用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

我们研究细胞在生理和病理条件下如何响应并适应机械刺激。为此，我们使用拉伸装置对细胞施加外部力，此处为应变。

我们发现了细胞和细胞组织如何响应特定的机械刺激，以及它们如何对其他生物信号产生机械响应。

与其他设备相比，我们的拉伸装置具有更高的多功能性，因为它能够对培养在不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶上的细胞进行拉伸，也可用于开展压缩实验。

[旁白] 首先，将PMMA环放置在一张白色实验台纸上。使用刀片小心地沿PDMS涂层板的边缘切割，确保整个圆周形成整齐的切口。用镊子从膜的一侧边缘轻轻提起，然后用拇指缓慢剥离，均匀地将膜的一半从板上分离。用手指将96%乙醇均匀涂抹在PMMA环的整个上表面。接着，从先前提起的边缘处小心地将PDMS膜从板上取下，然后对称地放置在覆盖有乙醇的PMMA环上，注意避免产生褶皱，同时不要拉伸。取另一个空的PMMA环，将其放置在固定环的上方。使用金属夹具将两者夹紧，使PDMS膜被夹在两个环之间。将拉伸环的下半部分放置在支撑座上。将夹有PDMS膜的环放置在拉伸环上，并用力向下压，直至完全就位，确保密封垫圈正确安装。将圆形黄铜配重块放置在样品上方。接着，将金属拉伸环的上半部分放置在顶部，对准螺钉孔。插入所有螺钉并拧紧。使用刀片小心地沿环边缘切割PDMS。用培养皿覆盖整个装置，以保护膜免受灰尘污染。使用连续稀释法，制备一份PBS中0.2微米荧光微球的250,000倍稀释液。将10至30微升的微球溶液滴加在PDMS的中心位置。在不超过40摄氏度的温度下使其干燥，以避免后固化带来的干扰。现在，将拉伸装置安装到显微镜载物台支架上，并将拉伸柱固定在显微镜上。在拉伸柱的圆形区域充分涂抹润滑剂。将已准备好的拉伸环安装到拉伸柱上，并拧紧顶部盖帽以密封装置。然后，将真空控制箱后端连接至真空源，再将前端连接至拉伸柱。为进行应变校准，选择一个包含高密度微球及可识别微球团块的视野区域。采集该视野在静止状态下的图像，并保存其位置。施加-20毫巴的低真空水平以产生应变，引起各个方向的位移。随后，在Z平面重新对焦，并在XY方向移动载物台以定位相同的感兴趣区域，采集拉伸状态下的图像。然后释放应变，并重复上述步骤，使用更高的真空水平。将采集的图像按样品分类存储在文件夹中。将无拉伸条件下采集的参考微球图像命名为reference_str1，将不同递增真空水平下拉伸的图像依次命名为stretched_str1、stretched_str2、stretched_str3等。为量化应变，打开MATLAB并加载凝胶应变分析代码。设置参数后，定义父目录及实验文件夹路径，运行代码。然后，按照代码提示依次打开stretched_str1和reference_str1。计算每个真空水平下的中位应变矩阵。在至少三个样品上重复此过程后，绘制中位应变矩阵与真空水平的关系图，获得校准曲线。为对PDMS环进行包被，先在紫外线下灭菌15分钟。在生物安全柜内，用无菌PBS冲洗培养板。吸除用于冲洗的所有PBS后，在环的中心位置滴加100至200微升的包被溶液。从PDMS膜的底面用永久性记号笔标记液滴的轮廓，然后进行孵育。在实验当天，用PBS洗涤黏附蛋白。消化细胞后，进行细胞计数。将适量细胞以约20至50微升的标准细胞培养基接种，以促进贴壁，并在具有湿度控制的二氧化碳培养箱中孵育。20至30分钟后，轻轻在细胞上方加入500微升培养基，并将培养板放回培养箱，以促进细胞进一步铺展。对于单次拉伸-释放循环及成像操作，将拉伸环如前所述安装至显微镜载物台上。定位到目标细胞后，记录其位置并采集拉伸前的细胞图像。根据校准曲线，施加对应所需基底应变的真空水平，以拉伸细胞。为定位拉伸后的细胞，首先在Z平面重新对焦，然后在XY方向移动以将细胞置于视野中心。在所需时间段内记录图像。返回细胞的原始位置，并启动显微镜的采集模式，确保在重新对焦后立即开始图像采集。释放拉伸后，手动快速在Z平面重新对焦。在所需时间内采集释放后细胞的图像，并在整个采集过程中手动调整焦点。对于后期处理，打开Fiji软件并加载在静止状态和应变过程中采集的图像。使用Fiji插件“模板匹配”选择细胞的某一区域进行对齐。校准确保了施加应变的可重复性和控制性，证实了真空与应变之间在高达20%范围内几乎呈线性关系。径向位移分析表明PDMS膜上的应变具有各向同性和均匀性。活细胞拉伸过程中的荧光成像显示，拉伸释放后细胞膜出现内陷结构，该结构在三至五分钟内重新吸收。对固定细胞进行再拉伸，可在拉伸状态下成像，避免了人为折叠伪影。带有图案化网格的PDMS膜支持多模态成像，可在荧光显微镜和扫描电子显微镜下定位同一细胞。接种在包被有纤连蛋白的柔软PAA凝胶上的细胞，仅在特定周期性拉伸条件下才会形成局灶性黏附，而未拉伸的细胞则不会形成。