优化 体外 使用色谱在线监测进行mRNA生产中的转录反应

我们开发了一种快速色谱方法，可分离体外转录（IVT）反应组分，用于监测核苷三磷酸（NTP）消耗和mRNA生成。利用该方法，我们能够优化IVT反应，在最大化mRNA产量的同时，减少工艺杂质的形成并降低反应成本。我们的方法在mRNA领域具有开创性，展示了如何通过整合IVT反应的分析数据来实现更高产量和更低成本。

目前，该领域正在探索其他在线过程分析工具，例如拉曼光谱法，但色谱法由于其强大的分离能力和高速度，仍然占据着关键地位。我们展示了如何结合实验设计软件使用高通量分析工具，对体外转录（IVT）反应进行全面优化。该方法实现了迄今为止报道的最高IVT反应产率，达到每升25克。

我们的方法能够在较短的读出时间内同时监测 mRNA 和 NTP 的浓度，因此适用于近实时的体外转录（IVT）监测。目前 mRNA 领域正朝着连续化生产的方向发展，我们当然也在开发下一代工具以支持这一转变。首先，除酶类外，将所有试剂在设定为 300 转/分钟的恒温金属块中于 37 摄氏度解冻并预热 15 分钟。

用指定的体外转录（IVT）编号和时间点标记每根试管。在试剂解冻的同时，用移液器将两微升 100 毫摩尔/升 EDTA 加入 0.5 毫升无菌试管中。随后从冷冻箱中取出酶，并暂时存放在冷藏容器中。

使用适量的体外转录（IVT）试剂配制50至100微升的反应混合液。当所有IVT试剂混合后，最后加入T7 RNA聚合酶。立即吸取2微升IVT混合液，移入预先准备好的含有2微升EDTA的0.5毫升离心管中。

将含有体外转录（IVT）混合物的反应管放入热循环块中，在 37 摄氏度下孵育。在每个预定时间点，从反应混合物中取出 2 微升 IVT 样品，用移液器转移至含有 EDTA 的试管中。在色谱分析确认 NTPs 完全耗尽后，加入 EDTA 终止大规模 IVT 反应，使 EDTA 的终浓度为 50 毫摩尔。

对于补料分批体外转录（IVT）反应，需混合各种NTP和氯化镁的储备液。反应开始后，当NTP浓度降至初始值的10%以下时，向总体IVT反应体系中加入适量的补料溶液。当达到预期的mRNA产量后，加入EDTA至终浓度为50毫摩尔，以完全终止整个反应。

进行色谱柱预处理时，分析前在室温下对0.1毫升分析柱平衡12小时。按照色谱柱外壳上指示的方向将色谱柱连接至色谱系统。随后，以每分钟1毫升的流速，先用50倍柱体积的重蒸水冲洗色谱柱，再用50倍柱体积的MPA冲洗。

然后，在分析前至少运行三个空白样品，仅注入 MPA 以建立基线。接下来，分析系统适用性测试样品和标准曲线样品。对于系统适用性测试，将加帽试剂 NTPs、质粒 DNA 模板和 mRNA 混合。

现在使用已知浓度的稀释纯化mRNA样品与流动相A配制校准标准品。如有需要，可配制终浓度分别为0.5、2、5、10、15和20微摩尔的NTP标准品，用于生成所有NTP的校准曲线。使用公式确定IVT样品所需的最小稀释倍数。在进行色谱分析前，将终止反应后的IVT样品涡旋混匀并离心沉降。

将MPA和氯化钠用移液器加入锥形玻璃小瓶中，然后加入淬灭的体外转录（IVT）样品。涡旋混匀制备好的样品，并将其装入设定为4摄氏度的自动进样器中。将25微升稀释后的样品注入分析柱，并在260和280纳米波长下测定每个IVT样品的吸光度。

完成所有体外转录（IVT）样品的分析后，再次进样系统适用性测试标准品，以确认系统的稳定性。快速在线分析可实现对mRNA随时间生成过程的监测。在本实验中，我们比较了IVT缓冲液组成对IVT反应动力学的影响。

使用缓冲液A进行的体外转录（IVT）产生mRNA的速率最高，其次是缓冲液B和缓冲液C。IVT反应也可采用补料分批（Fed-Batch）方式进行。通过监测核糖核苷三磷酸（NTPs）的消耗情况，可向反应体系中补充NTPs和氯化镁以调节其浓度。由于补料会稀释IVT反应体系，每次补料后IVT反应中的mRNA浓度均会下降。