Name: 用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜的等双轴拉伸装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 了解等双轴拉伸装置在活细胞力学研究中的应用，该气动驱动设备可施加精确机械刺激并结合高分辨率共聚焦显微镜观察细胞响应。此方法为机械生物学和组织工程研究提供可靠技术支持。

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本工作获得了以下资金资助 &#34;la Caixa&#34; 基金会（资助号 406 LCF/PR/HR20/52400004，授予 X.T.、J.V.R. 和 P.R.-C.；博士后奖学金 LCF/BQ/DR19/11740009，授予 I.G.-M.；博士后奖学金 LCF/BQ/DR19/11740009，授予 M.M.J.）、西班牙科学与创新部（项目号 PID2022-142672NB-I00，授予 P.R.-C.；项目号 PID2021-128635NB-I00，授予 X.T.；项目号 PID2022-141040NA-I00，授予 I.A.）、加泰罗尼亚自治区政府（2021 SGR 01425，授予 X.T. 和 P.R.-C.），以及奖项 &#34;ICREA 410 学术机构&#34; P.R.-C. 获得了研究卓越基金（P.R.-C.），加泰罗尼亚电视台基金会 Fundació la Marató de TV3（项目编号 201936-30-31 至 411，授予 P.R.-C.），欧盟欧洲研究理事会（ERC, MECHANOSYNTH，项目编号 101097753，授予 P.R.-C.；ERC, Adv-412 883739 Epifold，授予 X.T.）的资助。然而，文中表达的观点和意见仅为作者（们）的观点，不一定反映欧盟或欧洲研究理事会执行机构的意见。欧盟或资助机构对此不承担任何责任。A.E.M.B. 受惠于惠康基金会 Sir Henry Wellcome 奖学金（210887/Z/18/Z）。作者还感谢来自西班牙科学、创新与大学部（MCIU）/科学与创新评估机构（AEI）/基金编号 10.13039/501100011033 支持的胡安·德·拉·谢尔瓦博士后奖学金以及欧洲社会基金 Plus（FSE+）（项目编号 JDC2023-051559-I，授予 V.V.）的经费支持。IBEC 获得了西班牙科学与创新部（MINCIN）授予的塞韦罗·奥乔亚卓越中心奖项。我们感谢 V. González-Tarragó 在拉伸系统方面的协助，以及 Evelyn Coderch 提供的技术支持。我们还感谢巴塞罗那大学科学与技术中心（CCiTUB）电子显微镜冷冻电镜单元（Unitat de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM）以及 IBEC 内隶属于 CIBER-BBN 的 ICTS “NANBIOSIS” 7 号单元 MicroFabSpace 与显微表征设施提供的支持。我们还感谢 Maria Garcia Parajo 协助对接 ICFO 机械加工车间，以及 Tecnifill 在零部件工程方面的高效协助。&#160;

<ol><li>Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretching+device+for+high-resolution+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A stretching device for high-resolution live-cell imaging.</a> Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).</li>
<li>Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shearing-stretching+device+that+can+apply+physiological+fluid+shear+stress+and+cyclic+stretch+concurrently+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells.</a> J Biomech. Eng. 138 (3), 4032550(2016).</li>
<li>Constantinou, I., Bastounis, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-stretching+devices%3A+advances+and+challenges+in+biomedical+research+and+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging.</a> Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+human+alveolar+epithelial+cells+subjected+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of human alveolar epithelial cells subjected to stretch.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 (5), L1025-L1034 (2004).</li>
<li>Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+effects+of+Rho+and+mechanical+stretch+on+stress+fiber+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).</li>
<li>Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+measurements+in+cultured+vascular+smooth+muscle+cells+subjected+to+mechanical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation.</a> Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).</li>
<li>Wipff, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).</li>
<li>Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrins+and+focal+adhesion+kinase+in+the+orientation+of+dermal+fibroblasts+exposed+to+cyclic+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Wound+J%22%5BJournal%5D)">Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain.</a> Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).</li>
<li>Chu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+hair+regeneration+through+the+alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages.</a> Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).</li>
<li>Le Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanochemical+feedback+between+curved+membranes+and+BAR+protein+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization.</a> Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).</li>
<li>Kosmalska, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+of+membrane+remodelling+during+cell+mechanoadaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation.</a> Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).</li>
<li>Quiroga, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensing+mechanism+controls+plasma+membrane+shape+homeostasis+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale.</a> Elife. 12, e72316(2023).</li>
<li>Casares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+fracture+during+epithelial+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydraulic fracture during epithelial stretching.</a> Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).</li>
<li>Beedle, A. E. M., et al. Fibrillar adhesion dynamics govern the timescales of nuclear mechano-response via the vimentin cytoskeleton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeedle%2C+AEM+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Kechagia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laminin-keratin+link+shields+the+nucleus+from+mechanical+deformation+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling.</a> Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).</li>
<li>Andreu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+force+loading+rate+drives+cell+mechanosensing+through+both+reinforcement+and+cytoskeletal+softening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening.</a> Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).</li>
<li>Phuyal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+stimulates+COPII+-dependent+secretory+trafficking+via+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1.</a> EMBO J. 41 (18), e110596(2022).</li>
<li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li>
<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
<li>Faure, M. L., Gómez-González, M., Baguer, O., Comelles, J., Martínez, E., Arroyo, M., Trepat, X., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Micropatterned+Traction+Force+Microscopy%3A+A+Technique+to+Control+3D+Cell+Shape+While+Measuring+Cell-Substrate+Force+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">3D Micropatterned Traction Force Microscopy: A Technique to Control 3D Cell Shape While Measuring Cell-Substrate Force Transmission.</a> Advanced Science. 46, 2406932(2024).</li>
<li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7 (12), 53004(2012).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Kopek, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protocols+for+correlative+super-resolution+fluorescence+imaging+and+electron+microscopy+of+chemically+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples.</a> Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial+to+mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial to mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (50), 19943-19948 (2011).</li>
<li>Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stretching+devices+as+research+tools%3A+Engineering+and+biological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations.</a> Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).</li>
<li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+of+the+lung+extracellular+microenvironment+is+regulated+by+macroscale+tissue+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain.</a> Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).</li>
<li>Mayer, C. R., Arsenovic, P. T., Bathula, K., Denis, K. B., Conway, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+3D+printed+stretching+devices+for+imaging+force+transmission+in+live-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of 3D printed stretching devices for imaging force transmission in live-cells.</a> Cell Mol Bioeng. 12 (4), 289-300 (2019).</li>
</ol>

我们声明不存在任何利益冲突。

已有大量拉伸装置被用于对生物样本施加机械拉伸，以模拟体内的生理条件24,25。文献中存在多种实验装置，通常通过将拉伸装置与原子力显微镜26或荧光显微镜27,11联用来观察样本的响应。
本文介绍的拉伸装置在设计和操作上能够实现对活细胞进行高倍荧光成像，可用于标记任意荧光探针的样品。该装置结构简单，易于获取和使用，且采用气动系统的设计相比机械式装置更为简便且成本较低。在本研究展示的配置下，可轻松实现各向同性的应变。该设计与操作方式共同造就了一种控制良好、高质量的拉伸装置。该装置用途十分广泛，既可直接在可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜表面培养单个细胞11,12或细胞单层<sup class...

薄的可变形聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜被广泛用于多种定制拉伸装置1,2,3，因为PDMS是一种成熟的生物相容性惰性材料，且适用于显微成像。此处与许多其他研究者4,5,6,7,8,9一样，采用施加真空的简单原理使膜发生变形，从而构建一个稳定且可控的等双轴拉伸装置。通过将膜固定在圆形环内，并将该环密封于&#34;拉伸柱&#34;之上（图1A-C），可实现均匀且各向同性的形变。生物样本位于自支撑PDMS膜的环中心位置，便于使用荧光显微镜进行成像。本文展示了两种定制装置，分别兼容两种显微镜载物台型号（图1D-F），在生物应用方面具有高度通用性。尽管整体设计简单并可移植到其他载物台上，但装置的尺寸必须根据成像需求仔细选择。完成设计后，必须对装置的应变分布进行表征和验证。
除了装置本身外，本文还提供了一种简单的方法，并附有Matlab代码，用于表征应变的大小、均匀性和各向同性。该拉伸装置随后可用于对合成系统10、单个细胞11,12或单层细胞13施加等双轴拉伸应力，同时利用荧光显微镜以高时空分辨率记录样品的生物学响应。膜表面可包被不同的细胞外基质黏附蛋白14,15。可根据具体生物学研究的需求添加额外功能。例如，可将聚丙烯酰胺凝胶键合到PDMS膜上，以便在拉伸过程中调节基底刚度13,16；也可在PDMS膜上制备带有编号参考网格的结构，便于后续对样品中同一感兴趣区域进行成像12。固定后的拉伸样品还可进行免疫染色&#160;，然后重新拉伸以进行荧光成像17。所施加的拉伸模式可精确控制，范围从单次瞬时拉伸脉冲到不同幅度、频率或波形的周期性应变14,16。

<table><tbody><tr><td>乙酸盐掩膜</td><td>JD Photodata</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0140</td><td>40% 丙烯酰胺溶液</td></tr><tr><td>轴向拉伸系统</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>电泳用过硫酸铵 &amp;ge;98%</td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281778</td><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td></tr><tr><td>自主式微流控泵</td><td>Elveflow Cobalt</td><td>钴双</td><td>钴双</td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0142</td><td>2% 双丙烯酰胺溶液</td></tr><tr><td>刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>11733919</td><td>教学组 Hoja did&amp;aacute;X100 LAME BISTOURI 无菌&amp;deg;23&amp;nbsp; LAMD23&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>夹子</td><td>Sprintis</td><td>AKXX000001</td><td>金属制牛头夹，32 mm，夹持容量 10 mm，镍镀层</td></tr><tr><td>电晕处理机</td><td>电气产品</td><td>BD-20AC，货号：12051A</td><td>BD-20AC 实验室电晕处理仪</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>611-1368</td><td>VWR，一次性烧杯，250 mL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>罗氏</td><td>10236276001</td><td>DAPI 染色</td></tr><tr><td>乙醇 96%</td><td>Panreac Qu&amp;iacute;mica，SLU</td><td>131085-1212</td><td>96% (v/v) 乙醇用于分析&amp;aacute;裂解，ACS-2,5 L</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td>人血浆来源的纤维连接蛋白，液体&amp;nbsp; 0.1%</td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 &amp;micro;m</td><td>生命技术</td><td>F8801，F8803</td><td>用于分辨率评估的黄绿色和红色荧光微球</td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基修饰微球，0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>F8809, F8810</td><td>用于应变校准的黄绿色和红色荧光微珠</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6403</td><td>50% H₂O中的戊二醛溶液&lt;font class=&quot;font6&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/font&gt;&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;O&lt;/font&gt;</td></tr><tr><td>干涉仪</td><td>Veeco&amp;nbsp;</td><td>Wyko NT1100</td><td>测量PDMS膜厚度的干涉仪</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Panreac Qu&amp;iacute;云母，SLU</td><td>131090-1212&amp;nbsp;</td><td>2-丙醇（Reag. Ph. Eur.）用于分析&amp;aacute;裂解，美国化学会，国际标准化组织</td></tr><tr><td>Laiton weighs</td><td></td><td></td><td>定制制作</td></tr><tr><td>无尘擦拭布</td><td>伯克郡</td><td>DURX670, DR670090920</td><td>无纺布擦拭巾</td></tr><tr><td>润滑剂（凡士林）</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td>凡士林</td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>S&amp;uuml;ss MicroTec&amp;nbsp;</td><td>MJB4&amp;nbsp;</td><td>用于PMMA板光刻的掩模对准器</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>475904</td><td>MOWIOL 4-88 试剂</td></tr><tr><td>尼康显微镜转盘共聚焦</td><td>尼康</td><td>Eclipse Ti-E/B</td><td>配备 Nikon Ti-S-ER&amp;nbsp; 载物台</td></tr><tr><td>尼康 upright 显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse Ni-E</td><td>配备 Nikon NI-SH-E 载物台</td></tr><tr><td>目标物镜 60x</td><td>尼康</td><td>CFI Apo NIR 60X W</td><td>NIR 平场复消色差 60X/1.0 水浸 DIC N2 工作距离 2.8</td></tr><tr><td>PBS 溶液</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>DPBS，10 倍浓缩液</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>道康宁</td><td>2401673921</td><td>Sylgard-184 硅酮弹性体试剂盒 DN 109</td></tr><tr><td>大号培养皿环形盖</td><td>普罗基诺尔特</td><td>93060</td><td>TPP 细胞培养皿 SKU: 07177925 直径 100</td></tr><tr><td>小号培养皿环形盖</td><td>普罗基诺尔特</td><td>93060</td><td>TPP 细胞培养皿 SKU：07177924</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick&amp;nbsp;</td><td>PDC-002</td><td>氧气等离子体发生器</td></tr><tr><td>PMMA 板和环</td><td></td><td></td><td>参见补充文件中的 Excel 规格表</td></tr><tr><td>延长</td><td>Invitrogen</td><td>P36930 /P36934</td><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂</td></tr><tr><td>Repel-Silane</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1332-01</td><td>PlusOne Repel-Silane ES</td></tr><tr><td>环形橡胶圈</td><td>Tecnifil</td><td></td><td>定制制作</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Laurel</td><td>WS-650Sz</td><td>甩涂机</td></tr><tr><td>SPY650-DNA</td><td>Spirochrome</td><td>SC 501</td><td>SPY650-DNA</td></tr><tr><td>搅拌勺</td><td>VWR</td><td>231-0416</td><td>环保型一次性短柄刮勺，双头勺铲，聚丙烯材质含EcoPure添加剂</td></tr><tr><td>SU8 树脂 2100</td><td>微化学</td><td>Y111075</td><td>SU8-2100</td></tr><tr><td>SU8-显影液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>丙二醇单甲醚乙酸酯</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-50ML</td><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺，电泳试剂用生物试剂</td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931</td><td>&amp;nbsp;三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td></tr><tr><td>镊子</td><td>IESMAT</td><td>T5039&amp;nbsp;</td><td>Dumont HP 镊子 7 号，不锈钢，尖端尺寸 0.17 x 0.10 mm（Agar Scientific Ltd）</td></tr><tr><td>真空控制器</td><td>GARCAP/Parker</td><td>&amp;nbsp;990-005203-005&amp;nbsp;</td><td>真空控制器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>真空控制器 fluigent</td><td>Fluigent</td><td>LU-FEZ-N800</td><td>LineUp Flow EZ (n800mbar)</td></tr><tr><td>白色实验台纸</td><td>Raima</td><td>931.1001</td><td>&amp;nbsp;纸张 Raima 42 x 52</td></tr></tbody></table>

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

Equibiaxial Stretching Device for High Magnification Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy

在生理和病理条件下，细胞持续暴露于各种拉伸和压缩等机械力作用中。目前有大量活跃的研究致力于探索细胞和组织如何响应并适应这些应力，以及这些响应如何与力化学信号传导相整合。这促使人们需要开发出与标准细胞培养方案和显微镜技术兼容的精密工具，以在体外研究中模拟生理性的机械应力。本研究介绍了与高分辨率光学显微镜和荧光显微镜兼容的一种拉伸装置的设计、功能及表征。目前已有多种基于气动或电机的拉伸装置被开发并应用于该领域。本文详细描述了其中一种系统，包括设计指南、多种应用方式以及构建类似装置所需的全部工具。该系统基于一块可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜，通过施加真空使其在双轴方向上均匀拉伸，从而产生均一、可重复且可控的样品应变。该装置可提供多种拉伸应力模式，从瞬时局部拉伸到具有可控振幅和频率的周期性拉伸-释放循环。通过在基底上包被黏附蛋白，可在拉伸装置中接种携带荧光报告分子的细胞，并利用高倍荧光显微镜对拉伸过程中的活细胞进行实时成像。压缩应力也可通过让样品适应拉伸后突然释放，或在预拉伸的基底上接种样品后再释放拉伸来实现。此外，对PDMS基底进行额外的拓扑图案化处理，可实现同一样品在不同显微成像模式（如荧光显微镜和电子显微镜）下的观察。聚丙烯酰胺凝胶也可固定于PDMS膜上，从而实现对种植在不同刚度基底上的细胞进行拉伸。总体而言，通过在活体样品上施加可控的拉伸应力，结合高质量的荧光显微成像，该拉伸装置能够广泛应用于力生物学领域的多种科学问题研究。

校准与径向性 
对所获得应变的准确表征是确保实验可重复性和可控性的保障。虽然可以在每个样品中添加荧光微球以精确记录应变，但预先进行校准步骤有助于实验的合理规划，使实验者在实际拉伸前即可明确希望施加于样品的应变大小。应变不仅取决于所施加的真空度，还会因拉伸环的尺寸、PDMS 配比（不同于 1:10 的混合比例）、膜厚度以及在固定于环中前 PDMS 膜的预拉伸程度而变化。因此，每个实验装置都必须单独校准。通过使用均匀分布的荧光微球图像，并记录在不同真空度下微球信号的变化（见补充图 3A），不仅可以建立应变与施加真空度之间的校准曲线，还能验证应变的各向同性及其在基底上的均匀性。按照本方案第 6 节所述方法采集这些图像，并利用 Matlab 代码处理图像以计算应变，可评估所获得应变的质量和可重复性。图 3B（顶部）展示了在静止状态或应变状态下荧光微球的代表性图像组合，以及代码针对三种不同真空度水平计算出的位移场。该图像组合是通过运行 Matlab 代码后，在“Croppeddata”文件夹中打开生成的图像，并将其...

本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。

细胞在生理和病理条件下会持续受到机械力的作用，包括各种拉伸应力和压缩应力。

我们研究细胞在生理和病理条件下对机械刺激的响应与适应机制。为此，我们使用拉伸装置对细胞施加外部力，此处为应变。我们发现了细胞和细胞组织对特定机械刺激的反应方式，以及它们如何对其他生物信号产生机械响应。与其他设备相比，我们的拉伸装置具有更高的多功能性，因为它不仅可以对培养在不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶上的细胞进行拉伸，还可以进行压缩实验。[旁白] 首先，将PMMA环放置在一张白色实验台纸上。使用刀片仔细沿PDMS包被的培养板边缘切割，确保整个圆周形成整齐的切口。用镊子轻轻提起膜的一侧边缘，然后用拇指缓慢剥离，使膜的一半均匀地从培养板上脱离。用手指将96%乙醇均匀涂抹在PMMA环的整个上表面。接着，从先前抬起的边缘处小心地将PDMS膜从培养板上取下，然后将其对称地放置在覆盖有乙醇的PMMA环上，注意避免产生褶皱，同时不要拉伸。随后，取另一个空的PMMA环，将其放置在固定环的上方。使用金属夹具将两者夹紧，使PDMS膜被夹在两个环之间。将拉伸环的下半部分放置在支撑架上。将夹有PDMS膜的环放置在拉伸环上，并用力向下压，直至完全就位，确保密封垫圈正确安装。将圆形黄铜配重块放置在样品上方。接下来，将金属拉伸环的上半部分放在顶部，对准螺钉孔。插入所有螺钉并拧紧。使用刀片轻轻沿环边缘切割PDMS。用培养皿覆盖整个装置，以保护膜免受灰尘污染。通过连续稀释法，制备一份PBS中0.2微米荧光微球的250,000倍稀释液。将10至30微升的微球溶液滴加在PDMS膜的中心位置。在不超过40摄氏度的温度下使其干燥，以避免后固化带来的干扰。现在，将拉伸装置安装到显微镜载物台支架上，并将拉伸柱固定在显微镜上。在拉伸柱的圆形区域充分涂抹润滑剂。将已准备好的拉伸环安装到拉伸柱上，并旋紧顶部盖帽以密封装置。然后，将真空控制箱后端连接至真空源，再将前端连接至拉伸柱。为进行应变校准，选择一个包含高密度微球及可识别微球团块的感兴趣区域。采集该视野在静止状态下的图像，并保存其位置。施加-20毫巴的低真空水平以产生应变，引起各个方向的位移。随后，在Z平面重新对焦，并在XY方向移动载物台以定位相同的感兴趣区域，采集拉伸状态下的图像。然后释放应变，并重复上述步骤，逐步提高真空水平。将采集的图像按样品分类存储在文件夹中。将无拉伸条件下采集的参考微球图像命名为reference_str1，将不同递增真空水平下拉伸的图像依次命名为stretched_str1、stretched_str2、stretched_str3等。为量化应变，打开MATLAB并加载凝胶应变分析代码。设置参数后，定义父目录及实验文件夹路径，运行代码。随后，按照代码提示依次打开stretched_str1和reference_str1。计算每个真空水平下的中位应变矩阵。在至少三个样品上重复此过程后，绘制中位应变矩阵与真空水平的关系图，获得校准曲线。为包被PDMS环，先在紫外线下灭菌15分钟。在生物安全柜内，用无菌PBS冲洗培养板。吸除用于冲洗的所有PBS后，在环的中心位置滴加100至200微升的包被溶液。从PDMS膜的底面用永久性记号笔标记液滴的轮廓，然后进行孵育。在实验当天，用PBS洗涤黏附蛋白。消化细胞后，进行细胞计数。将适量细胞以约20至50微升的标准细胞培养基接种，以促进细胞贴附，并置于具有湿度控制的二氧化碳培养箱中孵育。20至30分钟后，轻轻在细胞上方加入500微升培养基，将培养板放回培养箱，使细胞进一步铺展。对于单次拉伸-释放循环及成像操作，将拉伸环如前所述安装至显微镜载物台上。找到目标细胞后，记录其位置并采集拉伸前的细胞图像。根据校准曲线，施加对应所需基底应变的真空水平，以拉伸细胞。为定位拉伸状态下的细胞，首先在Z平面重新对焦，然后在XY方向移动载物台，使细胞位于视野中心。在所需时间段内记录图像。返回细胞原始位置，并启动显微镜的采集模式，确保在重新对焦后立即开始图像采集。释放拉伸后，手动快速在Z平面重新对焦。在所需时间内采集释放后细胞的图像，并在整个采集过程中手动调节焦点。对于后期处理，打开Fiji软件并加载在静止状态和应变过程中采集的图像。使用Fiji的模板匹配插件选择细胞的某一区域进行图像对齐。校准确保了施加应变的可重复性和精确控制，证实了真空与应变之间在高达20%范围内近乎线性的关系。径向位移分析表明PDMS膜上的应变具有各向同性和均匀性。活细胞拉伸过程中的荧光成像显示，拉伸释放后细胞膜出现内陷结构，这些结构在三到五分钟内重新吸收。对固定细胞进行再拉伸，可在拉伸状态下成像，避免了人为折叠伪影。带有图案化网格的PDMS膜支持多模态成像，可在荧光显微镜和扫描电子显微镜下定位同一细胞。在包被有纤连蛋白的柔软PAA凝胶上培养的细胞，仅在特定周期性拉伸条件下才会形成局灶性黏附结构，而未拉伸的细胞则不会形成。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜的等双轴拉伸装置

活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

我们展示了使用恒力轴向光镊来研究短DNA分子的力学特性。通过轴向拉伸DNA，我们最大限度地减少了传统侧向操作中产生的空间位阻和人为假象，从而能够研究长度短至约100...

使用恒定力轴向光镊拉伸短DNA序列

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

为了理解机械应力如何激活生化通路并引发生物学反应，机械生物学研究需要新的工具。本文展示了一种新方法，利用微流控捕获装置对固定化的动物进行选择性机械刺激，从而实现对细胞反应的高分辨率成像。...

使用微流控装置进行机械刺激与高分辨率成像 秀丽隐杆线虫

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

本文介绍了Conpokal技术的实验方案，该技术将共聚焦显微镜与原子力显微镜整合于同一仪器平台。Conpokal可对活体生物样本实现同一细胞、同一区域的近同步共聚焦成像与力学表征。...

活细胞近同步激光扫描共聚焦与原子力显微镜联用技术（Conpokal）

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

本文介绍了用于可视化和分析小鼠胚胎在体轴伸长和体节形成过程中三维和四维图像数据的计算工具与方法，这些图像数据通过整体光学投影断层成像技术、活体成像以及基于多光子显微镜的全胚免疫荧光染色获得。...

三维与四维可视化及分析方法在脊椎动物体轴伸长与分节研究中的应用

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

本文介绍了一种新型装置，该装置能够在支持细胞于刚度可调且蛋白基质可定制的基底上培养的同时，向细胞施加各向同性和单轴应变波形。这一结构简单且经济的实验平台使研究人员能够在基础研究和与疾病相关的环境中探究机械信号如何调控细胞功能。...

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

了解等双轴拉伸装置在活细胞力学研究中的应用，该气动驱动设备可施加精确机械刺激并结合高分辨率共聚焦显微镜观察细胞响应。此方法为机械生物学和组织工程研究提供可靠技术支持。

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

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