通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

本研究的范围是白血病发病机制。我们旨在通过将CRISPR/Cas9技术与CCK-8实验相结合，鉴定对异常HSPC增殖至关重要的基因，揭示其在肿瘤发生中的作用及作为药物靶点的潜力。

基于CRISPR/Cas-9的基因编辑为在真核细胞中实现基因敲除提供了一种简单且高效的方法。目前的实验挑战是进一步提高CRISPR/Cas-9基因敲除的效率。

本实验方案采用Cas-9小鼠，使其骨髓细胞具有持续性的Cas-9表达，从而通过病毒递送方式将单导向RNA（SGI）导入细胞，显著提高实验效率。

[Presenter] 首先，从安乐死的实验小鼠中获取股骨和胫骨。取出后立即将股骨和胫骨转移至超净工作台，以维持无菌状态。使用1毫升无菌注射器，用含2% FBS的PBS冲洗骨髓腔，以收集骨髓细胞。用移液器将骨髓细胞上下吹打30至50次，使其分散为单细胞。将细胞悬液转移至50毫升离心管中，并涡旋混匀。取10微升细胞悬液加入40微升红细胞裂解缓冲液中，冰上放置5分钟以裂解红细胞。然后加入50微升台盼蓝溶液，充分混匀后计数活细胞。接下来，在4摄氏度下以800 G离心15分钟，吸除上清液。随后，将细胞重悬于骨髓预刺激培养基中，浓度为每毫升1至2×10⁶个细胞。将10毫升细胞悬液接种至10厘米培养皿中，在37摄氏度下孵育24小时。次日收集预刺激细胞时，向培养皿中加入5至10毫升含2% FBS的PBS，并剧烈冲洗培养皿。将细胞转移至新的离心管中，加入台盼蓝染色液，计数混合液中的活细胞。接着，在室温下以800 G离心10分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于新鲜配制的旋转感染（spinfection）溶液中，浓度约为每毫升10⁶个细胞。将4毫升细胞悬液接种至6孔板的每个孔中。用封口膜密封培养板，在32摄氏度下以1,500 G离心90分钟。离心结束后，用移液器轻轻吹打重悬细胞，不更换培养基。继续孵育4至6小时。进行第一次转染时，从每孔中吸取约3毫升上清液至离心管中，并加入等体积的骨髓预刺激培养基。若不慎吸出细胞，则重复前述离心与重悬步骤。次日进行第二次转染时，从每孔中移除2至3毫升培养基，并加入等体积的新鲜解冻的逆转录病毒原液，同时加入适量的Hepas和Polygreen。将培养板在37摄氏度下以1,500 G离心90分钟。离心结束后，轻轻吹打重悬细胞，继续孵育4至6小时。随后，按前述方法更换培养基，并继续孵育24小时。用含2% FBS的PBS洗涤培养板，收集细胞。通过70微米滤网过滤细胞后，使用台盼蓝染色计数活细胞。接下来，在室温下以800 G离心10分钟。将细胞重悬于含10% FBS、小鼠白细胞介素-3（interleukin-3）、白细胞介素-6（interleukin-6）及干细胞因子（stem cell factor）的DMEM培养基中。取约0.5至1×10⁶个细胞，在800 G下离心5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀储存于-80摄氏度，用于基因组DNA提取。随后，将每孔1×10⁴个细胞接种至96孔板中，每组设置6个重复孔。向周围孔中加入100微升无菌PBS，并孵育至0、24、48和72小时等不同时间点。在每个时间点吸除培养基，向每孔加入含1/10体积CCK-8溶液的110微升培养基。孵育1小时后，使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度。CCK-8检测结果显示，在24、48和72小时，Trp53基因敲除显著增强了小鼠造血干细胞和祖细胞的增殖能力，相较于对照组具有明显差异。通过TIDE分析估算，Trp53基因编辑效率为7.3%。下一代测序结果进一步揭示了该基因不同位点上发生的突变。