Name: 通过天然 γH2A 捕获常见的脆弱位点断裂。X ChIP (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 了解使用天然γH2A.X染色质免疫沉淀技术检测常见脆性位点断裂的高效方法。该方法显著缩短实验时间并降低劳动强度，同时保持高重现性和可靠性，为癌症研究中基因组不稳定性研究提供有力工具。

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本工作由南华大学启动资金资助。

1. 细胞收获
<ol>
	<li>将约 5 × 105 个 HEK 293T 细胞接种至四个 6 cm 培养皿中，每个培养皿加入 4 mL 完全 DMEM 培养基。</li>
	<li>24 小时后，向其中一个培养皿加入 2 µL 的 1 mM 阿非迪霉素（Aphidicolin）储备液（参见材料表），终浓度为 0.5 µM；向另一培养皿加入 20 µL 的 1 M 羟基脲（hydroxyurea）储备液（参见材料表），终浓度为 5 mM，以诱导复制应激。向剩余两个培养皿中加入 DMSO 作为对照。</li>
	<li>处理 24 小时后，弃去培养基。通常一个 6 cm 培养皿可获得约 2 × 106&#160;个细胞，细胞融合度为 60%–70%。</li>
	<li>用 5 mL 冰冷的 1× PBS 将每个培养皿清洗两次。使用细胞刮刀刮下细胞，并将细胞悬液转移至四个独立的 1.5 mL 离心管中。用 P1000 移液器轻轻吹打数次，以充分分散细胞团块。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞置于冰上备用。</li>
</ol>
2. 亚细胞组分分离
<ol>
	<li>将细胞沉淀重悬于 500 µL 新鲜配制的预冷缓冲液 A 中（参见表 1），通过轻柔吹打确保细胞团块完全解离。</li>
	<li>将裂解物在冰上孵育 5–10 分钟。在显微镜下检查裂解进程，以确认细胞是否完全裂解。
	<ol>
		<li>取少量裂解物（约 5–10 µL）置于洁净的载玻片上，加盖盖玻片以避免污染。</li>
		<li>使用适当放大倍数（例如 20x–40x）的光学显微镜观察细胞或碎片，并与未裂解的对照样品进行比较，以区分完整细胞与已裂解物质。 
		注意：充分裂解的样品应无明显细胞轮廓，仅见弥散的染色质或细胞内容物。调节焦距以清晰观察裂解物。如有需要，在裂解步骤中可施加机械力，例如使用 Dounce 匀浆器，尤其适用于某些特定类型的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞完全裂解后，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。使用宽口吸头将核沉淀重悬于 500 µL 预冷的缓冲液 A 中。 
	注意：宽口吸头有助于最小化剪切力，保护染色质等敏感样品。可通过锋利刀片切割标准吸头末端制备宽孔吸头。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>提前将培养箱预热至 37 °C，并准备终止缓冲液（100 mM EDTA，pH 8.0；表 1）。</li>
	<li>预先优化微球菌核酸酶（MNase，参见材料表）的浓度和孵育时间。
	<ol>
		<li>将 40 µL 测试用染色质样品分成若干等份，用于测试不同 MNase 浓度和孵育时间。</li>
		<li>使用一系列 MNase 浓度（例如每反应 0.0625 U、0.125 U、0.25 U、0.5 U、1 U、2 U、4 U、8 U），并测试多个孵育时间（例如 2、5、10 和 15 分钟）。</li>
		<li>向各染色质等份样品中加入含不同浓度 MNase 的 MNase 缓冲液（参见表 1），并在 37 °C 下孵育指定时间。</li>
		<li>在达到所需孵育时间后，立即加入 1/4 体积的终止缓冲液（终浓度为 20 mM EDTA）以终止反应。</li>
		<li>采用苯酚/氯仿/异戊醇抽提法从消化后的染色质样品中分离 DNA。</li>
		<li>将提取的 DNA 在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，以观察消化模式：消化不足将显示高分子量条带（图 2，泳道 1–4）；过度消化将导致弥散条带或极短片段（图 2，泳道 6–8）；而最佳消化应产生清晰的核小体梯状条带（图 2，泳道 5，例如单核小体、双核小体、三核小体）。</li>
		<li>确定能够产生理想核小体分辨率且无过度消化的实验条件。 
		注意：CaCl2 是 MNase 活性的辅因子。可通过调节 CaCl2&#160;浓度在 1 mM 至 5 mM 范围内优化消化效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用宽口吸头轻轻吹打 5–10 次，将完整细胞核重悬于 100 μL MNase 缓冲液中。立即向样品中加入已确定量的 MNase（1.25 U MNase/100 µL MNase 缓冲液）。 
	注意：处理多个样品时，应分别进行消化，以避免过度消化。</li>
	<li>将离心管置于旋转仪上，在 37 °C 孵育 5 分钟。随后立即将管子放回冰上，并加入 EDTA 至终浓度 20 mM，通过涡旋混合终止 MNase 消化反应。</li>
	<li>向每个样品中加入 500 µL 缓冲液 B（参见表 1），通过上下吹打 5–10 次充分混匀。在冰上孵育 5 分钟以溶解蛋白质。 
	注意：缓冲液 B 中的盐和去垢剂有助于解离弱结合的染色质蛋白，并暴露用于免疫沉淀的抗原表位。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以最大转速离心 5 分钟，沉淀不溶性物质。将澄清的上清液转移至新标记的 1.5 mL 离心管中，标记为天然染色质组分。样品可储存于 -80 °C，或用于验证染色质片段化的效率。 
	注意：避免频繁冻融，因其可能破坏感兴趣的蛋白质-DNA 相互作用。应尽可能减少冻融次数。</li>
</ol>
3. 染色质片段化的验证
<ol>
	<li>取每个样品的上清液10 µL，分装至新的1.5 mL离心管中。加入20 µL蒸馏水和30 µL苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀。</li>
	<li>盖紧管盖，剧烈涡旋振荡15–30秒。在4 °C条件下，以20,000 × g（或离心机最高速度）离心10分钟。离心后可见三层：上层为透明液体，中层为白色，下层为黄色。</li>
	<li>小心吸取20 µL上层水相（含DNA）转移至新管。将纯化的DNA在1.5%琼脂糖凝胶中以100 V电泳30分钟，观察酶切条带。确保染色质片段大小主要分布在200至1000个碱基对之间。 
	注意：合适的染色质片段大小对天然染色质免疫沉淀（native ChIP）实验的成功至关重要，其大小取决于微球菌核酸酶（MNase）处理条件，包括酶单位数、孵育时间及CaCl2&#160;浓度。MNase的消化效率也可能因细胞类型和细胞数量不同而有所差异。本ChIP实验推荐采用图2（第5泳道）所示的染色质片段化模式。</li>
</ol>
4. 免疫沉淀
<ol>
	<li>从每个样本中取20 µL消化后的染色质，加入新的1.5 mL离心管中，并与180 µL洗脱缓冲液混合（参见表1）。将这些离心管标记为Input样本，并于-20 °C保存。</li>
	<li>将400 µL染色质样本转移至另一个1.5 mL离心管中用于ChIP实验。</li>
	<li>向一份DMSO处理、一份鬼臼素处理和一份羟基脲处理的样本中加入γH2A.X抗体（参见材料表）。向另一份DMSO处理的样本中加入等量的正常IgG（参见材料表），作为ChIP实验的阴性对照。 
	注意：通常每400 µL染色质使用1 μg的一抗（即抗体终浓度为2.5 µg/mL）。然而，不同γH2A.X抗体的最佳用量应通过实验确定。</li>
	<li>将ChIP反应管置于4 °C旋转仪上，孵育至少5小时，或更佳地过夜孵育。</li>
	<li>同时，取100 µL ChIP级磁性Protein A/G珠（参见材料表）加入新的1.5 mL离心管中。使用宽口吸头并缓慢移液，以确保准确量取珠子体积。将离心管置于磁力架上至少1分钟，然后小心弃去上清液。</li>
	<li>用含0.5% BSA的1x PBS缓冲液1 mL重悬珠子。于4 °C旋转孵育约4小时。将离心管置于磁力架上至少1分钟，弃去上清液。</li>
	<li>再次用含0.5% BSA的1x PBS缓冲液1 mL洗涤珠子。将离心管置于磁力架上1分钟，使磁珠沉降，然后弃去上清液。 
	注意：步骤4.5至4.7为珠子预包被步骤，旨在减少抗体与磁珠之间的非特异性结合。</li>
	<li>使用宽口吸头，用100 µL缓冲液B重悬预包被的珠子。向每个ChIP反应管中加入25 µL预包被的磁珠悬液。于4 °C旋转孵育2小时。</li>
	<li>将ChIP反应管置于磁力架上，等待珠子完全吸附至管壁且溶液变澄清。</li>
	<li>在不扰动磁珠的前提下弃去澄清的上清液。用1 mL洗涤缓冲液重悬珠子（参见表1），并于4 °C旋转孵育10分钟。</li>
	<li>将离心管重新置于磁力架上，等待溶液变澄清后弃去洗涤缓冲液。重复洗涤，共进行四次洗涤。</li>
	<li>最后一次洗涤后弃去洗涤缓冲液，于4 °C以400 x g短暂离心30秒，以去除残留液体。将离心管重新置于磁力架上，小心吸除管底残留的液体。</li>
</ol>
5. 洗脱与DNA沉淀
注意：不同批次的抗体效率可能存在差异。通过蛋白质印迹分析检测免疫沉淀样品，以确认新抗体的结合亲和力，这一点非常重要。
<ol>
	<li>使用以下所述的蛋白质印迹法（WB）验证ChIP抗体的拉下效率。
	<ol>
		<li>取少量ChIP样品用于分析（通常为ChIP样品的10%）。同时包括Input染色质（免疫沉淀前样品）和阴性对照（例如IgG拉下样品）以进行比较。</li>
		<li>将抗体结合的磁珠在20 µL 1x SDS-PAGE上样缓冲液（参见材料表）中95 °C加热5分钟，以洗脱蛋白质。</li>
		<li>将免疫沉淀（IP）样品、Input样品和对照样品上样至15% SDS-PAGE凝胶，运行电泳。</li>
		<li>使用湿转或半干转系统将蛋白质转移至0.2 µm硝酸纤维素膜（参见材料表）或PVDF膜。</li>
		<li>用含5%脱脂奶粉或BSA的TBST缓冲液（参见表1）在室温下封闭膜1小时，以防止非特异性结合。</li>
		<li>将膜与针对γH2A.X的一抗（参见材料表）在封闭缓冲液中稀释后孵育，室温孵育1–2小时或4 °C过夜。</li>
		<li>用TBST洗涤膜3次，去除未结合的一抗。随后加入HRP标记的二抗（参见材料表），室温孵育1小时，再次洗涤以去除多余的二抗。</li>
		<li>使用化学发光底物显影，并用成像仪检测信号。比较IP、Input和对照泳道的信号强度，以评估拉下的效率和特异性。 
		注意：IP泳道中出现与目标蛋白相对应的条带，表明抗体拉下成功。该方法可确保您评估抗体在ChIP实验中捕获目标蛋白的有效性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向其余每个ChIP样品中加入50 µL洗脱缓冲液（参见表1）。将管子置于恒温混匀仪上，室温振荡15分钟。</li>
	<li>将管子置于磁力架上静置至少1分钟。收集上清至新管中。重复一次，并将洗脱液收集至同一管中。</li>
	<li>向每个ChIP洗脱样品中额外加入100 µL洗脱缓冲液，向每个Input样品中加入180 µL洗脱缓冲液。</li>
	<li>向每个样品中加入200 µL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），剧烈涡旋混匀。在4 °C下以20,000 x g（或最大转速）离心10分钟。</li>
	<li>在每个新的1.5 mL离心管中加入19 µL 3M乙酸钠（NaOAc，pH 5.2；参见表1）和2 µL糖原溶液（20 mg/mL，参见材料表）。</li>
	<li>离心后，小心转移上层水相（约190 µL）至含有NaOAc和糖原的管中，涡旋混匀。</li>
	<li>加入500 µL 100%乙醇，涡旋混匀。将样品在-20 °C孵育至少2小时或过夜，以沉淀DNA。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 x g（或最大转速）离心10分钟。弃去上清，注意不要扰动白色沉淀。用1 mL 70%乙醇重悬沉淀，充分涡旋。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 x g（或最大转速）离心5分钟。小心弃去上清。短暂再次离心，使残留乙醇沉至管底，用P20移液器小心吸除乙醇。将DNA沉淀在空气中干燥2–3分钟。 
	注意：避免过度干燥沉淀，否则可能导致DNA难以重新溶解。</li>
	<li>对于ChIP样品，将DNA重悬于400 µL TE缓冲液中（参见表1）；对于Input DNA，重悬于1000 µL TE缓冲液中。洗脱后的样品现可于-20°C保存。</li>
</ol>
6. qPCR 定量分析
<ol>
	<li>使用商业试剂盒进行qPCR（参考 材料清单每个样本设三个技术重复。通过熔解曲线分析确认是否存在单一特异性PCR产物，以确保扩增的特异性。36.</li>
	<li>数据分析 
	注意：在相对定量分析中，待测样本的表达量以相对于对照样本（使用正常纯化的IgG或模拟免疫沉淀进行免疫沉淀）的倍数变化表示。已知未被免疫沉淀蛋白占据的DNA位点（阴性位点）可作为参照基因，与已知被占据的阳性对照DNA位点进行比较，用于此类分析。36.
	<ol>
		<li>使用以下公式计算每次染色质免疫沉淀（ChIP）的输入百分比 
		%输入 = 2(-ΔCt [标准化的染色质免疫沉淀])</li>
		<li>通过使用以下公式，从阴性位点的 ΔCt 值中减去阳性位点的 ΔCt 值，将阳性位点的 ΔCt 值归一化为阴性位点（ΔΔCt） 
		(ΔΔCt = ΔCt阳性 - ΔCt阴性)</li>
		<li>使用以下公式计算 ChIP DNA 中阳性位点序列相对于阴性位点的富集倍数 
		富集倍数 =2ΔΔCt 
		用于分析的qPCR引物序列见下文 表2FRA3B 和 FRA16D 的基因组结构37如图所示 图3A，B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>使用配对样本 t 检验对结果进行统计学分析。p 值 ≤ 0.05 被认为具有统计学显著性，表明观察到的差异不太可能由随机变异引起38.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Nitsch, S., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+ChIP%3A+Studying+the+genome-wide+distribution+of+histone+modifications+in+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native ChIP: Studying the genome-wide distribution of histone modifications in cells and tissue.</a> Meth Mol Biol. 2846, (2024).</li>
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<li>Teves, S. S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+fractionation+of+nucleosomes+for+genome-wide+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Salt fractionation of nucleosomes for genome-wide profiling.</a> Methods Mol Biol. 833, 421-432 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

环境污染是导致人类癌症的重要因素。许多污染物具有致癌性，意味着它们可引起遗传损伤，从而导致癌症的发生40,41。然而，确定某种特定物质是否具有致瘤性是一项具有挑战性的任务。一种快速、可靠且成本效益高的识别致癌潜力的方法，将使科学家能够高效地筛选环境污染物，并评估其对基因组稳定性的影响。在本研究中，我们关注一种修饰的组蛋白变体γH2A.X，它被广泛认为是DNA双链断裂（DSBs）的高度特异性标志物。当组蛋白变体H2A.X在丝氨酸139位点因DNA损伤而发生磷酸化时，即形成γH2A.X。
通过在常见脆性位点（CFSs）处利用天然染色质免疫沉淀法（Native ChIP）检测γH2A.X的存在，我们可以有效评估环境污染物所导致的DNA损伤程度42。定量检测CFSs处γH2A.X的能力，为评价环境污染物诱导肿瘤效应的潜力提供了一种快速、灵敏且可靠的方法。与传统的遗传毒性检测方法（通常检测DNA损伤的间接标志物，如突变、微核形成...

常见脆性位点（CFSs）是存在于每条人类染色体上的大片段染色体区域，在分裂中期容易发生断裂。在复制应激条件下，这些区域的复制显著延迟，导致其在进入有丝分裂前无法完成完全复制1，最终导致位点特异性的缺口和断裂。CFSs 是染色体不稳定的热点区域，也是早期癌症发展过程中染色体重排的主要原因。复制应激在肿瘤发生条件下普遍存在，可导致抑癌基因丢失和癌基因扩增，统称为拷贝数变异（CNV）2,3,4,5,6。此外，CFSs 极易发生病毒整合，进一步促进癌症的发展7,8,9,10。在对原发性肿瘤进行泛癌分析时，已在 CFS 区域检测到多个抑癌基因的纯合性缺失。癌症中最常受影响的 CFSs 包括 FRA2F、FRA3B、FRA4F、FRA5H 和 FRA16D11。在外界致癌因子存在的情况下，CFSs 特别容易发生断裂12。为了评估环境污染物的有害致癌效应，亟需一种快速且可靠的定量检测 CFS 断裂发生的方法。
由共济失调毛细血管扩张症突变基因相关蛋白（ATR）或共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）介导的H2A.X组蛋白丝氨酸139位点的磷酸化（γH2A.X）是复制叉停滞信号通路中的关键事件13。在双链断裂（DSB）形成之前，γH2A.X可作为复制叉停滞的标志物13，并通过建立有利于修复蛋白高效募集至停滞位点的染色质环境发挥作用。此外，在复制叉崩塌后，γH2A.X亦可被招募至断裂位点14,15，这与其在DSB修复中的主要功能一致。由于常见脆性位点（CFS）断裂与驱动癌症进展的染色体畸变密切相关，检测这些断裂有助于理解肿瘤发生的早期阶段。CFS处γH2A.X的存在可作为基因组不稳定性早期事件的生物标志物。该信息有助于识别潜在的致癌物，并评估暴露于各种外源性因子所带来的风险。通过检测外源性因子诱导的CFS处DNA断裂，γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）可揭示此类因子在肿瘤发生机制中的作用。
在传统的染色质免疫沉淀（即交联染色质免疫沉淀，X-ChIP）中，γH2A.X 与其靶 DNA 序列的结合通过可逆的甲醛交联得以稳定。随后，染色质通过超声处理被剪切为约 500 个碱基对（bp）的片段，并通过沉降法清除碎片16,17,18。然后向澄清的染色质组分中加入适用于 ChIP 的 γH2A.X 抗体，再加入 Protein A/G 琼脂糖珠以富集与 γH2A.X 结合的染色质区域16,17,18。免疫复合物（即珠-抗体-γH2A.X-靶向 DNA 复合物）使用严格的洗涤缓冲液多次洗涤，以去除非特异性结合的 DNA 片段16,17,18。洗涤后，从免疫复合物中洗脱特异性结合的 DNA。随后逆转甲醛交联，并使用蛋白酶 K 进行蛋白质消化，之后对富集的 DNA 进行纯化和浓缩16,17,18。为评估与 γH2A.X 相关的区域，可采用 PCR、定量 PCR（qPCR）或直接测序方法16,17,18。在特定区域（如 CFS）γH2A.X 的占据程度由 PCR 或 qPCR 信号强度决定，该强度与该位置结合的 γH2A.X 量成正比，从而提供关于位点特异性 DNA 损伤与修复事件的信息16,17,18。
尽管X-ChIP是一种强大的实验方法，但它存在若干显著的局限性：（i）由于固定相关的抗体沉淀效率较低，需要大量的细胞，通常在1 x 107&#160;至5 x 107之间，从而增加了实验的总体成本19；（ii）逆转甲醛交联及后续DNA纯化的过程耗时且劳动密集，难以保证结果的一致性和可靠性；（iii）由于交联步骤可稳定短暂的相互作用，可能导致检测到的γH2A.X-DNA相互作用中，难以区分功能意义较小的与功能意义较大的相互作用，因而可能包含无显著生物学意义的结合事件19。
天然染色质免疫沉淀（Native ChIP 或 N-ChIP）是一种重要的生化技术，用于在生理盐浓度条件下研究天然染色质环境中蛋白质与DNA的相互作用。该技术在阐明染色质的空间与时间组织、转录因子结合以及组蛋白修饰方面发挥了关键作用。与X-ChIP相比，Native ChIP在染色质生物学和表观遗传学的广泛研究领域中具有长期的重要地位，并展现出独特的优势与局限性。该方法于20世纪80年代末提出20，其核心是通过保持染色质天然结构的方法从细胞中分离染色质，例如使用微球菌核酸酶（MNase）进行消化21。这种方法能够保留固有的蛋白质-DNA和组蛋白-DNA相互作用，因此特别适用于在天然染色质背景下研究组蛋白修饰和核小体定位22。高分辨率的Native ChIP研究已证明，利用MNase消化可将染色质降解为单个核小体，从而更精确地绘制组蛋白修饰图谱23。此外，由于无需化学交联，因此引入可能歪曲蛋白质-DNA相互作用的偏差或人工假象的风险被降至最低24。
与使用甲醛或其他交联剂来固定蛋白质-DNA 相互作用的 X-ChIP 相比，Native ChIP 通过避免潜在的交联假象，能够更真实地反映染色质状态。然而，尽管 X-ChIP 通常更适合检测 DNA 与调控蛋白之间的瞬时或动态相互作用25，Native ChIP 则更适用于稳定的蛋白质-DNA 相互作用，例如组蛋白或其他染色质结合蛋白26,27。目前指出的 Native ChIP 的一个局限性是其无法捕获低亲和力或瞬时的结合事件，而这些事件在 X-ChIP 中通常可通过交联得以稳定25。
表观遗传学领域的大量研究工作已利用天然染色质免疫沉淀（Native ChIP）技术，在多种生物学背景下揭示了组蛋白修饰的存在28。这些研究对于定义“组蛋白密码”——即调控基因表达和染色质动态的组蛋白修饰模式——起到了关键作用29。尽管H2A.X是一种与染色质连接较弱的连接组蛋白，但天然H2A.X ChIP方法已在胚胎干细胞中成功应用30。在本研究中，我们优化了一种染色质提取流程，用于在人源293T细胞中进行γH2A.X的天然ChIP实验（图1）。羟基脲和阿非迪霉素广泛用于研究DNA复制应激、损伤及基因组不稳定性31。在本研究中，这些试剂被用于处理细胞，以诱导复制应激并在常见脆性位点（CFS）处产生DNA断裂。
使用约 1 × 106&#160;至 5 × 106&#160;个细胞作为起始材料，该方法可分为四个主要阶段：（i）亚细胞分级分离以纯化染色质，（ii）微球菌核酸酶（MNase）消化以片段化染色质，（iii）免疫沉淀与洗脱，以及（iv）通过定量 PCR（qPCR）进行 DNA 分析。在亚细胞分级分离后进行染色质免疫沉淀（ChIP）具有多种优势，并已在大量研究中得到充分证实32,33,34,35。该策略可去除未结合染色质的蛋白质及其他细胞碎片，从而获得高度纯化的染色质组分。通过在免疫沉淀前分离染色质，亚细胞分级分离有助于维持天然的染色质相互作用，并减少来自非染色质相关蛋白的背景干扰，从而使分析仅保留与染色质结合的复合物，获得更特异且可靠的结果。此外，亚细胞分级分离允许采用更温和的条件进行染色质消化，从而保护生理状态下的蛋白质-DNA 相互作用，更真实地反映天然细胞环境中染色质的动态特性。
利用γH2AX的天然染色质免疫沉淀（ChIP）技术检测外源因子对常见脆性位点断裂的影响，在癌症研究中具有重要意义。该技术能够检测环境致癌物暴露所诱导的DNA损伤，有助于揭示污染物导致基因组不稳定性和癌症发生的分子机制。通过保持天然染色质结构，该方法可准确评估与致癌暴露相关的DNA损伤模式，为环境风险评估及污染驱动的肿瘤发生研究提供支持。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 硝酸纤维素膜</td><td>Amersham</td><td>10600011</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白 B</td><td>proteintech</td><td>20536-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>阿非迪霉素</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-N6733</td><td></td></tr><tr><td>ChIP 级磁性 Protein A/G 珠</td><td>ThermoFisher</td><td>26162</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 底物</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705061</td><td></td></tr><tr><td>糖原，分子生物学级</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat. No.&amp;nbsp; R0561</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的二抗&amp;nbsp;</td><td>proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>羟基脲&amp;nbsp;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-B0313</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>正常 IgG&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Taq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1725120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;H2A.X 抗体&amp;nbsp;（用于 ChIP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;H2A.X 抗体（用于 WB）</td><td>Cell Signaling</td><td>#25955</td><td></td></tr></tbody></table>

通过原生 &#947;h2a.x chip 捕获常见脆性位点断裂

Capturing Common Fragile Site Breaks by Native &#947;H2A.X ChIP

暴露于外源性因子引起的复制应激可导致基因组中常见脆性位点（common fragile sites）发生DNA断裂，这些区域已知易于出现结构不稳定性。γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）检测在遗传毒性研究中是一种强有力的工具，因为γH2A.X的磷酸化是DNA双链断裂的公认标志物。然而，传统的γH2A.X ChIP检测通常耗时耗力，涉及多个繁琐的步骤。本研究中，我们提出了一种简化但高效的方法，将亚细胞分级分离与天然ChIP技术相结合，以分离与γH2A.X相关的复合物。该方法特别适用于以更高特异性和效率分析γH2A.X与染色质的相互作用。通过亚细胞分级分离，可有效去除未结合染色质的成分，从而获得纯化的染色质组分。随后在温和条件下使用微球菌核酸酶（MNase）进行消化，可在保持γH2A.X与其相关蛋白复合物之间生理相互作用的同时实现染色质片段化。这种相互作用的保留对于研究参与DNA损伤应答通路的天然互作分子至关重要。该优化的天然ChIP方案显著减少了传统γH2A.X ChIP检测所需的时间和劳动投入。简化的操作流程不仅使实验流程更便捷，而且结果高度可重复，特别适用于需要高通量处理多个样本的研究场景。该方法在基因组稳定性、DNA修复及染色质生物学研究中具有广泛的应用前景，尤其在需要准确且高效检测DNA损伤位点的研究中至关重要。通过采用优化的实验方案和简化的步骤，该方法能够以更高的灵敏度检测脆性位点的DNA损伤，同时最大限度减少样本操作，成为研究基因组稳定性与DNA损伤应答的有力工具。

染色质片段的大小对于天然染色质免疫沉淀（Native ChIP）的成功至关重要，因为它直接影响DNA区域对抗体结合的可及性。为了确定用于染色质片段化的最佳MNase浓度，我们准备了一系列微量离心管，其中含有不同浓度的MNase（即每反应0.0625 U、0.125 U、0.25 U、0.5 U、1 U、2 U、4 U、8 U）以及40 µL分离的细胞核。每个反应在37 °C下孵育5分钟，以获得不同大小的染色质片段。MNase消化的结果如图2所示。
如图2所示，较高的MNase浓度导致染色质更广泛的消化，从而主要产生单核小体片段（图2，泳道1、2和3）。相比之下，在较低的MNase浓度下，大多数染色质片段较大，通常超过1 kb（图2，泳道6、7和8），表明消化不充分，不适合后续应用。当MNase浓度为1.6单位、消化时间为5分钟时，我们获得的染色质...

我们提出了一种通过天然γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）快速高效检测常见脆性位点断裂的方法。该方法显著缩短了传统γH2A.X ChIP实验所需的时间和劳动量，同时保持了结果的高度可重复性和可靠性。

通过原生 &#947;H2A.X ChIP 捕获常见脆性位点断裂

由外源性物质暴露所引发的复制应激可导致基因组中常见脆性位点发生DNA断裂，这些位点是基因组中已知的……

我们的研究重点在于衰老过程中常见脆性位点不稳定性在肿瘤再生中的作用。旨在鉴定癌基因诱导的癌细胞中可被治疗性利用的病毒移动性特征。此外，成像技术与测序技术（如单细胞测序和活细胞成像）可实现对大规模基因组不稳定性进行高分辨率绘图。体内模型包括噪声、基因工程小鼠模型以及我们周围的CRISPR基础系统，用于深入研究癌基因基因组不稳定的机制。我们实验室的长期研究兴趣在于识别癌细胞中的特定弱点，从而制定针对性治疗策略，在最大限度减少对正常细胞损伤的同时，实现有效的治疗干预。这包括探索遗传和表观遗传层面的脆弱性，以揭示潜在的常规治疗新机遇。首先，在三个不同的培养板中，用DMSO、乙基脱氧胆碱和羟基脲处理HEK 293 T细胞，处理时间为24小时。用PBS洗涤细胞两次后，在4°C条件下以500 ×g离心4至5分钟。将细胞沉淀重悬于500 µL新配制的预冷缓冲液A中，冰上孵育5至10分钟。在光学显微镜下观察裂解进程，以确认细胞完全裂解。裂解完成后，在4°C条件下以500 G离心细胞悬液5分钟，弃上清，将核沉淀重悬于500微升预冷的缓冲液A中。再次离心后，用移液器吹打5至10次，将完整细胞核重悬于100微升微球菌核酸酶缓冲液中。立即向样品中加入预定量的微球菌核酸酶。将离心管置于37摄氏度的旋转仪上孵育5分钟。立即把离心管放回冰上，并加入EDTA以终止消化反应。涡旋混匀后，加入500 µL缓冲液B，用移液器上下吹打混合。将离心管置于冰上孵育五分钟，以溶解蛋白质。为沉淀不溶性物质，在4°C条件下以最大速度离心样品五分钟。将澄清的上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并标记为天然染色质组分。为验证染色质片段化，取10微升上清液至新的1.5毫升离心管中。将上清液与20微升蒸馏水和30微升苯酚-氯仿-异戊醇混合。剧烈涡旋振荡后，在4摄氏度下以20,000 G离心10分钟，观察到三层明显分层：透明的上层、白色的中层和黄色的下层。小心转移20微升含有DNA的上层水相至新离心管中。将纯化的DNA在1.5%琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳分离30分钟。观察酶切条带模式，确保染色质片段的大小主要在200至1,000个碱基对之间。将20微升消化后的染色质转移至各含有180微升洗脱缓冲液的离心管中。将这些离心管标记为input样本，并于-20摄氏度保存。另取400微升消化后的染色质加入一个1.5毫升离心管中，用于染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，简称chip）。将γH2AX抗体加入DMSO处理、乙基脱氧胆酸处理和羟基脲处理的样品中。将试管置于4摄氏度旋转仪上孵育5小时，或更佳地，孵育过夜。同时，使用宽孔枪头，将100微升ChIP级磁性蛋白AG珠分装至新的1.5毫升离心管中。将试管置于磁力架上静置一分钟，然后小心弃去上清液。接着，用含有0.5% BSA的1毫升PBS重悬磁珠。在4摄氏度下旋转孵育四小时。将离心管放回磁力架上静置一分钟，弃去上清液。第二次洗涤后，将预编码磁珠重悬于100 µL缓冲液B中。向每个芯片样品管中加入25 µL预编码磁珠悬液。在4 °C条件下旋转孵育两小时，然后将芯片样品管置于磁力架上，静置至磁珠吸附于管壁一侧，溶液变澄清。弃去上清液，注意不要扰动磁珠。将磁珠重悬于1 mL洗涤缓冲液中，在4°C下旋转孵育10分钟。将离心管放回磁力架上，待溶液变澄清后，再弃去洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，在4 °C条件下以400 ×g短暂离心30秒，以去除残留液体。将离心管重新置于磁力架上，小心吸除管底残留的液体。通过Western blot验证芯片抗体免疫沉淀效率后，向每个剩余的ChIP样品中加入50 µL洗脱缓冲液。将离心管置于恒温混匀仪上，在室温下振荡15分钟。将离心管放在磁力架上静置1分钟，收集洗脱液至新的离心管中。向每个染色质免疫沉淀洗脱样品中加入100 µL洗脱缓冲液，向每个输入样品中加入180 µL洗脱缓冲液。然后向每个样品中加入 200 µL 苯酚-氯仿-异戊醇，并剧烈涡旋振荡试管以充分混匀。离心样品后，小心将上层水相转移至含有 19 µL 3 M 醋酸钠和 2 µL 甘油溶液的试管中。通过涡旋振荡试管进行混匀。向每个样品中加入 500 µL 的 100% 乙醇，并充分涡旋混匀。将离心管置于 -20 °C 下放置 2 小时或过夜，以沉淀 DNA。然后离心离心管，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于 1 mL 的 70% 乙醇中。离心去除残留乙醇后，将DNA沉淀在空气中干燥2至3分钟，然后在400微升TE缓冲液中重新悬浮。较高的微球菌核酸酶浓度会导致染色质更彻底的消化，从而主要产生单核小体片段。相反，在较低的微球菌核酸酶浓度下，大部分染色质片段较大，通常超过一千个碱基对。与DMSO处理的对照组相比，在复制应激细胞中，经乙基脱霉素处理后，Native ChIP和交联ChIP的输入样品均显示γH2AX水平显著升高。

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通过天然 γH2A 捕获常见的脆弱位点断裂。X ChIP

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