Name: 利用布里渊光谱学对球体进行机械映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习利用布里渊显微光谱学对三维基质中的活细胞球体进行非侵入式机械特性分析。该方法可定量评估肿瘤球体的力学表型，为疾病进展研究提供重要工具。

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作者感谢英国研究与创新署/工程与物理科学研究委员会（UKRI/EPSRC）MechanoMeds第二阶段资助项目（资助号：EP/X033554/1）对本方法开发提供的资金支持。

1. 二维细胞培养
注意：尽可能在无菌环境中进行所有细胞培养操作，并使用符合组织培养标准的层流罩，以避免污染。本方案中使用了间充质干细胞（MSCs），但也可根据研究的具体目的选用其他细胞类型来制备球状体。
<ol>
	<li>在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养间充质干细胞（MSCs），加入足量培养基以覆盖细胞，培养基含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 µM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸（NEAA）和 1% 青霉素-链霉素。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到 70–80% 时进行传代，加入 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（胰酶体积应为 DMEM 体积的 1/3），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 分钟，使细胞从培养皿上脱落。加入含 FBS 的培养基（体积至少与所加胰酶相当）以终止反应。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
</ol>
2. 类球体的制备
注意：尽可能在无菌环境中进行所有细胞培养操作，并使用符合组织培养标准的层流罩以避免污染。本研究中使用微孔板来制备间充质干细胞（MSC）球体。这些微孔板包含24个孔，每个孔内含有1200个直径为400 µm的微孔，从而可实现大量球体的制备（图2）。
<ol>
	<li>准备微孔板时，先向每个孔中加入 500 µL 抗黏附冲洗液进行预处理。在室温下以 1,300 g 离心 5 分钟。在 20 倍显微镜下检查是否存在气泡。如有气泡，需重复离心步骤。随后去除抗黏附冲洗液。</li>
	<li>用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微孔板，吸除液体。重复此步骤两次，以确保彻底去除冲洗液。</li>
	<li>确定每个类球体的细胞数量以及每块凝胶中的类球体数量。该参数取决于具体的研究问题。例如，我们采用每个类球体 100 个细胞，每块凝胶 100 个类球体。因此，本方案仅需使用微孔板中的一个孔，因为该孔总共可生成 1200 个类球体。为计算一个孔所需的细胞数量，进行如下计算：1200 × 100 = 1.2 × 105。计算含有 1.2 × 105 个细胞的细胞悬液体积。在室温下以 300 g 离心细胞悬液 5 分钟，并去除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 1 mL DMEM 培养基中（含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺），并添加 100 µM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% 青霉素和链霉素。将 1 mL 细胞悬液加入微孔板的一个孔中，轻轻吹打数次以使细胞均匀分散。注意避免引入气泡。在室温下以 100 g 离心 3 分钟。 
	注：此步骤中我们未在培养基中添加胎牛血清（FBS），以防止细胞贴附于组织培养级塑料表面。</li>
	<li>在显微镜下观察微孔板，确保细胞均匀分布并已沉降至微孔底部。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。24 小时后观察类球体的形成情况。 
	注：类球体可在微孔板中继续培养最多 48 小时，具体时间取决于细胞类型及所需类球体的致密程度。</li>
	<li>为从微孔板中收集类球体，首先缓慢轻柔地移除培养基，注意避免扰动类球体。为防止类球体黏附于塑料器皿，使用含 1% FBS 的 PBS 预先润洗移液枪头和离心管。为避免类球体卡在移液枪头中，可剪去枪头尖端以扩大开口。在此过程中可使用最大回收率枪头作为额外措施，以减少类球体损失。向微孔板的每个孔中加入 500 µL PBS，反复吹打以使类球体脱离孔壁。将含有悬浮类球体的 PBS 收集至离心管中（图 2）。</li>
	<li>在 20 倍显微镜下观察微孔板，并重复此步骤，直至大部分类球体被成功回收。</li>
	<li>为计数悬液中的类球体数量，取 50 µL 悬液转移至 96 孔板的一个孔中。计数该 50 µL 体积内的类球体数量。为便于计数，可用永久性记号笔在孔底画十字线。使用公式（1）计算类球体总数： 
	<img alt="用于计算悬液中类球体数量的公式，涉及 50 μL 中的体积和计数。" src="/files/ftp_upload/67538/67538eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>
3. PEG水凝胶的制备
注意：尽可能在无菌环境中进行所有细胞培养操作，并使用符合组织培养标准的层流罩，以避免污染。本研究中使用了马来酰亚胺聚乙二醇（PEG-maleimide）水凝胶，但也可采用其他类型。PEG-maleimide 水凝胶通过硫醇-迈克尔加成反应27形成。所用交联剂为聚乙二醇二硫醇（PEG-dithiol）与蛋白酶可降解肽（两侧由两个半胱氨酸残基包围的 VPM 肽，序列为 GCRDVPMSMRGGDRCG）的混合物。本研究中的凝胶使用了 70% 的 PEG-dithiol 和 30% 可降解的 VPM 肽。
<ol>
	<li>配制浓度为 200 mg/mL 的 VPM 肽母液，每凝胶加入 2.4 µL 肽；配制浓度为 200 mg/mL 的 PEG-二硫醇母液，每凝胶加入 5.6 µL。</li>
	<li>在与交联剂混合前，将类球体重悬于 PBS 中（图 2）。将类球体悬液与 PEG-二硫醇（每凝胶 5.6 µL）和 VPM（每凝胶 2.4 µL）混合，该溶液称为溶液 B。 
	注意：本方案中，每凝胶加入 100 个类球体。</li>
	<li>配制浓度为 250 mg/mL 的 PEG-马来酰亚胺母液。每凝胶加入 50 µg 纤连蛋白。将 PEG-马来酰亚胺与纤连蛋白溶液混合，此溶液称为溶液 A。用移液器将溶液 A（100 µL 凝胶对应 40.3 µL）加至 12 孔细胞培养板底部。以 1:1 的摩尔比（马来酰亚胺:巯基）加入溶液 B（100 µL 凝胶对应 59.7 µL），以确保完全交联；确保凝胶化即时发生。水凝胶的终体积为 100 µL。</li>
	<li>将凝胶在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟，以完成凝胶化。向孔中加入完全培养基（DMEM，添加 10% FBS、100 µM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸以及 1% 青霉素-链霉素），确保凝胶完全浸没（图 2）。将凝胶继续在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，直至准备在布里渊显微镜下进行测量。 
	注意：在布里渊测量前，类球体在水凝胶中的培养时间取决于细胞类型和研究问题。例如，在本研究中，类球体通常在水凝胶中培养长达 7 天，在此期间通过布里渊显微镜对其进行监测。已对含或不含类球体包封的水凝胶的黏弹性特性进行了表征，结果显示类球体对凝胶力学性能无显著影响（图 S2）。</li>
</ol>
4. 水凝胶中类球体的荧光染色与成像
注意：在本研究中，细胞核和构成细胞骨架的肌动蛋白丝在进行布里渊测量之前已进行荧光染色和成像。
<ol>
	<li>为了染色肌动蛋白，在成像前3小时，将活细胞肌动蛋白染料按1:500的比例加入培养基中。用铝箔包裹样品以避光。将凝胶在37 °C和5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>为了染色细胞核，在成像前40分钟，向凝胶周围的培养基中加入每毫升2滴的活细胞核染料。将样品放回培养箱中继续孵育。</li>
	<li>染色孵育结束后应尽快采集荧光图像。确认已选择正确的光路（使显微镜相机曝光）和正确的滤光片轮位置。调暗室内灯光并采集背景图像。打开发光二极管（LED）光源，根据染色方案选择相应的波长（此处细胞核成像使用385 nm，肌动蛋白成像使用621 nm）。使用首选软件以20倍放大倍数采集类球体的荧光图像。完成后关闭LED光源。</li>
</ol>
5. 类球体的布里渊显微成像
<ol>
	<li>开启设备与激光发射
	<ol>
		<li>打开设备：开启计算机、光谱仪、显微镜相机、显微镜、激光冷却风扇，并通过打开控制器上的钥匙开关启动激光发射。应在光谱仪优化前至少15分钟完成上述操作，以确保激光器达到热平衡。使用功率计确认激光输出功率是否符合预期（本实验中为100 mW）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开温度控制应用程序（参见 材料表）并通过测量标准具后的光束功率来验证标准具温度是否已优化。如果功率明显低于预期值（需考虑所用光密度（OD）滤光片的影响），则将目标温度改变1 °C，并观察功率是否随时间增加。如果功率下降，则反向调整温度。当功率接近预期值时，以0.1 °C的微小步长进行精细调节，直至达到最大功率。</li>
	<li>将物镜焦点设定在丙烯酸立方体内部 
	注意：每次实验前，需使用刚性均质参考材料样品优化抑制弹性散射以及从“泵浦消除器”到光谱仪的耦合。本研究中采用丙烯酸立方体。</li>
	<li>打开 SpectraLok 软件，等待所有设备被检测到。在主窗口的左侧（图3），选择光谱仪相机。
	<ol>
		<li>将亚克力立方体安装在显微镜样品台上，透明面朝向物镜。尽可能降低物镜，并将立方体置于其正下方中心位置。确保显微镜中的光路选择正确，使光谱仪相机暴露在光路中（将旋转端口选择器调至 L). 
		注意：在我们的实验装置中， L 端口连接至共聚焦环形器，而 R 连接到显微镜相机端口。</li>
		<li>在 SpectraLok 中 相机 窗口，设置 传感器曝光时间 至500毫秒，软件增益至100。该 软件增益 仅为了可视化目的而增强对比度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开激光快门。 
	注意：激光发射时，请勿将头部或眼睛置于激光光路中。
	<ol>
		<li>按压 捕获，并移动 物镜 向上。信号强度将显著增加，并出现饱和模式（图4A）将出现。这是由激光在空气-丙烯酸立方体界面处发生强反射所致。将物镜进一步上移，信号强度将降低，布里渊峰将变得明显。继续调整物镜位置，直至布里渊峰的强度保持稳定（图4B这对应于焦点完全位于亚克力立方体内部的情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化法布里-珀罗标准具压力以最小化残余弹性散射光 
	注意：以下步骤的目的是抑制弹性散射的瑞利信号，以确保仅有频率发生偏移的布里渊光到达光谱仪相机。</li>
	<li>在 SpectraLok 软件中，打开 泵抑制剂（PK）对照 窗口图5).</li>
	<li>放大其中一个最亮的布里渊峰，通过点击“move rel”以100 µm为步长调节压力执行器位置，以最小化瑞利峰强度。如果瑞利信号增强，则点击反向调节变化方向 反转随后，以10 µm为增量微调标准具压力。 
	注意：在丙烯酸立方体中，瑞利散射光可被完全抑制；但在异质性生物样品中，情况可能并非如此。</li>
	<li>优化条带叠加以“展开”光谱数据 
	注意：以下步骤可确保相机传感器的 (x, y) 像素坐标被正确映射到波长 通过 查找表（LUT）的应用</li>
	<li>在 相机 窗口，放大其中一个布里渊级次。</li>
	<li>按 s 键可在相机图像上显示应用调色板的条纹图6A）。打开 设置 窗口并按下 快速校准 重新计算条纹的最佳水平偏移量。如果传感器已饱和，请在此步骤前缩短曝光时间。
	<ol>
		<li>在 相机 窗口中，确认紫色条纹与布里渊峰中心区域良好重叠图6B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化PK-能谱仪耦合</li>
	<li>调节准直透镜的光轴可使从PK耦合到光谱仪的光效率最大化。</li>
	<li>打开光谱窗口并点击 展开 以获取光谱（图7).</li>
	<li>打开 PK对照 窗口。以0.0005°为增量，逐步调节准直器轴1和轴2，以最大化布里渊信号。如有需要，可进一步优化法布里-珀罗标准具的压力控制。在均匀的丙烯酸立方体中，瑞利信号可被完全抑制（图7A）。尽管在存在部分残余瑞利信号的情况下仍可进行准确的布里渊测量（图7B），在抑制效果不佳的情况下（图7C），弹性散射光会掩盖布里渊信号。</li>
	<li>验证所获得的布里渊信号与参考振幅相当。例如，在我们的系统中，曝光时间为 500 ms 且 OD 为 0.3 时，布里渊峰强度振幅约为 3000 计数。以保存更改的 PK 将参数添加到配置文件，在 PK 窗口中，单击 刷新全部 和 保存全部此外，在主窗口中按下 保存 在 文件输入/输出 部分</li>
	<li>切换至扫描软件并确认参数仍处于优化状态</li>
	<li>关闭SpectraLok并打开扫描软件。在本实验方案中，使用了基于LabVIEW的软件，其详细描述见于 图S3. 设置扫描几何形状时，可使用此专有用户界面（UI）控制Prior XY-Z平移台；但也可采用其他方法。
	<ol>
		<li>将带有水凝胶-球状体样本的玻璃底培养皿替换丙烯酸立方体安装好图8). 为防止凝胶脱水，将培养箱设置为37 °C、95%相对湿度。打开培养皿盖，加入培养基以浸没凝胶。在凝胶上方放置盖玻片，以防止凝胶移动。</li>
		<li>定位球状体。在激光束被阻断的情况下，将显微镜光路切换至目镜。打开白光照明。使用操纵杆手动控制样品台，找到球状体并调焦。</li>
		<li>获取类球体的明场图像。通过旋转控制旋钮调节照明亮度。设置光路至 R，从而露出显微镜相机。可根据需要调整曝光时间以获得高对比度图像（例如，50 ms）。</li>
		<li>验证光谱仪和解包裹参数是否仍处于优化状态。将显微镜端口设置为 L 并用激光阻断时捕获背景图像。通过旋转转轮使激光通过，解除阻断。 放电根据所需的信噪比选择曝光时间。此类测量的典型曝光时间为200–500 ms。</li>
		<li>如果距离初次校准已过去一段时间（例如数小时），或系统受到机械扰动，则标准具压力设置或PK光谱仪耦合可能不再处于最佳状态。必要时，重复步骤5.3–5.5，重新优化上述参数。</li>
		<li>从解包裹的光谱中选择布里渊峰拟合范围。调整 阈值 约为布里渊峰强度的一半。忽略低于此阈值的布里渊峰。根据所有已识别的布里渊峰对校正激光波长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置多维扫描几何结构</li>
	<li>通过调整扫描区域的宽度和步长来选择光栅扫描几何参数。 
	注意：对于直径约70 µm的球状体，进行低分辨率扫描时，通常采用150 µm × 150 µm的扫描范围和10 µm的步长。此设置可在约3.4分钟内生成一幅低分辨率的二维图谱。
	<ol>
		<li>开始扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭布里渊系统
	<ol>
		<li>关闭软件并关闭计算机。使用控制器上的钥匙关闭激光发射。将快门轮保持在原位 封闭 调整位置。关闭激光风扇冷却。关闭显微镜和光谱仪相机。最后，关闭显微镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者指出，T. Allen 和 G. Wardle 是 LightMachinery 公司的员工，该公司生产并销售本研究中使用的布里渊光谱仪。该企业可能从本作品的发表中获益。其余所有作者声明不存在利益冲突。

我们已建立一种利用布里渊显微镜对嵌入水凝胶中的球状体进行生物力学成像的方案，其空间分辨率达到微米级。通过所获得的布里渊频移（BFS）值的差异，可区分水凝胶与活体球状体。在代表性结果中，我们采用了间充质干细胞（MSC）球状体与马来酰亚胺聚乙二醇（PEG-maleimide）水凝胶；然而，该方案亦广泛适用于其他细胞类型（如癌细胞系）。本研究中的细胞在具有生物学相关性的三维微环境中以活体状态成像，表明该平台可与生物学相关的模型有效结合。不同样本的布里渊频移值 离体 脑、肌肉、皮肤和软骨等非人类物种的组织已被测量4布里渊显微镜技术此前已成功用于测量 体内 组织力学，例如人晶状体和角膜31本方案中使用的3D微环境可能有助于开发用于临床应用的预测工具，从而减少对复杂且昂贵的模型开发的需求 体内 模型的进一步应用。该方案的局限性包括光谱数据分析与解读，以及在激光照射下维持细胞活性。
活体类球体的荧光成像可显示细胞核和肌动蛋白丝，突显了获取分子信息以...

与传统的二维细胞培养方法相比，三维模型中的细胞培养具有优势，因为它能更好地模拟体内存在的组织结构和细胞间相互作用。in vivo。类球体（spheroids）是三维细胞聚集体，可促进复杂的细胞间相互作用；而这些相互作用在贴壁于组织培养塑料表面形成的单层细胞中则受到限制。类球体可在模拟细胞来源微环境的支架中培养。例如，水凝胶是一种常用的生物材料，可用于培养细胞/类球体，因其能够精确调控刚度、可降解性、孔径大小以及生长因子的掺入等参数1（图1A）。在癌症和纤维化等疾病的病理过程中，机械信号通常先于生化变化出现2,3，因此，获取具有临床相关性的疾病三维模型中的生物力学特征，对于开发诊断干预手段以指导治疗实践并理解潜在的病理生理机制至关重要4。
布里渊显微技术（Brillouin Microscopy, BM）是一种成像技术，能够在二维平面上测量生物材料的力学特性5,6,7。与原子力显微镜（AFM）和弹性成像等更常用的方法相比，BM 具有一些关键优势。已有充分文献表明，AFM 可实现高时空分辨率的力学测量，而弹性成像则可用于探测样品内部的力学性质8,9。BM 无需与待测材料直接接触，因此对于难以接近的样品或细胞（例如水凝胶内的球状体）而言，BM 是比 AFM 更理想的技术。BM 的另一项关键优势是无需对样品进行标记，并可在生物样品内部提供微米级分辨率，这是常规弹性成像方法无法实现的7；更先进的光学弹性成像技术虽可达到微米级分辨率10，但需注意，对于异质性生物样品，布里渊成像中精确的有效分辨率并不容易定义。首先，对于给定的照明波长，分辨率取决于描述焦点尺寸的光学特性（物镜的数值孔径（NA）和样品的不透明度）。此外，对样品力学性质探测的准确性以及布里渊谱线的形状还受到材料声学特性（声子波长和传播长度）的影响11,12。布里渊光谱背后的物理现象是布里渊散射，即入射的单色激光与生物介质中自发的、热诱导的声学声子发生相互作用，导致光的非弹性散射，并产生布里渊频移（Brillouin frequency shift, BFS），如图1B&#160;和&#160;所示，BFS 通常在几 GHz 量级，具体取决于光子是损失还是获得能量，分别在散射光谱中检测到布里渊斯托克斯峰和反斯托克斯峰。由于 BFS 依赖于介质中的局部声速，因此与弹性纵向模量相关，而该模量又经验性地与杨氏模量相关7,13；然而，在比较这些模量时必须谨慎：（i）它们之间并非直接关联；（ii）生物样品和软物质的杨氏模量通常在 Pa 至 kPa 范围内，而布里渊测量得到的纵向模量则在 GPa 量级；（iii）还需考虑折射率变化和材料密度等参数7。布里渊线宽（见图1B）是 BM 提供的另一项测量参数，它与纵向损耗模量相关，可反映样品的黏性；这些性质可与黏弹性相关联14。因此，BM 可用于评估材料的黏弹性特性，其中较大的 BFS 表示材料更刚硬，而较大的线宽则表示材料更具黏性（图1B）。需要注意的是，弹性（瑞利）散射过程中光子不发生频率偏移，其发生概率远高于布里渊散射。因此，布里渊光谱仪必须具备抑制瑞利信号的能力。
布里渊显微镜（BM）已被用于表征多种组织、生物材料以及三维细胞培养模型的力学特性。例如，BM 被用于区分黑色素瘤与周围健康组织，结果显示非癌组织显著比黑色素瘤更柔软15。Rad 等人研究表明，增加水凝胶的聚合物浓度会导致布里渊频移（BFS）和线宽增大。在最低聚合物浓度下，含细胞的水凝胶在七天内布里渊频移的下降幅度明显大于无细胞水凝胶，这被认为是由细胞对水凝胶的重塑作用所致。而在10%聚合物浓度下未观察到该现象，这提示这些水凝胶中可能存在细胞活力不足的问题16。
与本研究最相关的是，布里渊显微镜（BM）已被用于研究类球体的力学特性17,18,19,20。特别是，可以利用BM检测局部微环境对类球体力学行为的影响20。与在可变形水凝胶中培养的肿瘤类球体相比，在刚性水凝胶中生长的类球体表现出更高的布里渊频移（BFS），表明其弹性模量更高20。BM还可用于表征类球体内部力学性质的空间变化。例如，已发现肿瘤类球体的布里渊频移随接近类球体核心而增加20,21。此外，布里渊频移的降低与肿瘤类球体侵袭性的增强相关20。BM还被用于研究肿瘤类球体在渗透冲击下的力学变化22。在该研究中，对类球体生长进行了为期5天的监测，发现BM观察到的癌性与正常类球体之间的初始力学差异随时间推移而消失。另一项研究发现，在培养7天后类球体的布里渊频移增加，这归因于类球体尺寸增大和细胞数量增多16。
此外，已开展多模态研究，将布里渊显微镜与原子力显微镜（AFM）和流变学联用，以探究细胞和水凝胶的力学特性16,23,24。Rad 等人利用流变学方法对布里渊显微镜（BM）测得的趋势进行背景分析，确立了水凝胶聚合物浓度与纵向模量及储能剪切模量之间存在显著的正相关关系16。布里渊显微镜与光镊微流变学技术被用于测量在三维水凝胶中培养的癌细胞的力学性能23。该研究发现，与悬浮培养于水凝胶中的单个细胞相比，细胞在球形体中的力学异质性有所降低。
本研究详细描述了一种利用商用布里渊显微镜检测嵌入水凝胶中的活体球状体机械性能的实验方案（图1）。Berghaus 等人曾报道了一种构建高分辨率布里渊光谱仪并使用参考材料对其进行校准的详细步骤25。此外，Shi 等人提出了一种利用布里渊显微技术监测胚胎组织机械性能变化的方案26。本研究采用间充质干细胞（MSCs）球状体与聚乙二醇马来酰亚胺（PEG-maleimide）水凝胶构建三维模型，以模拟骨髓微环境，并探究该环境的机械特性。该三维模型有望揭示包括白血病、多发性骨髓瘤及继发性骨癌在内的骨髓疾病的力学特征。因此，本方案可直接应用于其他可能涉及力学生物学异常的疾病三维模型研究。文中详细阐述了球状体与水凝胶的制备、荧光成像以及布里渊显微技术。同时讨论了推荐的操作流程、可能存在的局限性以及技术的优化方向。详细的实验装置说明见图S1以及补充材料中的实验装置相关方法部分。

<table><tbody><tr><td>4臂PEG-马来酰亚胺（20 kDa）</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-455</td><td>https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k</td></tr><tr><td>AggreWell 400 培养板</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34411</td><td>http://stemcell.com/products/aggrewell400.html</td></tr><tr><td>空气间隔法布里-珀罗标准具</td><td>LightMachinery</td><td>HF-16074-660</td><td>https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/</td></tr><tr><td>防黏附冲洗液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td>https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html</td></tr><tr><td>Bold Line 顶置式培养箱</td><td>Okolab</td><td>H301-NIKON-NZ100/200/500-N</td><td>https://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n</td></tr><tr><td>Cobolt Flamenco-100 660 nm 激光器</td><td>Huebner</td><td>0660-05-01-0100-700</td><td>https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/</td></tr><tr><td>共焦环形器</td><td>LightMachinery</td><td>HF-13311</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-LEDi 荧光照明系统&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MBF83000</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi</td></tr><tr><td>EPI-FL 模块</td><td>Nikon</td><td>Ti2-LA-FL-3</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules</td></tr><tr><td>纤连蛋白（人源）</td><td>YoProteins</td><td>663</td><td>https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html</td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092</td></tr><tr><td>HyperFine 布里渊光谱仪</td><td>LightMachinery</td><td>HF-8999-PK-660</td><td>https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/</td></tr><tr><td>LED-DA/FI/TR/Cy5-B 四通道荧光滤光立方体</td><td>Nikon</td><td>MXR00753</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes</td></tr><tr><td>间充质干细胞（MSCs）</td><td>PromoCell</td><td>C-12974</td><td>https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html</td></tr><tr><td>电动平移台&amp;nbsp;</td><td>Prior Scientific</td><td>H117E2NN</td><td>https://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33</td></tr><tr><td>NucBlue&amp;trade; Live ReadyProbes&amp;trade; 试剂（Hoechst 33342）</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605</td></tr><tr><td>物镜，S Plan Fluor 20X NA 0.45，空气</td><td>Nikon</td><td>MRH08230</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708</td></tr><tr><td>ORCA-Fusion CMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C14440-20UP</td><td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html</td></tr><tr><td>PEG-二硫醇，2 kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PLS-613</td><td>https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g</td></tr><tr><td>sCMOS 相机&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Vision Solutions</td><td>01-IRIS-15-USB-M-16-C</td><td>https://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&amp;amp;vertical=tvs-photometrics&amp;amp;segment=tvs&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SPY555-肌动蛋白&amp;nbsp;</td><td>Spirochrome</td><td>CY-SC202</td><td>https://spirochrome.com/product/spy555-actin/</td></tr><tr><td>TemperatureApp</td><td></td><td></td><td>温度控制软件</td></tr><tr><td>VPM 肽，GCRDVPMSMRGGDRCG</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-2A 显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-2A</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用布里渊光谱技术对类球体进行力学图谱分析

Mechanical Mapping of Spheroids Using Brillouin Spectroscopy

布里渊光谱技术作为一种新兴方法，在生物医学科学领域正受到广泛关注，该技术通过无损、非接触式地探测样品的黏弹性与结构特性，使研究人员能够获取有关力学性能和组织结构的信息。该方法通过测量可见光与热激发声波/声子相互作用来评估三维样品的力学性质。布里渊光谱所提供的信息具有潜在应用价值 体内 生物物理学评估及疾病病理的潜在诊断。布里渊光谱技术的一个显著优势是能够评估生物样品内部微尺度的力学特性；而其他可达到此分辨率的传统技术，例如原子力显微镜，由于需要直接接触样品，仅能对二维样本进行探测。本研究描述了布里渊显微光谱技术在研究嵌入三维水凝胶基质中活体球状体生物力学中的应用。将细胞球状体包封于三维微环境中，可构建一种能高度模拟细胞与细胞外基质界面相互作用的球状体系统。 体内在本方案中，我们描述了球状体样品的制备方法、布里渊光谱的测量以及与荧光成像的顺序结合。此外，我们还讨论了光谱数据分析的流程及光学系统的相关技术细节。

扫描后获得的文件包括光谱、扫描拟合参数（.csv）、扫描参数与分析结果、布里渊频移（BFS）和线宽图、带有已标识扫描感兴趣区域的明场图像，以及用户界面窗口的截图。对于多维布里渊扫描的每个点，均获取一个BFS值。在图9中，展示了一个高分辨率扫描示例，同时显示了明场图像以及显示肌动蛋白丝和细胞核的荧光图像。需要注意的是，在本系统中，荧光成像主要用于辅助布里渊图谱的成像定位与结果解读，而非用于精确定量，因为显微镜配备的是落射荧光模块，而非共聚焦成像模块。在此情况下，样品的离焦荧光会影响有效分辨率。利用如图9所示的二维布里渊扫描数据和明场图像，可对类球体进行分割，并获得类球体的平均BFS值。该值可与凝胶的平均BFS进行比较。分割过程可借助Fiji（ImageJ）28或Napari Python插件29等工具实现。
使用一个简单的 Python 软件对类球体进行分割，以批量处理显...

本文介绍了一种利用布里渊显微光谱法在三维基质中对活体球状体进行力学表征的实验方案。该全光学方法可实现微米级分辨率的球状体成像，并提供定量的力学特性信息。该技术可用于力学表型分析，例如，用于确定三维微环境中肿瘤球状体的病理状态。

布里渊光谱技术作为一种在生物医学科学领域日益受到关注的新兴技术，可使研究人员获取与……相关的信息

我们正在利用布里渊光谱技术无创地评估细胞力学，以理解力学生物学在疾病进展中的作用。非侵入性技术（如布里渊光谱）可让我们在三维空间中表征力学特性，同时不干扰样本。首先，通过向微孔板的每个孔中加入500 µL抗黏附冲洗液，对孔进行预处理。将培养板在室温下以 1,300 ×g 离心五分钟。去除气泡后，移除孔中的防粘附冲洗液。随后，向每孔加入一毫升 PBS，并完全吸除。重复 PBS 洗涤后，根据实验设计确定每个类球体的细胞数量以及每孔凝胶中的类球体数量。离心收集细胞，并将其重悬于 1 毫升添加了补充物的 DMEM 培养基中。然后取 1 毫升该细胞悬液加入微孔板的一个孔中，并充分混匀。将培养板在室温下以100 ×g离心3分钟。在显微镜下观察微孔板，确认细胞分布均匀且已沉降至孔底。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，以促进球状体形成。收集类球体时，轻柔缓慢地移除培养基，避免扰动类球体。将经 PBS/FBS 包被的移液枪头剪开以扩大开口，每孔加入 500 µL PBS，使类球体脱离。将含有类球体的 PBS 收集至离心管中。然后将50微升类球体悬液转移至96孔板的一个孔中。为便于计数，用永久性记号笔在孔底画一个十字，在显微镜下计数该体积内的类球体数量。使用公式计算类球体的总数。打开 SpectraLok 软件，等待所有连接的设备被检测到。然后选择光谱仪相机。将丙烯酸立方体安装在显微镜样品架上，使透明面朝向物镜。尽可能降低物镜，并将立方体置于其正下方中心位置。确保显微镜的光路已设置为使光谱仪相机曝光，方法是将旋转端口选择器转至 L。在 SpectraLok 相机窗口中，将传感器曝光时间设置为 500 毫秒，软件增益设置为 100。点击“Capture”（捕获），然后缓慢向上移动物镜。继续升高物镜，直到布里渊峰变得可见且其强度稳定，表明焦点已位于丙烯酸立方体内。此时，打开泵浦阻挡器（PK）控制窗口。放大其中一个最亮的布里渊谱线，通过点击“move rel”以100微米为步长调节压力驱动器位置，以最小化瑞利峰的强度。如果瑞利信号增强，单击“反向”以改变调节方向。一旦瑞利峰强度降低，以10微米的更小步长精细调节法布里-珀罗标准具的压力。在相机窗口中，放大其中一个布里渊谱线。按 S 键可显示条纹，跨过这些条纹将 LUT 应用于相机图像。打开设置窗口，然后按快速校准以自动重新计算条纹的最佳水平偏移量。在确认条纹对齐后，调整准直透镜的轴线，以最大化泵浦光消除器到光谱仪的光耦合效率。然后打开光谱窗口，点击“展开”以获取光谱。在均匀的丙烯酸立方体中，应实现瑞利信号的完全抑制，并调节至布里渊信号清晰可见。为保存优化后的参数，在PK控制窗口中点击“全部刷新”，然后点击“全部保存”。最后，在主窗口中，单击“文件输入/输出”部分的“保存”以存储配置。打开扫描软件后，将装有水凝胶球状样品的玻璃底培养皿替换丙烯酸立方体安装到位。取下培养皿盖，加入足够的培养基以浸没凝胶，并在上方放置盖玻片以防止凝胶移动。首先阻断激光束以定位球状体。将显微镜光路切换至目镜，并打开白光照明。使用操纵杆手动控制样品台，以定位球状体并对其进行聚焦。获取类球体的明场图像，并通过旋转控制旋钮调节照明亮度。将光路切换至R位，使显微镜相机曝光，并根据需要设置曝光时间。接着，将显微镜端口设为L位，在激光仍被遮挡的情况下采集背景图像。解除激光封锁，根据所需的信噪比，选择 200 至 500 毫秒之间的曝光时间。从解包裹的光谱中，选取布里渊峰拟合范围。将阈值调整至布里渊峰强度的约一半，并排除幅度低于该阈值的所有布里渊峰。根据所有已识别的布里渊峰对，对激光进行波长校正。最后，通过调整扫描宽度和步长来选择光栅扫描模式，并开始扫描以记录测量数据。嵌入水凝胶中的间充质干细胞球体的代表性图像显示了清晰的布里渊频移和布里渊线宽图，以及相应的明场、细胞核和肌动蛋白丝荧光图像。根据明场图像中手动勾画的轮廓，将低分辨率布里渊频移图分割为凝胶区域和类球体区域。由于降采样导致的模糊像素被排除在分析之外，同时为凝胶和类球体区域建立了清晰的二值掩膜，以提取布里渊频移（BFS）值。高分辨率与低分辨率布里渊频移图的比较表明，核心采样所提供的平均布里渊频移值与高分辨率扫描结果相当，说明对类球体整体力学性质的测量具有一致性。本方案将提供一个平台，使研究人员能够研究多种与力学生物学相关的疾病。值得关注的是，与细胞力学特性相关的布里渊频移变化是否可作为疾病进展各阶段的有效标志物。我们将评估药物处理在模拟疾病进展的时间尺度上对类球体力学特性的影响。

mechanical-mapping-of-spheroids-using-brillouin-spectroscopy

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

利用布里渊光谱学对球体进行机械映射

来源： Huang, Y. et. al., 利用光学相干断层扫描对三维肿瘤类器官进行纵向形态学与生理学监测。J. Vis. Exp.

利用光学相干断层扫描技术对肿瘤类球体进行形态学与生理学监测

粒子追踪微流变学可用于无损地定量分析并空间定位三维肿瘤模型中细胞外基质力学性质的变化。...

利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

本文介绍了一种构建快速布里渊光谱仪的方案。通过级联虚拟成像相位阵列（VIPA）标准具，可实现比传统扫描法布里-珀罗光谱仪快1000多倍的测量速度。这一改进使得在低激光功率下对组织和生物材料进行活体（in...

用于布里渊散射分析的高速亚千兆赫光谱仪

我们提出了一种利用布里渊光散射光谱技术检测细胞外基质中弹性蛋白及胰蛋白酶纯化的I型胶原纤维的方案，以获取其完整的弹性特性。...

用于布里渊光谱分析的细胞外基质蛋白纤维制备

我们描述了一种快速连续波受激布里渊散射（CW-SBS）光谱仪的构建方法。该光谱仪采用单频二极管激光器和原子蒸气陷波滤光片，能够以比现有CW-SBS光谱仪快达100倍的速度，对浑浊或非浑浊样品进行高光谱分辨率的透射光谱测量。这一改进实现了高速布里渊材料分析。<br...

用于材料分析的高速连续波受激布里渊散射光谱仪

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

光子能带结构能够帮助理解受限电磁模式在光子晶体中的传播方式。在包含磁性元素的光子晶体中，这些受限且共振的光学模式伴随着增强和改变的磁光效应。我们描述了一种通过傅里叶空间显微术提取磁光能带结构的测量方法。...

光子纳米结构的光谱与角度分辨磁光表征

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本方案旨在对鸡胚神经管形成过程中神经板组织的力学特性进行纵向监测。该方法结合了布里渊显微镜与载物台式培养系统，可实现神经板组织在活体状态下的力学成像 体外孵化...

监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变

拉曼光谱是一种适用于活细胞、组织工程构建物及天然组织的非接触、无标记分析技术。可通过多元分析生成并分析具有来源特异性的光谱指纹。...

非接触式、无标记的细胞与细胞外基质拉曼光谱监测

学习利用布里渊显微光谱学对三维基质中的活细胞球体进行非侵入式机械特性分析。该方法可定量评估肿瘤球体的力学表型，为疾病进展研究提供重要工具。

利用布里渊光谱技术对类球体进行力学图谱分析

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