Name: 基因枪子弹的制备和神经元的基因枪转染切片文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: 学习基因枪转染技术，制备DNA包被金颗粒子弹，用于大鼠海马切片培养中神经元的生物弹道转染。该方法可实现少量细胞的高效转染，便于荧光显微镜下观察单个神经元形态。

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我们感谢 Mark Lucanic 和 Hwai-Jong Cheng 在获取本视频中展示的全海马切片低倍图像方面提供的帮助。我们还感谢 Sarah Parrish 在协助撰写视频配套文字方面给予的支持。

基因枪转染实验方案
制备子弹
微弹在6个月内效果良好，但在2至3个月后转染效率可能开始下降。微弹应与干燥剂小球一同保存于4°C。在打开储存微弹的闪烁瓶之前，务必让其恢复至室温。
开始之前，请准备好以下物品：
<ul>
<li>亚精胺（0.05 M）</li>
<li>CaCl2（1 M）</li>
<li>乙醇（100%，高纯度，未开封瓶装）</li>
<li>高压灭菌 H2O</li>
<li>待转染的 DNA</li>
<li>聚乙烯吡咯烷酮（PVP-20 mg/ml 储存液）</li>
<li>2 个 15 ml 锥形管（每组子弹头实验配备 2 个）</li>
<li>导管（剪成约 30 英寸长，每组子弹头实验配备 1 根）</li>
<li>闪烁瓶（每组子弹头实验配备 1 个）</li>
<li>干燥剂颗粒</li>
<li>10 ml 注射器，末端连接导管</li>
</ul>
准备管路：
<ol>
<li>在管路站中用 N2 气体（0.4 压力）干燥约 30 英寸的管路（右侧 O 形圈外延伸约 2 英寸），至少 20 分钟。</li>
</ol>
在金珠上沉淀 DNA：
<ol>
<li>在微量离心管中准备用于转染的 DNA，总体积为 50 μL（DNA 总量不超过 50 μg）</li>
<li>称取 6–8 mg 金粉并转移至微量离心管中</li>
<li>向金粉中加入 100 μL 0.05 M 亚精胺，并超声处理 20 秒</li>
<li>将 50 μL DNA 加入金粉/亚精胺混合物中</li>
<li>涡旋振荡（约设置为 5 档），管盖保持打开</li>
<li>逐滴加入 100 μL 1 M CaCl2</li>
<li>短暂超声处理（&lt; 5 秒）</li>
<li>室温下静置沉淀 10 分钟</li>
<li>短暂超声处理</li>
</ol>
在超声处理期间配制聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液：
<ol>
<li>在15 ml离心管中配制稀释的PVP溶液，每组弹丸使用3.5 mL稀释PVP（将7.5 μL的20 mg/mL PVP储备液加入3.5 mL 100% EtOH中）</li>
</ol>
用乙醇冲洗金珠：
<ol>
<li>将金珠在微量离心机中以最大速度离心10秒</li>
<li>弃去上清液，但保留少量液体覆盖在金珠表面</li>
<li>用1 ml乙醇洗涤3次，每次可短暂超声处理（如有必要）</li>
</ol>
在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中重悬金/DNA复合物：
<ol>
<li>将金沉淀物重悬于 200 μL 的 3.5 ml 稀释 PVP/EtOH 溶液中</li>
<li>涡旋振荡使金沉淀物重悬（必要时可短暂超声处理）</li>
<li>将 200 μL 金/PVP 溶液转移至新的 15 mL 锥形管中</li>
<li>以此方式继续操作，每次加入 200 μL PVP 溶液，直至所有金颗粒均转移至 15 mL 锥形管中，最终体积为 3.2 mL</li>
</ol>
包被导管：
<ol>
<li>关闭管路站的 N2 气体，取下已干燥的管路</li>
<li>将干燥的管路连接到 10 ml 注射器上</li>
<li>用力振荡装有金/PVP 溶液的 15 mL 锥形管</li>
<li>将管路末端插入金/PVP 溶液中，缓慢吸取溶液，注意避免产生气泡</li>
<li>管路两端各留出约 2 英寸的干燥部分</li>
<li>保持管路连接在注射器上并充满金/PVP 溶液，小心地将管路重新放回管路站</li>
<li>标记管路两端溶液液面的位置</li>
<li>让金颗粒沉降 5 分钟，期间保持注射器连接</li>
<li>缓慢拉动注射器吸取溶液，使已沉降的金颗粒留在管底（注意不要反向冲洗）</li>
<li>断开注射器连接</li>
<li>旋转 90°，静置 2 秒</li>
<li>再旋转 180°，继续静置 2 秒</li>
<li>旋转管路 5 秒</li>
<li>打开 N2 气体，调节阀门至 0.4 - 0.5，同时旋转镀金管路，干燥 5 分钟</li>
</ol>
切割导管：
<ol>
<li>从管路预处理站取下管路，并在标记处剪去两端。</li>
<li>将一个贴好标签的闪烁瓶放在管路切段器下方，用于收集切割后的管段。</li>
<li>将管路放入管路切段器中，使用洁净的剃刀进行切割。</li>
<li>在闪烁瓶中放入干燥剂颗粒。</li>
<li>将管段在 4°C 下保存。</li>
</ol>
射击组织切片
在轰击培养的组织切片时，应采用相对无菌的技术，以避免污染。请注意，&nbsp;当轰击两种不同构建体时，可将两组微弹加载到同一个载弹夹中，但在不同构建体之间必须更换枪管衬管和筛网。
开始之前，请准备好以下物品：
<ul>
<li>DNA 微弹（使用前让闪烁小瓶恢复至室温）</li>
<li>组织切片</li>
<li>Helios 基因枪</li>
<li>连接基因枪软管的氦气罐</li>
<li>弹匣 holder</li>
<li>已安装塑料 O 型圈的枪管衬管</li>
<li>扩散器（已改装）</li>
<li>扩散屏</li>
<li>镊子</li>
</ul>
准备基因枪：
<ol>
<li>用镊子将镀金的塑料弹夹放入弹夹架中。</li>
<li>将弹夹架装入基因枪时，先向后推动锁扣。</li>
<li>用锁扣固定弹夹架。</li>
<li>取一个带有O形圈且扩散屏已牢固安装的枪管衬管。</li>
<li>将枪管衬管旋入基因枪中。</li>
</ol>
使用基因枪轰击培养的脑片：
<ol>
<li>戴上耳罩</li>
<li>将基因枪插入连接氦气罐的软管</li>
<li>将气罐压力调至 180 PSI</li>
<li>向空中发射一次空弹，以清除扩散屏上的灰尘或碎屑。发射前，先按下安全联锁按钮，直到基因枪发出蜂鸣声，然后扣动扳机。</li>
<li>发射空弹后，从培养箱中取出脑片</li>
<li>将基因枪移至第一个构造位置</li>
<li>发射时，使扩散屏距离脑片约 0.5 - 1 英寸</li>
<li>在各孔之间移动弹匣</li>
<li>完成最后一孔的轰击后，将脑片放回培养箱</li>
<li>在将基因枪从氦气管上拆下前，关闭气体并释放压力</li>
<li>拧下枪管衬管，取出弹匣和已使用的弹壳</li>
</ol>
清洗柱芯套管和柱管内衬：
<ol>
<li>将弹匣、筒衬管和扩散屏放入盛有肥皂水的烧杯中</li>
<li>将烧杯放入超声波清洗机中，超声处理20分钟</li>
<li>用清水彻底冲洗，直至完全去除肥皂残留物</li>
<li>在70%乙醇中浸泡1小时</li>
<li>置于干燥的纸巾上过夜晾干</li>
<li>清洁后的弹匣、筒衬管和筛网即可在后续的基因枪转化实验中重复使用</li>
</ol>
基因枪转染实验的故障排除技巧
基因枪转染有时可能导致转染条件不理想。&nbsp; 可能导致转染的细胞过少或过多、表达水平过高或过低，或导致组织切片整体状态不佳。组织切片状态不佳通常由高压气流冲击引起。&nbsp;以下是一些获得最佳转染组织切片的建议。
如果切片看起来不健康（或如果 太多 细胞被转染/切片时，可尝试：
<ul>
<li>增加射击距离</li>
<li>降低气罐压力</li>
<li>减少金的用量</li>
<li>切除 Bio-Rad 扩散器的中心部分，并用扩散屏替换中心部分。</li>
</ul>
如果转染的细胞数量过少，可尝试以下方法：
<ul>
<li>缩短射击距离</li>
<li>增加气体罐压力</li>
<li>增加金的用量</li>
<li>增加每孔组织切片数量</li>
<li>确保枪管衬里中的O形圈完好无损。</li>
</ul>
如果在同一次拍摄中获得的切片同时存在转染细胞过多和转染细胞过少的情况，请务必确保：
<ul>
<li>确保枪体对称地置于孔上方</li>
<li>金均匀地包被在导管内壁。（如果出现金线现象，在金颗粒沉降后应加快从导管中吸出上清液的速度，并在通氮气前延长旋转混匀时间。反之，如果出现金 streaking（金 streaking），可能是由于制备子弹过程中湿度过高所致：请确保使用未开封的乙醇（EtOH）试剂瓶，导管在包被前已彻底干燥，并及时盖紧瓶盖及完成子弹的制备）</li>
</ul>
如果转染效率似乎最佳（转染细胞数/切片），但表达水平过高或过低：
<ul>
<li>调整 DNA 与金的比率。&nbsp;（例如，如果比率过低，则保持金的量不变，但增加 DNA 的量。）</li>
<li>调整射击后至数据采集之间的时间长度</li>
</ul>
在进行双重转染时，如果其中一个构建体的表达量过低，应适当调整两种构建体的转染比例，并确保两个构建体使用相同的启动子，以避免一个启动子竞争性地抑制另一个启动子的活性。

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

基因枪转染是一种通过高速将DNA包被的金颗粒轰击活体组织来实现细胞转染的物理方法。在颗粒介导的基因转移过程中，通常当微弹最终停留在细胞核内时，即可实现细胞的转染。尽管目前已存在多种转染方法，如显微注射、脂质体转染、磷酸钙转染、电穿孔和病毒转染等，但基因枪转染可作为一种劳动强度较低且高效的替代方案，尤其适用于那些难以通过上述其他方法进行转染的细胞。事实上，该技术最初是为植物基因转移而开发的，因为植物细胞壁的存在使得传统方法难以实现有效转染1。类似地，由于终末分化神经元极难转染，基因枪技术在神经生物学领域也逐渐受到重视2,3。特别是，在旨在研究完整脑片中单个神经元精细形态的实验中，该技术被广泛认为是主要的转染手段。本文所述方法详细而全面地介绍了如何使用手持式基因枪（Helios Gene Gun系统；Bio-Rad）对培养的脑片进行基因枪转染。
基因枪转染已成为脑片培养中转染神经元的首选方法，因为它能够在整个脑片中实现少量细胞的转染。通过这种方式，可以单独观察单个神经元。由于该技术特别适用于脑片中神经元的转染，因此常与双光子显微镜结合使用，因为双光子激发能够对光散射组织深层中的荧光标记细胞进行可视化成像4。事实上，本视频中展示的单个锥体神经元的高倍放大图像，均使用定制的双光子激光扫描显微镜采集。总之，基因枪转染是一种在高密度周围细胞环境中高效转染单个细胞的方法，因此在神经元脑片培养中对单个神经元进行荧光标记方面已被证明极为有用。

<table><tbody><tr><td>1.6 μm 金颗粒（微载体）</td><td>0.25 g</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl₂</td><td></td><td>Fluka</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>1品脱</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡式管路</td><td></td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652412</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>20毫升，每箱500个</td><td>VWR 国际公司</td><td>66021-668</td><td></td></tr><tr><td>干燥颗粒</td><td>&amp;#8221;Dricap&amp;#8221; </td><td>MTI（800-445-9890）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>model 50T</td><td>VWR 国际</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡式盒支架</td><td>5个装</td><td>Bio-Rad</td><td>1652426</td><td></td></tr><tr><td>枪管内衬</td><td>5个装</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652417</td><td></td></tr><tr><td>扩散屏</td><td>5个装</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652475</td><td></td></tr><tr><td>O形圈</td><td>75 个氟橡胶（Viton），007 型，数量：100</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>筛网（网孔）</td><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>144258</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮 </td><td>20 mg/ml，溶于乙醇</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td>配备伯乐（Bio-Rad）的管路</td></tr><tr><td>管路预处理工作站</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1652418</td><td></td></tr><tr><td>管子切割器</td><td></td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652422</td><td></td></tr><tr><td>Helios 基因枪</td><td></td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652411</td><td></td></tr><tr><td>基因枪软管 </td><td></td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td>附带基因枪</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>5g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s-0266</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">尽管我们已将所有产品分别列出，但批量购买更为经济 &quot;Helios基因枪系统&quot;，包含上述 Bio-Rad 公司列出的所有产品（货号 # 165-2431）。</td></tr></tbody></table>

基因枪弹丸的制备及脑片培养中神经元的基因枪转化

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

基因枪转染是一种通过高速DNA包被微粒轰击组织来实现细胞转染的物理方法。本文提供了大鼠海马脑片基因枪转染的详细实验方案，内容涵盖从DNA包被微粒的制备到使用基因枪对脑片组织进行轰击的全过程。基因枪转染是一种高效且简便的神经元转染方法，特别适用于在脑片组织中对少量细胞进行荧光标记。本视频中，我们首先介绍将DNA包被到金微粒上的具体步骤；随后演示如何将金微粒/DNA混合物均匀涂布于塑料管内壁，并如何切割该塑料管以制备可用于装载至基因枪中的塑料弹夹；最后，我们对大鼠海马脑片进行基因枪转染操作，展示Bio-Rad Helios基因枪的使用方法，并提供相关故障排除建议，以获得健康且转染效果最佳的脑片组织。

基因枪转染，DNA包被微粒，金微粒，脑片培养，海马，神经元转染，荧光标记，Bio-Rad Helios

我们介绍了一种制备DNA包被金微粒的方法，并展示了利用此类微粒对培养的海马脑片中的神经元进行基因枪轰击转染的技术。

基因枪转染是一种通过高速DNA包被微粒轰击组织来实现细胞转染的物理方法。我们提供了一种详细的……

基因枪转染是一种通过用高速DNA包被的微粒轰击组织来穿膜转染细胞的物理方法。该技术是转染神经元的一种高效且简便的方法，尤其适用于仅需转染组织切片中少量细胞的情况。例如，在荧光显微镜研究中，旨在观察完整切片中神经元形态的研究。Bic转染有助于在未转染细胞的清晰背景下观察单个神经元。在本视频中，我们演示了一种制备DNA包被基因枪弹丸的方法，并对海马体脑片培养物进行Bic转染。大家好，我是Georgia Woods。我是加州大学戴维斯分校Karen Zito博士实验室的一名研究生。今天我将演示如何制备DNA包被的微粒以及如何对大鼠海马脑片进行基因枪转染（Bic转染）。Bic转染的基本步骤包括：首先，用待转染的DNA包被金颗粒；其次，将包被了金颗粒的混合物涂布于塑料管内壁。将管材切割成弹夹，装入基因枪中，并进行四次射击，以转染目标组织。现在让我们开始。在准备进行转染之前，我们首先需要制备DNA包被的微弹。这需要将待转染的DNA质粒包被在1.6微米的金颗粒表面。在轰击过程中，单个金颗粒将作为“子弹”穿透细胞，从而实现转染。因此，首先我们需要准备待转染的DNA。理想情况下，每套基因枪微粒的总反应体积为 50 微升水溶液中，所用 DNA 量应少于 50 微克。需要注意的是，每种构建体所需 DNA 的确切用量应通过实验确定，以获得最佳表达水平。现在我们已准备好 DNA 分装样品，接下来需要将精胺加入金微粒中。向八毫克预先称重的金中加入100微升精子、meine，然后超声处理，约20秒。这是精子。Meine 是一种多胺，可使金带正电，从而与带负电的 DNA 相互作用，而带正电的金属则促进这一过程。在第22次超声处理后，将50 µL DNA水溶液加入金颗粒中。一旦DNA被加入珠粒，需在涡旋的同时逐滴加入100 µL氯化钙，氯化钙会导致DNA沉淀。短暂涡旋后，让溶液沉淀10分钟。10分钟沉淀后，在台式离心机中将DNA和金颗粒全速离心30秒。第32次高速离心后，用移液器吸除大部分上清液，但避免吸起金沉淀。此时，我只是去除未在金颗粒上沉淀的DNA。然后将金颗粒用一毫升全新的乙醇洗涤并进行短暂超声处理。一旦DNA沉淀，往往会促使金颗粒发生团聚，轻微的超声处理可打散这些金颗粒团块。但需注意避免过度超声导致DNA剪切。再次离心收集金颗粒，并用移液管吸除乙醇。重复乙醇洗涤步骤两次。第三次乙醇洗涤后，加入200 µL稀释的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液并进行超声处理。将包被的金颗粒迅速转移至已含有200微升稀释PVP溶液的15密耳锥形管中。PVP是一种溶剂，可促使金颗粒黏附于所用塑料管壁上。下一步，向epi管中加入200微升PVP，以去除epi管内残留的金珠。然后短暂涡旋混匀，并转移至15 mL离心管中。重复此步骤，直至所有金颗粒完全转移至15 mL离心管中。将剩余的PVP溶液一并转移，使金颗粒最终重悬于3.2 mL的PVP乙醇溶液中。现在我们准备对塑料管进行包被，该塑料管将用于装载基因枪弹丸，并在装入基因枪时使用。由于金颗粒已包被上DNA，我们需要用这些金颗粒在塑料管内壁上形成一层内衬。这种带有金颗粒包被的塑料管将被实际装入基因枪的管腔中。开始操作，剪取一段导管，使其长度超过O型圈约两英寸。将导管放置于导管预处理装置后，调节压力阀，使流量计读数约为0.4。使用氮气提供无水环境以干燥导管，干燥时间约为20分钟。最好在用 DNA 涂覆金弹的过程中同时进行此干燥步骤，如前一步所示。这样，管道在完成时将已干燥，并可立即用于涂覆。现在管道已干燥，且金颗粒已涂覆 DNA，可开始制备金微粒。在将金-PVP溶液注入管路之前，先关闭N two工作站，从工作站上取下干燥的管路，并将其连接到10 mil注射器上，然后吸取PVP和金溶液进入管路。充分振荡溶液后，立即将其吸入干燥的管路中，避免产生气泡。同时注意不要将溶液吸入注射器内。在导管中充满PVP金溶液后，小心地将导管放回N二站。将注射器保持连接状态，静置五分钟，使金颗粒沉降到导管底部。在溶液沉降后的位置标记导管的两端。待溶液静置后，使用连接的注射器可在管壁底部观察到一条金色条纹。缓慢吸走上清液，注意不要反向冲洗或断开管路。接下来需要旋转并干燥管路，使金均匀附着在管路内壁。首先，将管子旋转90度。静置两秒。然后再次旋转180度，并再静置两秒。旋转五秒，最后打开 N2，使读数在 0.4 到 0.5 之间，并在管路干燥的五分钟内保持旋转。五分钟后，金粉已干燥，我们需要将管路切割成可装入基因枪的弹药筒。现在我将把管路切成约半英寸长的段，以制成适合装入基因枪筒内的壳体。为了收集外壳，将密封的模拟胆汁置于切割刀下，在标记处用干净的剃刀切割管路，然后将管路放入管路切割器中，切成合适的长度。只需将管路向前推进，直到感到阻力，然后进行切割即可。将导管切割并收集到闪烁瓶后，在闪烁瓶中放入一片干燥剂。这些干燥剂在六个月内有效，但在两到三个月后可能会开始出现转染效率下降的情况。因此，建议在闪烁瓶上标注构建体名称和日期。制备好的基因枪微粒可立即使用，也可在4摄氏度下保存。若使用在4摄氏度下保存的微粒，请在打开冻存管前将其置于室温下回温约15分钟，以防止微粒吸收水分。现在我们已准备好使用基因枪射击DNA微粒。现在子弹制备完成，我准备开始对细胞进行基因枪转染。我将使用伯乐公司（BioRad）的Helios基因枪，轰击大鼠海马脑片，这些脑片自解剖后已在体外培养5天。基因枪将连接至氦气钢瓶。当发射枪击发时，储气罐产生的短暂压力脉冲会推动金颗粒射向切片。通常情况下，当金颗粒最终嵌入细胞核内时，该细胞即被转染。由于我正在对培养的脑片进行切片操作，因此在整个Bic转染过程中采用相对无菌的技术，以避免污染。待弹匣恢复至室温后，打开轰击小瓶，将镀金的塑料弹匣放入弹匣架中。然后将弹匣架装入基因枪内，首先向后推动气缸锁。现在需要将枪管衬管连接到喷枪上。首先，确保O形圈已安装在枪管衬管内，并且扩散屏固定牢固。扩散屏的作用是分散来自枪管的压力，使金颗粒喷出时更加均匀地分布在孔内。将枪管衬管完全拧入基因枪中。当射击两种不同构建体时，两组微弹可加载至同一弹匣支架内，但不同构建体之间必须更换枪管衬管和筛网。此时基因枪已准备就绪，可连接至氦气源。将基因枪插入连接至氦气罐的软管中，应能卡入到位，然后将气罐压力调至180 PSI。此时基因枪已准备就绪，但在射击前，请务必佩戴听力保护装置，并为清除扩散屏上的任何灰尘或碎屑，先进行一次空射。首先，按下安全联锁按钮，直到枪发出蜂鸣声，然后扣动扳机。现在我们已准备好射击切片。射击空白样本后，从孵育器中取出切片。在进行海马体解剖时，我们将四个切片放置于每个孔中，并将其排列成位于膜中央附近、边长为两厘米的正方形的四个角。使用漫射屏对每个孔进行拍摄，漫射屏距离切片约半英寸至一英寸。根据所用载体的不同，转染细胞通常可在一至五天内进行观察。所有孔板完成轰击后，关闭气源并在将基因枪从氦气管上拆下之前释放压力。取出弹匣和已使用的弹壳。拧下枪管衬管，将弹匣、枪管衬管和筛网放入肥皂水浴中，超声处理20分钟，然后用清水彻底冲洗，再在70%乙醇中浸泡1小时，最后置于干燥的纸巾上过夜晾干。清洁后的弹匣和筛网可在后续的生物转染中重复使用。现在让我们来看一些转染结果。即使是标准的海马脑片制备，其转染效率也可能存在较大差异，具体取决于所使用的微弹和脑片。通常，为了获得清晰分离的转染神经元，相对较低的转染效率是可取的。此外，当转染细胞过多时，脑片的整体健康状况在最佳条件下也会受到影响。通常每片脑片少于20个细胞，但同一孔中的其他脑片最终可能会含有更多的细胞。转染及其他切片最终获得的细胞数量会较少。不同切片间转染效率的不一致，通常是由于切片相对于枪管的位置不对称，或包裹在管壁上的金粉分布不均、集中于一侧所致。若转染细胞过多，可尝试增加射击距离、降低射击压力，或减少用于制备微弹的金粉量。在此可以看到转染的CA1区锥体神经元的一个极佳示例。在该特定细胞中，我们可以观察到一个金颗粒嵌入细胞内。这是转染神经元的放大图像。在CA1区，有时轰击可能导致脑片状态不佳。通常，组织切片的损伤是由压力冲击造成的。Helios基因枪系统配备的扩散器中心带有一个金属十字。我们切除了内部的金属十字，改用金属筛网替代该十字结构。我们将筛网裁剪得略大于衬管末端，然后将其夹在衬管末端与切割后的扩散器之间。我们发现这样做可改善切片的健康状态。此外，为了针对不同的实验制备条件进行优化，最佳射击条件会因实验制备而异，需调整氦气罐的压力以及射击时与样品的距离。最后，如果你希望使用两种不同的质粒进行共转染，请确保这两种质粒由相同的启动子驱动。这样可避免一个启动子竞争性地抑制另一个启动子的表达。我刚刚向你演示了如何制备基因枪微粒以及如何利用BIC转染法对海马脑片进行转染。这是一种极为强大的方法，可用于对可被单独成像的单个神经元进行形态学研究。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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直接将cDNA注入细胞核是一种有效的转染技术，适用于终末分化细胞。该方法可在单个或多个cDNA构建体中实现高水平的异源蛋白表达，并可在多种单细胞检测体系中于生理相关环境中研究蛋白功能。...

成年哺乳动物离体神经元的核内DNA显微注射

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。...

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

为了快速评估基因在大脑皮层发育过程中的功能，我们描述了涉及以下内容的方法 离体...

神经元形态发生研究方法 离体 胚胎小鼠大脑皮层中的RNAi电穿孔技术

来源：Keener, D. G., et al. 在不同类器官型脑片培养中对小鼠海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元进行单细胞电穿孔。J. Vis. Exp.

通过单细胞电穿孔在小鼠海马脑片培养中实现基因表达

本视频展示了在多种体外海马脑片培养物中，对兴奋性和抑制性神经元进行单细胞电穿孔转染基因的实验方案。该技术可用于研究神经元的特定分子和生理功能，包括细胞自主机制以及跨突触蛋白相互作用。...

脑片器官型培养中的单细胞电穿孔：一种在体外将质粒递送至脑海马切片中特定神经元的实验技术

来源：Denaxa, M., et al.，化学遗传学改造的皮层中间神经元前体移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

近年来，脑组织切片培养技术的进步使其在生物技术应用中得以广泛利用。脑组织切片能够保持局部结构特征 体内 生物学，包括功能性突触连接。本文介绍一种区域选择性的基因枪递送方法，用于标记并进行遗传学操作这些脑片。...

使用改良基因枪在脑组织切片中实现区域选择性基因枪轰击

本文介绍了一种单细胞电穿孔技术方案，可用于在不同体外培养年龄的海马脑片中，向兴奋性和抑制性神经元递送基因。该方法可实现单个细胞中基因的精确且高效的表达，可用于研究细胞自主性及细胞间功能。...

小鼠海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元在不同脑片培养体系中的单细胞电穿孔

学习基因枪转染技术，制备DNA包被金颗粒子弹，用于大鼠海马切片培养中神经元的生物弹道转染。该方法可实现少量细胞的高效转染，便于荧光显微镜下观察单个神经元形态。

基因枪弹丸的制备及脑片培养中神经元的基因枪转化

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