Name: 使用色谱旁在线监测优化用于 mRNA 生产的 体外 转录反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习使用色谱旁在线监测技术优化体外转录反应，实现mRNA高效生产。该方法可同时监测NTP消耗与mRNA浓度，帮助研究人员提高产量并降低生产成本。

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作者谨此感谢 Tomas Kostelec、Blaž Bakalar、Nejc Pavlin、Andreja Gramc Livk 和 Anže Martinčič Celjar 富有启发性的讨论。

1. 缓冲液配制
注意：所有缓冲液必须以无 RNase 的方式配制，即所有化学试剂和玻璃器皿必须专用于无 RNase 的实验操作，并谨慎处理。用于缓冲液配制和玻璃器皿清洗的水必须经认证为无核酸酶。在开展实验前，所有工作表面和玻璃器皿必须喷洒可去除 RNase 的去污试剂。使用玻璃器皿或工作区域前，必须用无 RNase 的水将去污试剂彻底冲洗干净。如有可能，应使用无菌且一次性耗材。
<ol>
	<li>体外转录（IVT）缓冲液的制备：通过加入400 mM Tris、10 mM DTT、20 mM 亚精胺，调至pH 7.9，配制10x IVT缓冲液。配制含100 mM EDTA、pH 8.0的终止缓冲液。将每种缓冲液均经0.22 µm PES滤膜过滤。</li>
	<li>流动相的制备：加入50 mM HEPES、pH 7.0配制流动相A（MPA）；加入50 mM HEPES、100 mM Na4P2O7、pH 8.3配制流动相B（MPB）；加入0.1 M NaOH、1 M NaCl配制流动相C（MPC）；加入0.5 M HEPES、pH 7.0配制流动相D（MPD）。每种缓冲液均经0.22 µm PES滤膜过滤。</li>
</ol>
2. 准备 体外 体外转录反应（IVT）
注意 1：体外转录（IVT）反应可以是批次反应，即所有试剂在反应开始时加入，待核苷三磷酸（NTP）耗尽或 mRNA 产量达到平台期后终止反应；也可以是补料批次反应，即在 NTP 耗尽后补充新的 NTP，从而进一步提高 mRNA 产量。IVT 反应中使用的线性化质粒 DNA（pDNA）模板可通过限制性内切酶切割质粒 DNA 中 poly(A) 序列下游的位点获得，也可通过 PCR 反应制备。无论采用哪种方法，反应后均需进行纯化处理，可选择层析法或商用 DNA 纯化试剂盒进行纯化。
<ol>
	<li>批量体外转录反应
	<ol>
		<li>将恒温混匀仪设置为 37 °C 和 300 rpm。解冻下列所列的所有试剂 表1 除酶以外的所有组分预热至37 °C，置于恒温金属块中。使用100 mM的ATP、CTP、UTP和GTP储备液配制25 mM的NTP混合液。</li>
		<li>在试剂解冻的同时，准备时间进程实验所需的样品分装。取0.5 mL无菌离心管，每管加入2 µL的100 mM EDTA。用指定的IVT编号（如IVT001、IVT002等）和对应的时间点（如0 min、15 min、30 min、60 min等）标记每根离心管。</li>
		<li>当试剂解冻并在37 °C下保温约15分钟后，从-20 °C冰箱中取出酶（T7 RNA聚合酶、焦磷酸酶、RNase抑制剂），并置于冷藏容器中，待使用完毕后及时放回冰箱保存。</li>
		<li>混合单个体外转录（IVT）试剂（酶除外）时，使用涡旋振荡器。酶类通过轻柔吹打混匀。</li>
		<li>按照实验设计设定的比例混合体外转录（IVT）试剂（例如，通用的IVT操作流程如下所示） 表1在1.5 mL离心管中进行。进行体外转录（IVT）优化时，最终IVT反应体系体积可在50–100 µL范围内调整。设计总IVT体积时，需考虑在时间进程实验中需取出的2 µL样品数量。确保所取样品总体积不超过总IVT体积的50%（例如，若每15分钟取样2 µL，持续3小时，则所取分装样品总体积为30 µL，因此IVT总反应体积至少应为60 µL）。</li>
		<li>小心混匀体外转录反应液，最后加入T7 RNA聚合酶。所有试剂加完后，通过上下吹打充分混匀体外转录反应液，切勿使用涡旋振荡器。</li>
		<li>在加入并混匀所有体外转录（IVT）试剂后，立即从离心管中吸取 2 µL IVT 混合物，移入预先准备好的含有 2 µL 100 mM EDTA 的 0.5 mL 离心管中（见步骤 2.1.2，0 分钟时间点）。</li>
		<li>将含有体外转录反应混合物的反应管放入热循环仪中，在 37 °C 下孵育。</li>
		<li>将计时器设定为所需的时间间隔（例如，15 分钟/30 分钟）。在每个时间点，从每份制备好的体外转录（IVT）反应混合物中取出 2 µL 样品，用移液器转移至预先准备好的含有 2 µL 100 mM EDTA 的离心管中（参见步骤 2.1.2）。这些分装样品将用于色谱分析（参见步骤 3）。</li>
		<li>在色谱分析确认NTPs完全耗尽后，加入EDTA终止大量IVT反应，使EDTA终浓度为50 mM（例如，30 µL IVT反应液中加入30 µL 100 mM EDTA）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>补料分批体外转录反应 
	注意：通过添加NTPs和Mg，可进一步提高mRNA产量2+ NTP 耗尽后的离子变化。
	<ol>
		<li>混合体外转录反应体系，并按照步骤 2.1 所述取样。制备 NTP+MgCl2 补料分批培养用的补料液。制备方法示例：500 µL NTP+MgCl2 混合物，加入每种200 mM NTP各106 µL和76.25 µL的1 M MgCl₂2 和 5.5 µL 的 ddH₂O2O. 混合物中的最终浓度为 42.4&#160;每种 NTP 各 mM 和 152.5 mM MgCl2.</li>
		<li>使用第3步中所述的在线分析方法监测NTP消耗情况。当在线分析确认NTP浓度降至起始浓度的10%以下时，加入含有NTP+Mg的补料2+ 进行大规模体外转录。</li>
		<li>测量/计算在取完所有用于分析的等分试样后，1.5 mL 离心管中剩余的体外转录（IVT）反应液的精确体积。向 IVT 反应液中加入适量的 NTP+MgCl₂ 混合液，使每种 NTP 的终浓度为 4 mM，MgCl₂ 的终浓度为 12 mM。2例如，对于1.5 mL离心管中剩余的80 µL大量IVT反应液，加入16.8 µL NTP+MgCl2 混合物</li>
		<li>按照步骤2.1中所述继续取样。当NTPs再次耗尽后，重复步骤2.2.2。持续进行补料和取样，直至达到目标mRNA产量。</li>
		<li>在达到所需的mRNA产量后，按照步骤2.1.10的方法使整个反应失活。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 色谱分析的准备
<ol>
	<li>标准品与系统适用性测试（SST）样品制备
	<ol>
		<li>通过混合加帽试剂、NTPs、pDNA 模板和 mRNA 制备 SST 样品。确保加帽试剂的终浓度约为 3 µM，每种 NTP 的终浓度为 5 µM，pDNA 模板的终浓度为 4 ng/µL，mRNA 的终浓度为 10 ng/µL。确保最终 SST 体系中含有 0.1 M NaCl。</li>
		<li>每次分析前均需制备新的标准曲线。通过将已知浓度的纯化 mRNA 样品用 MPA 稀释来制备标准品。标准点浓度应分别为 0.5 ng/µL、2 ng/µL、5 ng/µL、10 ng/µL、15 ng/µL 和 20 ng/µL，每种标准品的终浓度均为 0.1 M NaCl。</li>
		<li>如需要，为所有 NTPs 制备标准曲线。确保各 NTP 在标准品中的终浓度分别为 0.5 µM、2 µM、5 µM、10 µM、15 µM 和 20 µM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>色谱柱平衡与分析前准备
	<ol>
		<li>在分析前，将 0.1 mL 分析柱在室温下平衡 12 小时。将色谱柱按照柱管上标注的方向连接至色谱系统。</li>
		<li>以 1 mL/min 的流速冲洗色谱柱：首先用 50 柱体积（CV）的 ddH2O 冲洗，随后用 50 CV 的 MPA 冲洗。</li>
		<li>在正式分析前，至少运行 3 针空白样品（仅注入 MPA）以建立基线。采用 Skok 等人15所述的色谱方法。</li>
		<li>当基线稳定且连续两次空白测定结果相近（基线可重现）时，开始运行 SST 样品及标准曲线样品。</li>
		<li>若 SST 判定标准符合要求，且加帽试剂与 NTPs 的分离效果良好，则继续进行 IVT 样品的分析。在完成所有 IVT 样品分析后，再次注入 SST 标准品，以确认整个分析过程中系统条件保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备 
	注意：用于色谱分析的样品应在分析前立即制备。否则，样品应保存于 -20 °C 冰箱中（最长 24 小时）或 &#60;-65 °C（超过 24 小时）。
	<ol>
		<li>在进行色谱分析稀释前，对已淬灭的 IVT 样品进行涡旋振荡并离心。所有经 EDTA 失活的 IVT 样品（见步骤 2.1.9）均应采用 Skok 等人15所述方法进行色谱分析。</li>
		<li>分析前，将 IVT 样品稀释至标准曲线范围内。在整个时间进程实验中使用相同的稀释倍数，以确保可通过比较 NTP 峰面积判断 NTP 耗尽的时间点。</li>
		<li>为确定 IVT 样品所需的最小稀释倍数，使用以下公式：所需稀释倍数 = （预期终末 mRNA 浓度）/（失活过程中的稀释倍数）/（最高标准品浓度） 
		例如，若预期 IVT 反应中 mRNA 产量为 8 mg/mL，则淬灭后样品中浓度为 4 mg/mL。为使浓度落在标准曲线范围内，需进一步将样品稀释 200 倍。 
		&#8203;所需稀释倍数 = (8000 ng/µL) / 2 / (20 ng/µL) = 200</li>
		<li>将 MPA 和 4 M NaCl 移取至锥形玻璃小瓶中。确保样品中 NaCl 的终浓度为 100 mM。最后加入已淬灭的 IVT 样品。</li>
		<li>对制备好的样品进行涡旋振荡，并将其放入自动进样器中待分析。将自动进样器温度设置为 4 °C。</li>
		<li>将 100 µL 稀释后的样品注入分析柱。测定每个 IVT 样品在 A260 和 A280 处的吸光度。</li>
		<li>对于已知浓度的样品，或无需根据峰面积变化追踪 NTP 消耗的情况，可将样品稀释至目标浓度 10 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 样品定量与数据分析
<ol>
	<li>在对每个体外转录（IVT）样品进行峰面积积分前，需从样品色谱图中减去空白样品的信号。</li>
	<li>在A260处对所有NTP、pDNA和mRNA峰进行积分，并利用峰面积计算IVT反应中NTPs和mRNA的浓度。 
	注意：或者，若所有时间点的稀释因子保持一致，也可使用峰面积比较各NTP在IVT反应中剩余的百分比。</li>
	<li>根据在线色谱分析测定的mRNA/NTP浓度，判断是否可终止IVT反应，或是否需要向IVT反应中补充额外的NTPs（参见步骤2）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方法通过在孵育过程中于不同时间点取样，利用一种可分离核苷三磷酸（NTPs）、质粒DNA（pDNA）和信使RNA（mRNA）的多模式分析色谱柱对体外转录（IVT）样品进行分析，从而实现对NTP消耗和mRNA生成的密切监测。该方法基于指定时间点A260吸收峰面积的变化，以定量方式测定NTP和mRNA的浓度。由于该方法可提供NTP和mRNA浓度的信息，因此非常适用于IVT反应的优化——其主要目标通常是最大化mRNA产量并缩短反应时间；因此，理解不同IVT试剂对mRNA生成动力学的影响至关重要22。我们展示了如何应用在线监测技术来优化批次反应和补料批次反应模式下的IVT反应。
该方法的主要优势在于可进行在线分析，能够在不到8分钟的时间内完成每个样品的分析，从而实现对体外转录（IVT）过程的近实时监测。样品前处理简单，仅需用MPA稀释，无需其他预处理步骤。分析所需的样品体积非常小，例如仅需1 µL的IVT样品。如此小的移液体积可能因移液误差而引起分析偏差。然而，由于该分析方法具有高通量特性，可进行三次重复测量，因此异常值易于识别，且偏离预期动力学曲线的情况也较易察觉。
该方法的一个局限性是UTP和CTP在色谱上发生共洗脱。通常情况下，mRNA序列中的限速NTP往往是ATP或GTP，因此对UTP和CTP进行精确单独定量通常并非必要。如果需要分别定量UTP和CTP，可利用UTP与CTP在260 nm和280 nm处紫外吸光度的差异，推算出色谱峰中每种NTP的相对丰度。
该分析方法无法分离长度超过100个核苷酸的RNA种类；因此，不能用于检测mRNA质量的差异，例如，无法区分非多聚腺苷酸化与多聚腺苷酸化的mRNA、双链RNA（dsRNA）或截短转录本与单链RNA（ssRNA），也不适用于稳定性研究，因为它无法区分已降解和未降解的mRNA。然而，该方法可用于其他RNA形式的定量分析，例如circRNA、tRNA和saRNA。尽管这些分子在大小和结构上存在差异，但仍可采用相同的分析方法来研究其在体外转录（IVT）反应中的产量。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行推动了生物医学领域的空前变革，促使基于信使RNA（mRNA）的疫苗在欧洲和美国迅速研发并获得授权，例如拜恩泰科/辉瑞的Comirnaty和莫德纳的Spikevax1,2,3。这些疫苗展现出的显著有效性与快速开发能力，凸显了mRNA技术巨大的治疗潜力，其应用不仅限于传染病，还包括癌症免疫治疗、蛋白质替代疗法、再生医学以及细胞重编程等领域4,5。这一常被称为“mRNA革命”的时代，凸显了建立高效且低成本mRNA生产流程的迫切需求。
mRNA 的制备涉及多个单元操作，其中体外转录（in vitro transcription, IVT）反应是关键且成本最高的单元操作6,7,8。IVT 反应利用 RNA 聚合酶（通常为 T7 RNA 聚合酶）以及核苷三磷酸（NTPs），在镁离子存在下以 DNA 为模板合成 mRNA。该过程相对简单，可在短时间内大量生产 mRNA，数小时内即可实现 2–5 g/L 的反应产率，某些报道中最高可达 14 g/L9,10,11。然而，优化 IVT 反应产率对于降低生产成本、确保 mRNA 疫苗和治疗药物的可放大性至关重要12，并且由于不同序列对 NTP 消耗的影响，可能需要针对每种构建体或构建体家族单独进行优化。
该反应通常以分批方式进行，但近年来补料分批工艺和在线分析技术的进步为优化mRNA生产开辟了新的途径7,13。补料分批反应通过一次性或连续添加试剂，有望延长反应时间并提高产量，其机制在于防止底物抑制以及辅因子依赖性的产物降解14,15。
快速的旁线分析技术的开发是体外转录（IVT）领域的一项重要进展，能够以极短的分析延迟监测NTPs和mRNA等关键反应组分13,16，为体外转录（IVT）监测增加了额外维度，而该过程通常仅关注mRNA浓度17传统上，mRNA 的分析通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术。这些方法属于终点检测，因此无法用于体外转录（IVT）过程的实时监测。本方案中所述分析方法的替代方案包括使用荧光增强型 RNA 适配体与荧光染料配对的技术。在该方法中，将荧光增强型 RNA 适配体标记到 RNA 上，并与荧光增强染料共同孵育，通过检测荧光强度即可可视化转录活性。17这使得在体外转录（IVT）过程中能够实时分析转录出的mRNA的数量和质量21，但无法同时监测其他IVT组分，例如NTPs。另一种可能实现NTP和mRNA实时定量的替代方法是拉曼光谱法。18但迄今为止，尚无研究报告表明其在体外转录（IVT）监测中的有效性，提示该方法仍需进一步优化，以获得必要的选择性和灵敏度。
持续开发更快、更具选择性的分析方法，有助于优化体外转录（IVT）工艺，以提高分批和补料分批模式下的产量。该反应仍是一个复杂的多参数过程，涉及多个相互作用的因素，不同构建类型（例如 mRNA 与自扩增 RNA）的最适条件可能不同。Mg2+离子与核苷三磷酸（NTPs）的浓度及其比例尤为关键，必须精确平衡其最佳水平，以在最大化mRNA产量的同时，尽量减少双链RNA（dsRNA）的生成——dsRNA是先天免疫系统的强效激活剂19,20。最近有研究报道，通过在稳态水平下持续补充UTP可减少dsRNA的形成21。对UTP水平进行近实时监测将为工艺控制提供更进一步的保障。
在本方案中，我们展示了如何通过在线监测体外转录（IVT）反应，提高批次和补料批次模式下的mRNA产量。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m PES 膜过滤器，例如 Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 塑料管；例如 DNA LoBind，PCR 级洁净</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 塑料管；例如 DNA LoBind，PCR 级洁净</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP 溶液</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&amp;nbsp;</td><td>R1331T2</td><td></td></tr><tr><td>台式冷冻冰箱 -20 &amp;deg;C</td><td>Brand</td><td>114935</td><td></td></tr><tr><td>CIMac PrimaS 0.1 mL 分析柱（2 &amp;micro;m）</td><td>Sartorius BIA Separations</td><td>110.5118-2, 2 &amp;micro;m 通道</td><td></td></tr><tr><td>CTP 溶液</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&amp;nbsp;</td><td>R3331T2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 × 2H2O</td><td>Kemika&amp;nbsp;</td><td>例如 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>GTP 溶液</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&amp;nbsp;</td><td>R2331T2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 高回收小瓶</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>微量分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA 标准品，mFix4，4000 nt</td><td>Sartorius BIA Separations</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix mRNA 分析平台&amp;nbsp;</td><td>Sartorius BIA Separations</td><td>PAT0021</td><td></td></tr><tr><td>移液器 100 &amp;ndash; 1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>移液器 2 &amp;ndash; 10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>移液器 20 &amp;ndash; 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸酶</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&amp;nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away 去污染试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>10328011</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&amp;nbsp;</td><td>RNK3501</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 mRNA 聚合酶</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>恒温金属块（Thermoblock）</td><td>Thermo Scientific</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>UTP 溶液</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&amp;nbsp;</td><td>R5331T2</td><td></td></tr><tr><td>小瓶盖</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

优化 体外 使用色谱在线监测进行mrna生产中的转录反应

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

体外转录反应（IVT）是一种复杂的多组分酶促反应，由RNA聚合酶（例如T7）催化，以线性DNA为模板合成mRNA。由于IVT试剂成本较高，&#160;IVT是mRNA药物原液生产过程中的关键步骤，也是该领域重点优化的环节。为了降低mRNA生产的成本，必须对试剂进行最优利用。有效的优化需要全面了解各个试剂对反应动力学的影响，即核苷三磷酸（NTPs）的消耗和mRNA的生成情况。传统上，人们采用低通量、终点式的分析技术对mRNA进行分析。尽管这些方法能够提供有关mRNA含量的有价值信息，但要充分理解IVT反应过程，仍需采用在线或近实时的分析手段。我们展示了如何使用一种液相色谱分析方法，在近实时条件下同时分离NTPs、质粒DNA（pDNA）和mRNA，以研究IVT反应动力学。通过掌握不同IVT组分对反应动力学和产率的影响，可利用快速色谱分析将批次IVT反应转化为补料分批模式，从而进一步提高生产效率并降低反应的总体成本。

本方案中描述的色谱分析可用于体外转录（IVT）反应的优化，或用于将批量IVT反应转化为补料分批反应（图1）。
为了测试不同缓冲液组成对体外转录（IVT）反应动力学的影响，根据表2中描述的方案配制了三种不同的IVT反应体系。将使用HCl调节pH的Tris缓冲液与使用乙酸调节pH的Tris缓冲液进行比较。此外，将这两种Tris缓冲液与使用NaOH调节pH的HEPES缓冲液进行比较。所有1x IVT缓冲液的组成为40 mM Tris/HEPES、10 mM DTT、2 mM 亚精胺，pH值为7.9。
从100 µL的体外转录（IVT）反应混合物中，在孵育的第一小时内每15分钟取出2 µL IVT样品，并用2 µL 100 mM EDTA终止反应，之后每30分钟重复一次，直至孵育180分钟。该反应条件下预期的最终mRNA产量为15 mg/mL，这意味着由于终止反应导致的2倍稀释后，还需在MPA+NaCl中进一步稀释400倍用于分析。样品总体稀释倍数为800倍，表明即使在15 mg/mL的产量下，上样至分析型色谱柱的mRNA浓度仍处于标准曲线浓度范围内。
对每个单独样品在各个时间点（tx）的NTP和mRNA在A260处的峰面积进行积分。然后，利用mRNA标准曲线将峰面积转换为mRNA的浓度，并以0分钟（t0）时NTP在A260处的峰面积作为100%，计算NTP的消耗百分比（见下文公式）。
<img alt="用于核酸定量的剩余NTP百分比计算公式，显示吸光度值的比值。" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">
结果可以以每个体外转录（IVT）反应的曲线图形式展示，其中横轴表示时间，纵轴表示mRNA浓度和剩余的NTP含量（图2A）。所有IVT反应中mRNA浓度随时间变化的结果也可合并绘制在同一张图中，从而研究mRNA的生成动力学并筛选最优的IVT反应条件（图2B）。
在补料分批实验中，按照表3所述配制体外转录（IVT）反应液。从300 µL的IVT反应混合物中，每隔30分钟取出2 µL IVT样品，并用2 µL的100 mM EDTA终止反应。此外，在每次批量加入NTP和MgCl2后立即取样。预先配制一种补料溶液，其中含有每种NTP各42.4 mM以及152.5 mM MgCl2，配制方法为：将每种200 mM NTP的溶液各106 µL与76.2 µL的1 M MgCl2混合。设定补料程序，在孵育的第60分钟、120分钟、180分钟和240分钟时每次进行一次脉冲式补料。补料程序详见表3。样品采用与批量IVT反应相同的分析方法进行近实时分析。在监测300分钟后，终止IVT反应。
结果可以表示为孵育时间内的剩余NTPs/ mRNA产量。由于脉冲式补料添加也会稀释体外转录（IVT）反应体系，因此在每次补料添加时，IVT中的mRNA浓度都会下降（图3A）。mRNA质量的增加也可通过转录倍数（定义为mmRNA/mpDNA）进行测定和展示，显示mRNA产量随时间呈线性增加（图3B）。
<img alt="体外转录过程；色谱分离示意图；mRNA 分析；吸光度峰。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验流程示意图 (A) 体外转录（IVT）优化工作流程示意图，包含在线色谱分析对核苷三磷酸（NTPs）和mRNA的定量检测。（B) 批次体外转录反应在（i）反应起始时（t0）、（ii）反应中点、（iii）反应终点取样的代表性色谱图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="使用NTP和缓冲液的mRNA合成动力学与浓度图；随时间变化的数据趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：体外转录（IVT）批次反应图。（A）IVT反应的代表性曲线图，纵轴显示mRNA生成量和NTP消耗量。在孵育120至180分钟时，mRNA浓度达到平台期，这与NTP的消耗相关，其中限制性NTP（ATP）在120分钟时基本耗尽。（B）显示IVT缓冲液对IVT反应动力学影响的曲线图。含有缓冲液A（Tris+乙酸）的IVT反应mRNA生成速度最快，其次是缓冲液B（Tris+HCl），缓冲液C（HEPES+NaOH）最慢。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="mRNA 合成速率；图 A：核苷酸浓度随时间变化，图 B：mRNA 产量随时间变化，动力学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：补料分批体外转录（IVT）图示。（A）在 60、120、180 和 240 分钟时补加 NTP+MgCl2 的 IVT 曲线。由于加入 NTP+MgCl2 补料导致稀释，IVT 反应中 mRNA 浓度在每次补料后均下降。（B）转录因子介导的 mRNA 质量增加在整个反应孵育过程中呈线性增长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
表1：通用体外转录（IVT）方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：体外转录批量制备方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：补料分批IVT方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

优化 体外 体外转录（IVT）对于经济高效地生产mRNA至关重要。本方案详细描述了一种用于IVT反应在线分析的分析型色谱方法，可监测分批或补料分批模式下的核苷三磷酸（NTP）消耗和mRNA生成，适用于多种RNA形式，有助于提高生产效率并降低成本。

优化 体外 使用色谱在线监测进行mRNA生产中的转录反应

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我们开发了一种快速色谱方法，可分离体外转录（IVT）反应组分，用于监测核苷三磷酸（NTP）消耗和mRNA生成。利用该方法，我们能够优化IVT反应，在最大化mRNA产量的同时，减少工艺杂质的形成并降低反应成本。我们的方法在mRNA领域具有开创性，展示了如何通过整合IVT反应的分析数据来实现更高产量和更低成本。目前，该领域正在探索其他在线过程分析工具，例如拉曼光谱法，但色谱法由于其强大的分离能力和高速度，仍然占据着关键地位。我们展示了如何结合实验设计软件使用高通量分析工具，对体外转录（IVT）反应进行全面优化。该方法实现了迄今为止报道的最高IVT反应产率，达到每升25克。我们的方法能够在较短的读出时间内同时监测 mRNA 和 NTP 的浓度，因此适用于近实时的体外转录（IVT）监测。目前 mRNA 领域正朝着连续化生产的方向发展，我们当然也在开发下一代工具以支持这一转变。首先，除酶类外，将所有试剂在设定为 300 转/分钟的恒温金属块中于 37 摄氏度解冻并预热 15 分钟。用指定的体外转录（IVT）编号和时间点标记每根试管。在试剂解冻的同时，用移液器将两微升 100 毫摩尔/升 EDTA 加入 0.5 毫升无菌试管中。随后从冷冻箱中取出酶，并暂时存放在冷藏容器中。使用适量的体外转录（IVT）试剂配制50至100微升的反应混合液。当所有IVT试剂混合后，最后加入T7 RNA聚合酶。立即吸取2微升IVT混合液，移入预先准备好的含有2微升EDTA的0.5毫升离心管中。将含有体外转录（IVT）混合物的反应管放入热循环块中，在 37 摄氏度下孵育。在每个预定时间点，从反应混合物中取出 2 微升 IVT 样品，用移液器转移至含有 EDTA 的试管中。在色谱分析确认 NTPs 完全耗尽后，加入 EDTA 终止大规模 IVT 反应，使 EDTA 的终浓度为 50 毫摩尔。对于补料分批体外转录（IVT）反应，需混合各种NTP和氯化镁的储备液。反应开始后，当NTP浓度降至初始值的10%以下时，向总体IVT反应体系中加入适量的补料溶液。当达到预期的mRNA产量后，加入EDTA至终浓度为50毫摩尔，以完全终止整个反应。进行色谱柱预处理时，分析前在室温下对0.1毫升分析柱平衡12小时。按照色谱柱外壳上指示的方向将色谱柱连接至色谱系统。随后，以每分钟1毫升的流速，先用50倍柱体积的重蒸水冲洗色谱柱，再用50倍柱体积的MPA冲洗。然后，在分析前至少运行三个空白样品，仅注入 MPA 以建立基线。接下来，分析系统适用性测试样品和标准曲线样品。对于系统适用性测试，将加帽试剂 NTPs、质粒 DNA 模板和 mRNA 混合。现在使用已知浓度的稀释纯化mRNA样品与流动相A配制校准标准品。如有需要，可配制终浓度分别为0.5、2、5、10、15和20微摩尔的NTP标准品，用于生成所有NTP的校准曲线。使用公式确定IVT样品所需的最小稀释倍数。在进行色谱分析前，将终止反应后的IVT样品涡旋混匀并离心沉降。将MPA和氯化钠用移液器加入锥形玻璃小瓶中，然后加入淬灭的体外转录（IVT）样品。涡旋混匀制备好的样品，并将其装入设定为4摄氏度的自动进样器中。将25微升稀释后的样品注入分析柱，并在260和280纳米波长下测定每个IVT样品的吸光度。完成所有体外转录（IVT）样品的分析后，再次进样系统适用性测试标准品，以确认系统的稳定性。快速在线分析可实现对mRNA随时间生成过程的监测。在本实验中，我们比较了IVT缓冲液组成对IVT反应动力学的影响。使用缓冲液A进行的体外转录（IVT）产生mRNA的速率最高，其次是缓冲液B和缓冲液C。IVT反应也可采用补料分批（Fed-Batch）方式进行。通过监测核糖核苷三磷酸（NTPs）的消耗情况，可向反应体系中补充NTPs和氯化镁以调节其浓度。由于补料会稀释IVT反应体系，每次补料后IVT反应中的mRNA浓度均会下降。

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