）管中配制含有Tn5转座酶的标签化反应混合液，并将冷藏的扩增子纯化磁珠在25 °C预温至少30分钟。</li>
	<li>用50 µL标签化反应混合液重悬中性粒细胞核，轻轻吹打混匀，随后使用手持离心机离心5秒（约2600 × g）。</li>
	<li>将反应管置于PCR仪中，在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>向裂解液中加入100 µL预先涡旋混匀的扩增子纯化磁珠，然后通过上下吹打10次，充分混匀磁珠。 
	注意：磁珠具有黏性，容易附着在移液枪头内壁，因此在转移磁珠时应确保准确吸取所需体积，并缓慢从枪头中排出。</li>
	<li>将反应管在25 °C孵育5分钟，然后使用手持离心机离心5秒（约2600 × g）。</li>
	<li>将反应管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约5分钟），以纯化中断的DNA片段。随后小心移除上清液，避免扰动磁珠。</li>
	<li>每次用200 µL新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠，同时将反应管保留在磁力架上30秒。添加乙醇时避免扰动磁珠。重复步骤5.7的操作。</li>
	<li>使用手持离心机离心反应管（约2600 × g），用10 µL移液枪头吸除乙醇，然后打开管盖干燥磁珠3–5分钟。 
	注意：由于不同地区湿度差异，磁珠干燥时间可能有所不同。磁珠应干燥至表面失去光泽即可。过度干燥会增加洗脱难度，而干燥不足可能导致残留乙醇，影响后续实验。此外，将磁力架水平放置更有利于磁珠均匀干燥。</li>
	<li>将反应管从磁力架上取下后，加入26 µL ddH2O覆盖磁珠，上下吹打确保充分混匀，随后在25 °C孵育2分钟。 
	注意：若磁珠过度干燥，可适当延长孵育时间。</li>
	<li>短暂使用手持离心机离心反应管（约2600 × g），再将反应管置于磁力架上分离磁珠，直至溶液澄清（约5分钟）。</li>
	<li>小心将24 µL上清液转移至新的PCR管中。</li>
</ol>
6. 下一代测序（NGS）文库构建
<ol>
	<li>在无菌离心管中，使用含有测序接头的纯化DNA片段和引物配制PCR反应体系（参见表3）。</li>
	<li>按照推荐程序进行PCR反应（参见表4），通常约需1小时。 
	注意：此步骤完成后可暂时中止实验，PCR产物可在-20 °C保存至少2周。</li>
	<li>向50 µL PCR产物中加入27.5 µL预先涡旋混匀的扩增子纯化磁珠，然后通过移液枪上下吹打10次，充分混匀溶液中的磁珠。 
	注意：磁珠与PCR产物的比例不当可能导致片段长度分布出现偏差。若PCR产物体积因蒸发减少，可用ddH2O补足至50 µL。务必准确吸取磁珠体积，并缓慢从移液枪头中释放，以尽量减少磁珠附着。</li>
	<li>将反应管在25 °C孵育5分钟，然后使用手持离心机离心5秒（约2600 x g）。</li>
	<li>将反应管置于磁力架上，直至溶液变澄清（约5分钟），以纯化文库DNA。随后，小心将上清液转移至新的无菌PCR管中，弃去磁珠。</li>
	<li>向上述上清液中加入50 µL预先涡旋混匀的扩增子纯化磁珠，再通过移液枪上下吹打10次，充分混匀磁珠。</li>
	<li>将反应管在25 °C孵育5分钟，然后使用手持离心机离心5秒（约2600 x g）。</li>
	<li>将反应管置于磁力架上，直至溶液变澄清（约5分钟），然后小心移除上清液，避免扰动磁珠。</li>
	<li>每次使用200 µL新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠两次，每次将反应管保留在磁力架上30秒。添加乙醇时避免扰动磁珠。</li>
	<li>打开管盖，在室温下干燥磁珠5分钟。</li>
	<li>将反应管从磁力架上取下后，加入22 µL ddH2O覆盖磁珠，上下吹打10次以确保充分混匀。随后在25 °C孵育5分钟。</li>
	<li>使用手持离心机短暂离心反应管（约2600 × g），再将反应管置于磁力架上分离磁珠，直至溶液变澄清（约5分钟）。</li>
	<li>小心将20 µL上清液转移至新的无菌PCR管中，并在-20 °C保存。 
	注意：若需获得片段长度分布更集中的文库，可考虑使用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行片段筛选。或者，若对长度分布范围无特殊要求，可直接使用磁珠或柱式纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，无需进行长度筛选。</li>
</ol>
7. 文库质量控制与测序
<ol>
	<li>利用DNA片段分析仪平台评估文库DNA的长度分布。</li>
	<li>利用NGS平台对通过质量检测的文库进行高通量测序。</li>
</ol>

Scalable ATAC-seq Protocol for Chromatin Accessibility in Rodent Neutrophils

<ol><li>Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+neutrophil+function+in+severe+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Update on neutrophil function in severe inflammation.</a> Front Immunol. 9, 2171(2018).</li>
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<li>De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair%3A+Going+forward+in+reverse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse.</a> Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本论文报道了一种针对来自啮齿类动物骨髓样本的中性粒细胞优化的ATAC-seq文库制备实验方案。由于中性粒细胞是高度敏感且易于活化的免疫细胞，优化工作优先考虑维持分离后中性粒细胞的活性。不当处理可能导致NETosis及其他形式的细胞死亡，从而释放大量非染色质化的DNA，增加背景噪声23。我们在细胞核提取前简化了操作流程，并选用不含多聚甲醛的红细胞裂解缓冲液。与外周血样本不同，骨髓细胞中红细胞含量极少，因此仅需将骨髓细胞与红细胞裂解缓冲液进行短暂孵育，即可有效减少中性粒细胞的丢失，同时确保红细胞充分溶解。为尽量减少不必要的刺激，所有试剂在与骨髓细胞孵育前必须预热至37 °C，并需极其轻柔地操作，避免涡旋振荡、反复使用细胞筛过滤、长时间或过高转速离心等操作。上述步骤的改进提高了分选后中性粒细胞的存活率，从而为构建高质量的ATAC-seq文库创造了有利条件。
我们探讨了三种广泛使用的分选技术，以获得具有最佳活性的中性粒细胞：免疫磁珠分离法、密度梯度离心法和流式细胞术分选。在进行密度梯度离心时，中性粒细胞可能穿过分离液层，从而引发渗透压变化并诱...

中性粒细胞是脊椎动物体内数量最多且至关重要的免疫细胞类型之一，占人类白细胞的50%–70%1。中性粒细胞在宿主识别和清除微生物过程中发挥核心作用。在脓毒症期间，成熟的中性粒细胞是最早响应的细胞之一2。它们通过趋化作用迅速迁移至感染部位3，到达炎症部位后，通过吞噬微生物（吞噬作用）、产生活性氧自由基（依赖NADPH氧化酶的呼吸爆发）、释放颗粒内容物（脱颗粒）以及形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）来捕获并杀灭胞外细菌4。在趋化因子的作用下，未成熟的中性粒细胞也会迅速从骨髓动员进入外周循环5,6。这些被招募至感染部位的中性粒细胞还会释放参与多种生理过程（如造血、血管生成和伤口愈合）的细胞因子7,8。患有先天性或获得性导致中性粒细胞数量减少疾病的患者对感染更为易感9,10。然而，中性粒细胞的活化是一把双刃剑。过度活化及细胞因子的大量释放可导致组织和器官损伤，若感染未能及时控制，可能引发多器官功能障碍11,12。此外，中性粒细胞还参与多种炎症性和自身免疫性疾病，并可影响肿瘤的发展和转移过程13,14。这凸显了研究中性粒细胞活性调控机制的重要性，以在实现有效免疫应答的同时避免对宿主造成损伤。
在中性粒细胞中，染色质结构在其分化、迁移和活化过程中经历显著而动态的变化，在细胞整个生命周期中发挥关键的调控作用。这一过程始于早幼粒细胞时期具有大而圆形、富含常染色质的细胞核，随后在中幼粒细胞和晚幼粒细胞阶段细胞核出现凹陷，进一步发展为杆状核细胞的C形或S形细胞核，最终形成分叶明显的多形核中性粒细胞，其细胞核染色质高度浓缩、紧密排列。15,16，证明了中性粒细胞生物学的复杂性。特化的染色质构型可确保中性粒细胞功能相关基因的选择性表达，例如参与颗粒生成以及有效清除病原体所必需的快速转录反应的基因17当中性粒细胞通过趋化作用被募集到炎症部位时，跨内皮迁移会对核骨架/细胞骨架连接复合物（LINC复合物）产生压力，从而促进染色质重塑并增强活化潜能。18在脓毒症中，活化的中性粒细胞表现出一种 &#34;核左移&#34; 染色质形态异常，例如双叶核或多叶核缺失，以及染色质凝聚显著松散19这导致与炎症反应相关的基因区域可及性显著增加，从而诱导这些基因的显著表达。如果感染未能得到及时控制，则组蛋白瓜氨酸化及随后的染色质解聚是形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）所必需的。20,21因此，了解中性粒细胞的染色质结构对于推动中性粒细胞生物学的发展以及开发炎症性和自身免疫性疾病的治疗方法至关重要，为未来疾病治疗带来希望。
染色质可及性是表观基因组水平上染色质结构的一种度量指标，用于反映基因组区域在物理上对增强子、启动子、绝缘子以及染色质结合因子的可接近程度，并揭示这些元件如何影响基因表达22。利用测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）是一种广泛用于全基因组范围内评估染色质可及性的方法23。该方法无需预先了解调控元件信息，因此成为表观遗传学研究中的有力工具。该技术包括分离样本细胞核、利用转座酶Tn5对基因组DNA进行片段化处理，并添加测序引物以进行文库构建、测序及数据分析23。ATAC-seq已在核小体定位、转录因子结合分析、多种细胞类型或疾病中的调控机制研究、新增强子的鉴定以及生物标志物发现等方面发挥了重要作用22,23。该方法常与其他技术（如RNA测序）联合使用，以实现对基因表达的全面分析。
ATAC-seq 通过揭示中性粒细胞在健康与疾病状态下的精确表观遗传机制，推动了我们对中性粒细胞生物学的认识。该技术已鉴定出多个在中性粒细胞成熟及效应反应中起关键作用的转录因子（如 RUNX1、KLF6、PU.1 等）。24,25，揭示了脓毒症中具有生物标志物潜力的病原体特异性特征26，阐明了先天免疫记忆的表观基因组机制12，并确定了儿童急性髓系白血病（AML）的治疗靶点27然而，作为免疫监视中重要的细胞组分，中性粒细胞对外界环境高度敏感，因此在获取高质量的ATAC-seq数据方面存在挑战。在生理条件下，人中性粒细胞的中位半衰期约为3.8天，而小鼠中性粒细胞的平均半衰期为12.5小时。值得注意的是，当在体外研究时，其中性粒细胞的半衰期显著缩短 体外28,29. 在期间 体外 分离中性粒细胞的操作、暴露于微生物或病原体相关分子模式（PAMPs）以及重复的实验步骤和剧烈操作，可能导致中性粒细胞异常活化，并因凋亡或NETosis而降低细胞活力。死亡细胞通常含有大量未染色质化的DNA，对Tn5高度敏感，从而显著增加ATAC-seq的背景噪声23.
本文提出了一种可扩展的ATAC-seq文库制备方案，专为从小鼠骨髓样本中分离的中性粒细胞优化设计。图1展示了该方案的流程图，包括从中性粒细胞骨髓样本中进行免疫磁珠分离，随后进行ATAC-seq分析。改进后的免疫磁珠分选方法可确保中性粒细胞在提取细胞核前具有最佳的活性，从而保证ATAC-seq文库的高质量，并便于在实验设计中整合其他中性粒细胞功能评估。该方案的实施将有助于研究人员理解中性粒细胞在面对不同微环境刺激时的染色质结构特征及表观基因组重编程机制，预期将在基础免疫学和临床免疫学研究中具有广泛应用。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>20 bp&amp;ndash;5000 bp 片段长度标记物</td><td>Bioptic</td><td>C109102-100A</td><td>DNA片段分析仪配套产品</td></tr><tr><td>5k 片段长度标记物（标准 50 bp Ladder）</td><td>Bioptic</td><td>C109101-100A</td><td>DNA片段分析仪配套产品</td></tr><tr><td>扩增子纯化磁珠</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td>扩增子纯化磁珠是一种核酸纯化试剂盒，用于获得高质量的DNA产物。</td></tr><tr><td>Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse</td><td>miltenyi</td><td>130-120-337</td><td>Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse 专为从小鼠骨髓单细胞悬液中正向筛选或去除小鼠中性粒细胞而开发。</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200)</td><td>BD</td><td>Cat#563015</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400)</td><td>BD</td><td>Cat#560731</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200)</td><td>BD</td><td>Cat#740157</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠，野生型，8周龄，雄性</td><td>中国医学科学院实验动物研究所</td><td>中国医学科学院实验动物研究所</td><td></td></tr><tr><td>DNA分离缓冲液</td><td>Bioptic</td><td>C104406</td><td>DNA片段分析仪配套产品</td></tr><tr><td>大肠杆菌来源的超纯LPS（血清型0111:B4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#L-2630</td><td></td></tr><tr><td>DNA定量试剂</td><td>vazyme</td><td>EQ111</td><td>DNA定量试剂是一种简单、灵敏且准确的双链DNA（dsDNA）荧光定量检测试剂盒。</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液（10×）</td><td>BioLegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>Cat#10099141C</td><td></td></tr><tr><td>MS 分离柱</td><td>miltenyi</td><td>130-042-201</td><td>MS柱专为细胞正向筛选而设计。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>S2 凝胶电泳进样针&amp;nbsp;</td><td>Bioptic</td><td>C105101</td><td>DNA片段分析仪配套产品</td></tr><tr><td>手术器械：手术刀、解剖剪、显微解剖剪、精细镊子、钝头解剖镊、持针器</td><td>Fisher Scientific</td><td>https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools</td><td>可从其他合格供应商处采购</td></tr><tr><td>注射器（1&amp;nbsp;mL）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464</td><td>可从其他合格供应商处采购</td></tr><tr><td>TruePrepTM DNA文库构建试剂盒 V2 for Illumina</td><td>vazyme</td><td>TD501-01</td><td>TruePrep DNA文库构建试剂盒 V2 for Illumina 是专为Illumina高通量测序平台设计的专用试剂盒。使用该试剂盒可将DNA制备成适用于Illumina高通量测序平台的测序文库。</td></tr><tr><td>TruePrepTM Index试剂盒 V2 for Illumina</td><td>vazyme</td><td>TD202</td><td>TruePrep Index试剂盒 V2 for Illumina 是TruePrep DNA文库构建试剂盒 V2 for Illumina 的配套试剂盒，可用于制备96种不同的双端Index文库。</td></tr></tbody></table>

小鼠骨髓来源中性粒细胞的atac-seq文库制备

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils

利用测序技术检测转座酶可及染色质（ATAC-seq）是一种功能强大的高通量方法，可用于评估染色质可及性并深入理解表观基因组调控机制。中性粒细胞作为免疫反应中一类关键的白细胞，在分化和活化过程中会发生显著的染色质结构重塑，这些变化对其功能相关基因表达具有重要影响。ATAC-seq 已被广泛应用于揭示中性粒细胞成熟过程中的关键转录因子，发现病原体特异性的表观基因组特征，并识别自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。然而，中性粒细胞对外界环境高度敏感，这给获得高质量的 ATAC-seq 数据带来了挑战。本文提出了一种可扩展的实验方案，用于制备来自啮齿类动物骨髓来源中性粒细胞的 ATAC-seq 文库，该方案通过改进的免疫磁珠分离技术，确保细胞活性最佳并获得高质量文库。文中详细讨论了影响文库质量的关键因素以及方法拓展的优化原则。本方案将有助于致力于研究中性粒细胞染色质结构与表观基因组重编程的研究人员，推动基础免疫学与临床免疫学领域的深入发展。

本方案用于从C57BL/6小鼠的骨髓中分离中性粒细胞，并通过ATAC-seq技术比较其在脂多糖（LPS）刺激前后染色质可及性的差异。通常，可从一只6至8周龄的C57BL/6小鼠的双侧股骨中收获约2 × 107个骨髓细胞（BMCs），并进一步分离出2–5 × 106个中性粒细胞。其中，1 × 105个细胞用于ATAC-seq分析，其余细胞可用于中性粒细胞的全面分析。
采用FACS免疫表型分析来确定免疫磁珠分选后中性粒细胞的纯度和活力（图2）。尽管仅通过前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）的分布即可进行初步估计，但本实验使用特异性中性粒细胞标志物染色以更明确地展示分选效果。在基于FSC-A和SSC-A设门后，进一步利用FSC-A与前向散射高度（FSC-H）进行设门，以区分单细胞与聚集细胞。分选后约99%的细胞被鉴定为单细胞。随后排除7-氨基放线菌素D（7AAD）——一种可被活细胞有效排出的DNA染料——对细胞进行标记，从而鉴定出分选后单细胞中>...

本文概述了一种从小鼠骨髓中分离中性粒细胞并构建ATAC-seq文库的实验方案，旨在确保中性粒细胞的高存活率和高质量文库的制备。文章提供了骨髓细胞制备、免疫磁珠分选及文库构建的详细步骤，为中性粒细胞研究领域的新手研究人员提供了有价值的参考指南。

小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

利用测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）是一种强大的高通量技术，用于评估染色质可及性及……

本研究致力于优化用于研究中性粒细胞染色质可及性的ATAC-Seq文库构建方案。该优化将有助于探究中性粒细胞的表观遗传重编程过程，揭示其在不同刺激条件下免疫应答的分子机制，并发现与疾病发生及进展相关的潜在治疗靶点。中性粒细胞的平均半衰期为12.5小时，由于其对微环境刺激具有高度敏感性，个体半衰期甚至更短。因此，分离高活性的中性粒细胞并获得高质量的中性粒细胞核，是成功构建ATAC-Seq文库的关键步骤，但也具有挑战性。我们发现，免疫磁珠分离法可提高中性粒细胞分选的效率，确保高纯度，并为从小鼠中性粒细胞制备高质量ATAC-Seq文库提供可扩展的实验方案。首先，取6至8周龄、体重19至21克的雄性小鼠，实施安乐死。使用小型剪刀和镊子小心地将股骨从髋关节和胫骨分离。去除附着的皮肤和骨骼肌后，用10厘米培养皿中的冷PBS冲洗股骨。然后切除股骨的骨骺端，并将连接在2毫升注射器上的28号针头轻轻插入骨髓腔中。用含有2%胎牛血清的冷PBS冲洗骨髓。接着，使用70微米细胞筛将细胞悬液过滤至荧光激活细胞分选管中。在25摄氏度下以500 G离心5分钟。随后，小心移除上清液，底部保留约 100 微升液体，并轻轻敲击离心管以松动沉淀。接着使用不含多聚甲醛的裂解缓冲液裂解骨髓细胞中的红细胞。最后，用含有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基将细胞洗涤两次，再重悬于 2 毫升体积中。首先，将制备好的骨髓细胞重悬于 2 毫升 RPMI 1640 培养基中，在 25 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟。吸除大部分上清液，保留约 100 微升，并轻轻敲击离心管以松动沉淀。接着，加入 30 微升 LY-6G 磁珠，并轻轻敲击离心管使磁珠与骨髓细胞充分混匀。将细胞中的磁珠用 2 毫升 PBS 重悬后，在 25 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟。吸除大部分上清液，并加入额外的 PBS，使最终体积为 1 毫升。将 MS 柱置于兼容的磁性激活细胞分选装置的磁场中。用 500 µL PBS 冲洗层析柱，并在液体完全流经 MS 层析柱后重复此步骤。接着，向 MS 层析柱中加入 500 µL 磁标记的骨髓细胞悬液。当层析柱储液室排空后，立即重新加样。当柱上样液完全流尽后，将柱子从磁场中取出，并置于一个5毫升离心管上。向柱中加入2毫升磷酸盐缓冲液（PBS），用力将推杆插入柱中，以洗脱磁标记的中性粒细胞。将含有中性粒细胞的50,000个单细胞悬液在0.2毫升离心管中，于4°C、500 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将中性粒细胞重悬于50 µL预冷的裂解缓冲液中。使用移液器轻轻混匀溶液，并在冰上孵育10分钟。再次离心中性粒细胞并弃去上清液后，收集细胞核。在开始后续操作之前，将离心管置于冰上。首先，在 PCR 管中配制含有 Tn5 转座酶的标签化反应体系。将冷藏的扩增子纯化磁珠在 25 摄

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠骨髓来源的中性粒细胞的 ATAC-Seq 文库制备

我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。...

小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

本文提供了一种可用于表征C1498细胞培养的技术流程 体外 以及小鼠注射后诱导的急性白血病。通过流式细胞术、免疫荧光显微镜、细胞化学和May-Grünwald...

详细描述小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）是一种全基因组范围检测染色质可及性的方法。本方案为针对人淋巴细胞（Th1/Th2）优化的逐步ATAC-seq实验流程，涵盖从分子实验到最终计算分析的完整步骤。该方案适用于无下一代测序方法经验的研究人员。...

通过ATAC-Seq技术绘制原代人T淋巴细胞全基因组染色质可及性图谱

本文介绍了一种无需饲养层细胞的分化系统，用于大规模制备基因沉默的小鼠自然杀伤细胞，以进行机制研究 体外 和 体内.

一种无需饲养层的鼠源自然杀伤细胞大规模生产新系统 体外

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

本文介绍了一种在活化的人类CD4+淋巴细胞上进行转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）的实验方案。通过引入一种新的裂解缓冲液，该方案经过优化，可将线粒体DNA读段的污染从50%降至3%。...

线粒体DNA污染低的原代人CD4+ T淋巴细胞ATAC-seq检测

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。...

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

本研究概述了两种从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。一种方法结合使用商业化的中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心法，另一种方法仅采用密度梯度离心法。这两种方法获得的功能性NETs均优于外周血中性粒细胞来源的NETs。...

分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。...

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

学习小鼠骨髓中性粒细胞ATAC-Seq文库制备方法，通过免疫磁珠分选获得高纯度细胞，优化染色质可及性分析流程，助力免疫表观遗传学研究及疾病治疗靶点发现。

小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

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