通过原生 γH2A.X ChIP 捕获常见脆性位点断裂
2025年1月24日
我们提出了一种通过天然γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）快速高效检测常见脆性位点断裂的方法。该方法显著缩短了传统γH2A.X ChIP实验所需的时间和劳动量，同时保持了结果的高度可重复性和可靠性。
我们的研究重点在于衰老过程中常见脆性位点不稳定性在肿瘤再生中的作用。旨在鉴定癌基因诱导的癌细胞中可被治疗性利用的病毒移动性特征。此外，成像技术与测序技术（如单细胞测序和活细胞成像）可实现对大规模基因组不稳定性进行高分辨率绘图。
体内模型包括噪声、基因工程小鼠模型以及我们周围的CRISPR基础系统，用于深入研究癌基因基因组不稳定的机制。我们实验室的长期研究兴趣在于识别癌细胞中的特定弱点，从而制定针对性治疗策略，在最大限度减少对正常细胞损伤的同时，实现有效的治疗干预。这包括探索遗传和表观遗传层面的脆弱性，以揭示潜在的常规治疗新机遇。
首先，在三个不同的培养板中，用DMSO、乙基脱氧胆碱和羟基脲处理HEK 293 T细胞，处理时间为24小时。用PBS洗涤细胞两次后，在4°C条件下以500 ×g离心4至5分钟。将细胞沉淀重悬于500 µL新配制的预冷缓冲液A中，冰上孵育5至10分钟。
在光学显微镜下观察裂解进程，以确认细胞完全裂解。裂解完成后，在4°C条件下以500 G离心细胞悬液5分钟，弃上清，将核沉淀重悬于500微升预冷的缓冲液A中。再次离心后，用移液器吹打5至10次，将完整细胞核重悬于100微升微球菌核酸酶缓冲液中。立即向样品中加入预定量的微球菌核酸酶。
将离心管置于37摄氏度的旋转仪上孵育5分钟。立即把离心管放回冰上，并加入EDTA以终止消化反应。涡旋混匀后，加入500 µL缓冲液B，用移液器上下吹打混合。
将离心管置于冰上孵育五分钟，以溶解蛋白质。为沉淀不溶性物质，在4°C条件下以最大速度离心样品五分钟。将澄清的上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并标记为天然染色质组分。
为验证染色质片段化，取10微升上清液至新的1.5毫升离心管中。将上清液与20微升蒸馏水和30微升苯酚-氯仿-异戊醇混合。剧烈涡旋振荡后，在4摄氏度下以20,000 G离心10分钟，观察到三层明显分层：透明的上层、白色的中层和黄色的下层。
小心转移20微升含有DNA的上层水相至新离心管中。将纯化的DNA在1.5%琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳分离30分钟。观察酶切条带模式，确保染色质片段的大小主要在200至1,000个碱基对之间。
将20微升消化后的染色质转移至各含有180微升洗脱缓冲液的离心管中。将这些离心管标记为input样本，并于-20摄氏度保存。另取400微升消化后的染色质加入一个1.5毫升离心管中，用于染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，简称chip）。
将γH2AX抗体加入DMSO处理、乙基脱氧胆酸处理和羟基脲处理的样品中。将试管置于4摄氏度旋转仪上孵育5小时，或更佳地，孵育过夜。同时，使用宽孔枪头，将100微升ChIP级磁性蛋白AG珠分装至新的1.5毫升离心管中。
将试管置于磁力架上静置一分钟，然后小心弃去上清液。接着，用含有0.5% BSA的1毫升PBS重悬磁珠。在4摄氏度下旋转孵育四小时。
将离心管放回磁力架上静置一分钟，弃去上清液。第二次洗涤后，将预编码磁珠重悬于100 µL缓冲液B中。向每个芯片样品管中加入25 µL预编码磁珠悬液。在4 °C条件下旋转孵育两小时，然后将芯片样品管置于磁力架上，静置至磁珠吸附于管壁一侧，溶液变澄清。
弃去上清液，注意不要扰动磁珠。将磁珠重悬于1 mL洗涤缓冲液中，在4°C下旋转孵育10分钟。将离心管放回磁力架上，待溶液变澄清后，再弃去洗涤缓冲液。
最后一次洗涤后，在4 °C条件下以400 ×g短暂离心30秒，以去除残留液体。将离心管重新置于磁力架上，小心吸除管底残留的液体。通过Western blot验证芯片抗体免疫沉淀效率后，向每个剩余的ChIP样品中加入50 µL洗脱缓冲液。
将离心管置于恒温混匀仪上，在室温下振荡15分钟。将离心管放在磁力架上静置1分钟，收集洗脱液至新的离心管中。向每个染色质免疫沉淀洗脱样品中加入100 µL洗脱缓冲液，向每个输入样品中加入180 µL洗脱缓冲液。
然后向每个样品中加入 200 µL 苯酚-氯仿-异戊醇，并剧烈涡旋振荡试管以充分混匀。离心样品后，小心将上层水相转移至含有 19 µL 3 M 醋酸钠和 2 µL 甘油溶液的试管中。通过涡旋振荡试管进行混匀。
向每个样品中加入 500 µL 的 100% 乙醇，并充分涡旋混匀。将离心管置于 -20 °C 下放置 2 小时或过夜，以沉淀 DNA。然后离心离心管，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于 1 mL 的 70% 乙醇中。
离心去除残留乙醇后，将DNA沉淀在空气中干燥2至3分钟，然后在400微升TE缓冲液中重新悬浮。较高的微球菌核酸酶浓度会导致染色质更彻底的消化，从而主要产生单核小体片段。相反，在较低的微球菌核酸酶浓度下，大部分染色质片段较大，通常超过一千个碱基对。
与DMSO处理的对照组相比，在复制应激细胞中，经乙基脱霉素处理后，Native ChIP和交联ChIP的输入样品均显示γH2AX水平显著升高。
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概述
本研究介绍了一种利用天然γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）快速高效检测常见脆性位点断裂的方法。该方法显著缩短了传统γH2A.X ChIP实验所需的时间和操作步骤，同时确保了结果的高度可重复性和可靠性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 癌症研究
背景
- 常见脆性位点是基因组中易于发生不稳定的区域。
- 理解这些位点对癌症研究至关重要。
- 检测这些断裂的传统方法费时费力。
- 高效的检测方法可提高研究效率。
研究目的
- 建立一种检测脆性位点断裂的简化方法。
- 在减少工作量的同时保持结果的高度可靠性。
- 促进对癌症中基因组不稳定性进一步研究。
使用的方法
- 内源性 γH2A.X 染色质免疫沉淀（ChIP）。
- 与传统 ChIP 方法的比较分析。
- 结果的可重复性与可靠性评估。
- 在癌细胞研究中的应用。
主要结果
- 新方法显著减少了时间和劳动成本。
- 与传统方法相比，结果显示出高度的可重复性。
- 实现了对常见脆性位点断裂的高效检测。
- 该方法可应用于多种癌症研究场景。
结论
- 该方法是癌症研究人员的有力工具。
- 它提高了研究基因组不稳定性的工作效率。
- 未来的应用可能带来更优的治疗策略。
常见问题
行业高管相关性
在常见脆性位点高效检测DNA双链断裂对于降低早期肿瘤学发现的风险以及理解基因组不稳定性机制至关重要。简化的原位γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）方案可实现DNA损伤的高通量、可重复定量，有助于提高靶点验证和机制研究的预测可信度。该能力直接适用于基因组稳定性及DNA修复研究管线中的项目筛选与优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可实现对脆性位点DNA损伤的精确定位，有助于揭示其作用机制并降低研发风险。
- 支持对基因组稳定性通路中相关靶点的功能验证。
- 有助于探究与复制应激及致癌驱动因素相关的治疗假设。
- 提高推进DNA修复靶点研究的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复、定量的DNA损伤检测方法，适用于化合物筛选。
- 简化样品处理流程，支持高通量工作流程和检测标准化。
- 输出结果稳定，适用于不同实验条件和样品间的比较。
- 实现对遗传毒性和DNA修复调控的可靠评估。
转化与临床前研究
- 与疾病相关模型相一致，用于评估癌细胞中的基因组不稳定性。
- 支持从发现到DNA修复机制临床前验证的连续性研究。
- 为基因组稳定性治疗药物的风险调整型推进决策提供依据。
- 促进DNA损伤应答通路的转化生物标志物开发。
流程与工作流整合
该内源性γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）方案可融入从发现到临床前研究的连续流程，能够在基因组不稳定性研究中实现快速假设检验和机制验证。
- 发现生物学：定量检测DNA双链断裂，以阐明通路参与情况及生物学风险。
- 筛选：为化合物和基因扰动筛选提供标准化、可扩展的检测读数。
- 分析：提供定量测量结果，用于在不同条件下对DNA损伤进行统计学比较。
- 转化研究：将发现研究成果与癌症基因组不稳定性临床前模型相衔接。
- 企业级复用：建立可在多个研发项目中重复使用的DNA损伤检测平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基因组稳定性研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的DNA损伤定量工作流程。
- 战略价值：支持基于科学依据的决策制定，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持对DNA修复和基因组稳定性靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备染色质生物学和免疫沉淀技术方面的专业知识。
- 需要具备微球菌核酸酶消化和基于磁珠的染色质免疫沉淀（ChIP）实验条件。
- 多样本工作流程中为确保可重复性，需实现跨团队标准化操作。
- 可适用于多种细胞模型，但可能需要针对特定系统进行优化。
- 样本质量和抗体特异性是获得可靠结果的关键因素。
