Name: 制备结 核分枝杆菌 培养滤液以了解结核病发病机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习制备结核分枝杆菌培养滤液的方法，通过质谱分析鉴定分泌蛋白，揭示其毒力因子及宿主调控机制，为开发抗耐药结核病新疗法提供研究基础。

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注意：此处，我们使用 H37Rv 致病性实验室菌株 Mtb应在生物安全三级实验室（BSL-3）中进行细菌培养的培养及培养上清液的分离操作。从菌种复苏到滤液制备的全过程均需在BSL-3设施中完成。
1. 接种 Mtb 培养
<ol>
	<li>生物安全三级实验室工作区域的准备
	<ol>
		<li>使用前打开生物安全柜的紫外灯照射10分钟。使用前后均需用75%乙醇清洁生物安全柜。根据生物安全指南，将使用过的材料丢弃至适当的废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初级和次级抗体的制备 Mtb H37Rv 培养物
	<ol>
		<li>从 -80 °C 取出甘油菌种保存液，在室温下解冻。使用四个独立的保存液样本作为生物学四重重复。</li>
		<li>取10 mL 7H9培养基（表1) 含10% ADC（9 mL 7H9培养基和1 mL ADC）的100 mL灭菌带螺口盖锥形瓶中。 
		注意：7H9 + ADC：7H9 为商业获取的富含营养的培养基，我们向其中添加 ADC（ADC：白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶）； 表 2ADC 和 OADC 均可用于培养菌种。锥形瓶可为培养物提供更好的通气效果，但也可使用组织培养瓶来培养细菌细胞。</li>
		<li>将全部甘油菌种接种至培养基中以复苏菌种，该菌液即为初级培养物。取A600约0.8生长 Mtb 用于制备甘油菌种保存液的培养物。将15%甘油与培养物混合 Mtb 将培养物放入冻存管中，并于 -80 °C 保存。</li>
		<li>将培养瓶置于37 °C摇床培养箱中，以100 rpm振荡培养3-4天。</li>
		<li>第5天th 天，在 600 nm 处测定吸光度（A600）。当培养物达到A600约0.8–1，以此培养物接种二级培养物，A600 ~0.2 接种于 500 mL 锥形瓶中的 100 mL 7H9 + 10% ADC 培养基中。对重复组执行相同步骤。
		<ol>
			<li>测定初级培养物在600 nm处的吸光度（A600）。如果A600600 约为 0.8，通过在 2100 x g 条件下离心沉淀菌体 g 10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL 7H9 + 10% ADC培养基中，测定A600。计算需向100 mL二级培养物中加入的接种量。600 ~ 0.2. 例如，若使用 A600 ~ 4 的菌液，则需将 5 mL 该培养物加入 100 mL 新鲜的含 10% ADC 的 7H9 二次培养基 A 中600 ~ 0.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在37 °C、100 rpm的摇床培养箱中培养2-3天，直至OD A600 ~0.8.</li>
		<li>使用装有滤芯吸头的移液器吸取10 µL菌液，在不含抗生素的LB琼脂平板上点样，操作在细菌操作台内进行。将平板于37 °C培养12–16 h，以观察是否存在细菌污染。若发现任何细菌污染，弃去原有培养物，并重新复苏实验所需的新培养物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在索森培养基中细菌的生长
	<ol>
		<li>在 A 处600约0.8，于A处接种细菌600 ~0.2，加入至500 mL三角瓶中的100 mL Sauton培养基内（表3）并在OD达到约0.8后继续培养3-4天。</li>
		<li>使用培养至 A 的培养物600 ~0.8（在Sauton培养基中，用于接种以制备培养滤液的培养物） 
		注意：7H9 + ADC 是一种富含营养的培养基，含有白蛋白。由于白蛋白会掩盖培养滤液中的蛋白质，因此不能用于分泌组分析。故使用Sauton培养基制备培养滤液。Sauton培养基通过重组上述所列成分进行配制。 表3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备 Mtb 培养滤液蛋白 
<ol>
	<li>培养上清液离心
	<ol>
		<li>使用Sauton初代培养物接种300 mL Sauton继代培养物，接种量为A600 ~0.2。培养至 OD A600 约为0.4–0.5。使用处于对数生长期早期且生长活跃的培养物，以避免死细胞污染。
		<ol>
			<li>测量二次培养物的OD值。当OD值达到A600 ~0.8时，于2,100 x g离心收集菌体 g 10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL Sauton培养基中，重新测定OD值。根据测得的OD值，计算需加入300 mL、OD为0.2的培养物中的接种量。例如，若OD值为8，则需将7.5 mL该培养物加入300 mL新鲜Sauton培养基中，使终OD值为0.2。 
			注意：请严格遵循所述的OD值，以减少细胞裂解和GroEL污染。GroEL是一种分子伴侣，在细菌细胞中组成型表达。一些文献报道，在培养滤液中可检测到GroEL，这是由于细胞生长过程中受到应激所致。本实验采用Sauton培养基制备培养滤液，该培养基会对细胞产生轻微应激，因此培养滤液中可能存在GroEL。此外，若培养物OD值超过1，将导致细胞裂解，进而引起培养滤液中GroEL的污染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将300 mL培养液分装至6个50 mL离心管中，于2,100 × g离心收集菌体 g 4 °C 下 10 分钟图1A).</li>
		<li>每次使用25 mL血清移液管吸取45 mL上清液至新离心管中，保留沉淀物不扰动。将沉淀物留作全细胞裂解液（WCL）的制备。</li>
		<li>以 2,100 x 重复离心 g 4 °C下离心10分钟。用25 mL移液管吸取40 mL上清液（保留5 mL培养液不扰动）至新管中，重复离心步骤。</li>
		<li>吸取35 mL上清液至新离心管中，使用0.2 µm注射器滤器过滤培养上清液，滤入新离心管以去除病原性细菌污染。每300 mL培养液可获得210 mL滤过培养液作为每个重复样本。 
		注意：此处用于过滤培养滤液的滤器为 0.22 µm 的无菌注射器滤器（型号 SY25PL-S）。.</li>
		<li>过滤培养滤液后，取1 mL滤过培养滤液接种于琼脂平板，置于37 °C培养箱中培养4周，以确保检测培养滤液中是否存在其他致病性细菌污染。另取1 mL全细胞裂解物（WCL）样品，并采取相同的安全防护措施。</li>
		<li>用75%乙醇擦拭样本管，然后通过传递窗将其移出BSL-3实验室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞裂解液的制备
	<ol>
		<li>将沉淀重悬于 1 mL 含苯甲基磺酰氟（PMSF）和 1× 蛋白酶抑制剂混合物的 1× PBSG 中，然后将裂解液转移至含有 1/3 体积珠磨珠的 2 mL 螺口珠磨管中rd 0.1 mm 氧化锆珠的体积 
		注意：1x PBSG 由 1x PBS 加 5% 甘油配制而成。取沉淀与缓冲液体积比为 1:3。</li>
		<li>使用微型珠磨机通过珠击法裂解样品：珠击1分钟，随后在冰上孵育2分钟，重复此步骤8次。</li>
		<li>将离心管在18,000 x g 4 °C下离心15分钟。将上清液收集至新的1.5 mL微量离心管中，置于冰上保存。</li>
		<li>重复离心步骤。将上清液通过0.2 µm注射器滤器，以消除病原菌污染。 
		注意：此处用于过滤培养滤液的滤器为无菌的一次性注射器滤器，孔径0.22 mm（型号SY25PL-S）.</li>
		<li>用75%乙醇擦拭样本，通过传递窗带出BSL-3实验室。按照下文所述，使用BCA检测试剂盒检测裂解液的浓度。将裂解液于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用离心过滤装置浓缩培养滤液中的蛋白质。
	<ol>
		<li>使用离心过滤装置浓缩 210 mL 结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液蛋白。采用 3 kDa 15 mL 离心过滤管（centricons）将培养滤液浓缩至约 1 mL。图1A3 kDa的离心过滤管可截留分子量等于或大于3 kDa的蛋白质。</li>
		<li>将每份约15 mL的培养滤液重复样加入一个Centricon超滤管中，在2,100 x g 4 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>根据规范弃去穿流液，并重复步骤 2.3.2 共 15–16 次，直至 210 mL 的培养滤液浓缩至约 1 mL。</li>
		<li>将浓缩的培养滤液蛋白分装至十个低蛋白吸附的微量离心管中，每管100 µL，并使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浓缩蛋白质的估算
	<ol>
		<li>以牛血清白蛋白（BSA）为标准品估算蛋白浓度。在96孔板中，每孔加入25 µL体积，分别设置含1 µg、2 µg、3 µg和4 µg BSA的双复孔。若样品未经稀释，则使用以PBS稀释5倍的样品，每孔25 µL，设置双复孔进行测定。同时设置不含样品的空白对照（Blank），每孔加入25 µL PBS。</li>
		<li>根据制造商说明书，加入175 µL混合试剂。使用多通道移液器混匀样品，并在37 °C孵育1小时。使用酶标仪在562 nm处读取吸光度值。从空白孔的读数中扣除相应数值，以获得BSA及各样品的净吸光度值。</li>
		<li>将标准曲线拟合为线性回归曲线，并根据标准品估算样品浓度。按照BCA试剂盒的蛋白质定量说明书进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用不同标记物确认培养滤液蛋白
<ol>
	<li>考马斯亮蓝染色法检测蛋白质
	<ol>
		<li>为确认培养滤液中存在蛋白质，取30 µg蛋白质，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE；表4）中进行分离。 
		注意：请参照表格说明配制SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及脱色溶液。</li>
		<li>向凝胶中加入20 mL考马斯亮蓝染色液（表5），在室温下于摇床上孵育30分钟。弃去染色液。</li>
		<li>向凝胶中加入30 mL脱色液（表6），在室温下于摇床上孵育30分钟。弃去脱色液，并加入新鲜脱色液。重复此步骤，直至凝胶充分脱色。</li>
		<li>在透射成像仪上观察蛋白质条带（图1B）。由于培养滤液蛋白含有多种蛋白质，脱色后可在凝胶上观察到蛋白质条带组成的条纹状信号（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分泌蛋白标志物的Western印迹验证
	<ol>
		<li>使用分泌蛋白的特异性抗体检测其在培养滤液中的存在。Ag85B（ab43019）是培养滤液中一种已知的结核分枝杆菌（Mtb）分泌蛋白，同时存在于胞质中；Ag85B抗体（浓度5 mg/mL，以5% BSA溶液稀释至1:5000）用作分泌蛋白的阳性对照。</li>
		<li>将全细胞裂解物（WCL）与培养滤液蛋白共同上样，以区分胞质/膜蛋白与分泌蛋白组分。Ag85B既存在于胞质又可分泌，因此应在两个组分中均能检测到；而PknB已知定位于细胞膜，不会出现在培养滤液中。</li>
		<li>利用BCA试剂盒测定WCL/培养滤液中蛋白质浓度。将30 µg WCL/培养滤液与2×上样缓冲液混合至终体积为30 mL（表7）。使用SDS电泳运行缓冲液（表8）在10% SDS-PAGE（检测PknB）和12% SDS-PAGE（检测Ag85B）中电泳，直至染料前沿到达凝胶底部。注意避免染料前沿跑出凝胶。 
		注意：Ag85B分子量约为35 kDa，因此使用12% SDS-PAGE。</li>
		<li>裁剪9 cm × 6 cm大小、孔径0.2 µm的硝酸纤维素膜，用于将蛋白质从凝胶转移至膜上（表9）。使用转移夹板进行转膜装置组装，将夹板、泡沫垫、滤纸、凝胶和膜均浸入预冷的1×转移缓冲液中。</li>
		<li>将一块泡沫垫置于夹板一侧，依次放置一张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜（置于凝胶上方）、另一张滤纸，最后再盖上一块泡沫垫并闭合夹板。将夹板放入转移槽中，确保膜面朝向阳极，凝胶面朝向阴极。</li>
		<li>连接阴极和阳极导线完成电路，设定电流为120 mA，持续120分钟。在低温室中开始转膜。</li>
		<li>转膜完成后，将膜放入一个小塑料盒中。加入10 mL用1× PBST20配制的5% BSA溶液，在摇床上室温封闭1小时，以减少非特异性结合。</li>
		<li>弃去封闭液，加入5–10 mL一抗（即抗小鼠Ag85B抗体，用5% BSA溶液稀释至1:5,000），在4 °C摇床上孵育过夜。抗体可储存于-20 °C，并可重复使用最多3次。</li>
		<li>弃去一抗，加入5–10 mL 1× PBST20，在室温下剧烈振荡洗涤8分钟。弃去第一次洗涤液，再次加入5–10 mL 1× PBST20进行洗涤。重复该步骤共2次。</li>
		<li>加入5–10 mL含二抗的1× PBST20溶液，二抗为抗小鼠HRP（辣根过氧化物酶）偶联抗体（1:10,000稀释），在摇床上室温孵育2小时。</li>
		<li>二抗孵育后，参照步骤3.2.9进行膜的洗涤。加入等体积的HRP底物与增强剂，在化学发光成像仪下显影（图1C）。 
		注意：为确认无胞质蛋白污染，我们使用抗PknB抗体对Western印迹进行探查（图1C）。该抗体由印度国家免疫学研究所动物设施针对纯化的PknB胞外结构域制备。可在WCL中观察到PknB条带，但在培养滤液中未见，表明PknB为纯粹的胞质及膜结合蛋白，不应存在于培养滤液中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 质谱分析样品的制备
<ol>
	<li>使用胰蛋白酶进行溶液内蛋白质消化。
	<ol>
		<li>取100 µg培养滤液蛋白，加入6倍体积的预冷丙酮，于-20 °C放置过夜。 
		注意：用于质谱样品制备的所有试剂均应使用玻璃器皿配制。使用低蛋白吸附的微量离心管和低蛋白吸附枪头。避免使用塑料制品，以防质谱分析中引入聚合物污染。</li>
		<li>在4 °C下以18,000 × g离心30分钟，沉淀蛋白质。弃去上清液。</li>
		<li>用500 µL丙酮洗涤沉淀物，在4 °C下以18,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并使用真空浓缩仪去除残留丙酮。</li>
		<li>加入20 µL溶于25 mM碳酸氢铵中的8 M尿素溶液（用质谱级水配制的2 M储存液）。涡旋混匀样品，并在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>加入60 µL 25 mM碳酸氢铵溶液，将尿素浓度从8 M稀释至2 M。室温孵育1小时。加入4 µL TCEP（终浓度10 mM，溶于25 mM碳酸氢铵），在室温下孵育30分钟，同时以1,800 × g振荡。</li>
		<li>加入4 µL IAA（终浓度25 mM，溶于25 mM碳酸氢铵），在室温下避光孵育30分钟，同时以1,800 × g振荡。随后加入110 µL 25 mM碳酸氢铵溶液。</li>
		<li>向溶液中加入胰蛋白酶（酶与蛋白质量比为1:20；胰蛋白酶:蛋白，单位为µg），于37 °C、300 rpm振荡条件下过夜消化（图2）。加入10%三氟乙酸（TFA）终止消化反应。使用真空浓缩仪将样品完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品脱盐
	<ol>
		<li>向消化后的肽段中加入100 µL含5%乙腈（ACN）和0.1% TFA的溶液。在室温下以1,500 rpm涡旋30分钟。</li>
		<li>在室温下以18,000 × g离心10分钟。小心吸取上清液（肽段），避免接触沉淀，转移至新的微量离心管中，进行脱盐处理。脱盐前需预先配制好所有洗涤和洗脱溶液。</li>
		<li>使用100 µL含100%乙腈和0.1% TFA的溶液对C-18柱尖进行平衡，通过移液操作重复5次。</li>
		<li>加入100 µL含50%乙腈和0.1% TFA的溶液，重复操作5次。再加入100 µL含5%乙腈和0.1% TFA的溶液，重复操作5次。</li>
		<li>通过移液操作30次，使肽段充分结合至C-18柱尖。将样品保存于-20 °C，直至进行质谱分析。此时肽段已结合至C-18柱上。</li>
		<li>使用100 µL质谱级水加0.1% TFA溶液对C-18柱进行洗涤，移液操作重复5次。</li>
		<li>使用100 µL含5%乙腈和0.1% TFA的溶液对C-18柱洗涤，重复操作5次。然后使用100 µL含50%乙腈和0.1% TFA的溶液通过移液操作30次洗脱肽段（图2）。 
		注意：洗脱完成后，C-18柱尖可保存于4 °C，直至完成质谱分析。</li>
		<li>将洗脱所得肽段溶液使用真空浓缩仪完全干燥，并储存于-20 °C，待用于质谱分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肽段样品注入质谱仪。
	<ol>
		<li>向干燥的肽段样品中加入20 µL溶液A（由质谱平台提供）。涡旋混匀30分钟，并在4 °C下离心90分钟。</li>
		<li>取20 µL样品注入质谱仪，进行90分钟梯度分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 培养滤液中分泌蛋白的数据分析
<ol>
	<li>蛋白质鉴定
	<ol>
		<li>使用四极杆质谱仪分析蛋白质组学样品。将获得的质谱图与&#160;Mtb H37Rv&#160;UniprotKB数据库进行比对。</li>
		<li>设定母离子和碎片离子的质量容差分别为10 ppm和0.5 Da。酶选择胰蛋白酶，最大漏切位点数为2。</li>
		<li>使用Sequest作为搜索算法的蛋白质组学软件，半胱氨酸的羧氨甲基化设为固定修饰。</li>
		<li>在1%错误发现率下鉴定所有肽段-谱图匹配（PSM）。其余参数采用默认设置。</li>
		<li>将肽段序列的原始质谱文件与相应&#160;Mtb&#160;蛋白质的UniProt ID进行比对。利用Mycobrowser数据库列出所有&#160;Mtb&#160;蛋白质、其UniProt ID及功能分类。</li>
		<li>为进一步分析，将已鉴定蛋白质的UniProt ID映射至其对应的Rv编号。通过PRIDE合作伙伴将质谱分泌组数据提交至ProteomeXchange联盟数据库。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用培养滤液蛋白处理H37Rv以检测宿主信号通路的变化
<ol>
	<li>从小鼠中分离腹腔巨噬细胞 
	注意：参照参考文献21 用于腹腔巨噬细胞的分离、细胞接种及感染。
	<ol>
		<li>向4-6周龄Balb/c小鼠腹腔注射1 mL 4%巯基乙酸盐，于第4天从小鼠腹腔分离腹腔巨噬细胞th 感染当天21 (图3).</li>
		<li>通过向小鼠腹腔注射1×PBS收集巨噬细胞。以1,800 × g离心细胞 g 5分钟，弃去上清液，加入5 mL添加了10% FBS（胎牛血清；完全培养基）和1×青霉素-链霉素（抗生素）的1640-RPMI培养基。</li>
		<li>接种 3 × 105 每孔接种细胞至24孔板中，置于37 °C培养箱中过夜培养。次日更换为新鲜的完全培养基，细胞即可用于感染或用培养滤液蛋白处理。 &#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用培养滤液蛋白处理腹腔巨噬细胞
	<ol>
		<li>将巨噬细胞转移至BSL-3实验室，并置于培养箱中孵育。用1 mg/mL的培养滤液蛋白处理细胞。图3在培养滤液处理后的不同时间点（4 h、24 h 和 48 h）收集细胞。
		<ol>
			<li>在每个时间点，将分离的巨噬细胞以每孔三复孔的方式接种于24孔板中。加入1 mg/mL的培养滤液蛋白处理细胞，并在含CO₂的37 °C培养箱中孵育。2在处理后的 4 h、24 h 和 48 h 三个时间点收集细胞。</li>
			<li>用i) 2倍浓度的lamella缓冲液处理细胞以制备巨噬细胞裂解液，并通过Western印迹检测不同的宿主细胞标志物；ii) 根据试剂盒制造商提供的说明，使用不同的缓冲液进行免疫学检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备宿主细胞裂解液，检测不同标志物、宿主细胞的细胞因子谱，以及经培养滤液处理的巨噬细胞中多种信号通路相关蛋白的表达。 
		注意：如果实验室拥有分泌途径蛋白的基因替换突变株，则可从其培养滤液中制备 Mtb H37Rv 以及 Mtb 突变体可用于评估其对宿主免疫调节参数的影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Preparing Mtb Secretome to Study Host-Pathogen Interactions

<ol><li>Campbell, I. A., Bah-Sow, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+tuberculosis%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment.</a> Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).</li>
<li>Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate+proteins+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%2C+N-terminal+amino+acid+sequencing%2C+and+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry.</a> Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).</li>
<li>Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EsxA+and+EsxB+are+secreted+by+an+ESAT-6-like+system+that+is+required+for+the+pathogenesis+of+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).</li>
<li>Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+nonredundant+SecA+homologues+function+in+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria.</a> J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).</li>
<li>Feltcher, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+reveals+a+role+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+SecA2+pathway+in+exporting+solute+binding+proteins+and+Mce+transporters+to+the+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).</li>
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<li>Saint-Joanis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Rv2525c%2C+a+substrate+of+the+twin+arginine+translocation+%28Tat%29+system+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+increases+beta-lactam+susceptibility+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence.</a> J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一个关键的研究领域是了解结核分枝杆菌（Mtb）的致病机制，并开发有效的诊断方法和疫苗22,23。从Mtb培养基中分离培养滤液蛋白，是一种能够鉴定病原体所分泌毒力因子的方法。研究分泌蛋白在调控Mtb致病过程中的作用，不仅可以获得机制性认识，还可能为治疗干预提供候选靶点。研究表明，H37Rv菌株的培养滤液中含有能够调节宿主细胞稳态、细胞过程及转录调控的蛋白质。某些培养滤液蛋白有助于细菌侵入宿主细胞，并帮助细菌在巨噬细胞内存活。这些蛋白可操控宿主细胞信号通路，为细菌生存创造适宜的微环境。
本方案详细介绍了结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液的制备流程，从在生物安全三级（BSL-3）实验室中复苏致病性Mtb菌株开始，培养至获得用于分离培养滤液的目标对数生长期细菌培养物。方案涵盖质谱分析前的样品制备及后续的数据分析。此外，我们还介绍了利用培养滤液处理腹腔巨噬细胞以评估其生物学...

结核分枝杆菌（Mtb），这种全球最致命的病原体之一，可通过感染者打喷嚏或咳嗽时产生的气溶胶传播，感染健康个体1进入肺部后，它会被肺泡巨噬细胞吞噬，并劫持宿主免疫系统以维持自身存活。在多种宿主调节机制中 Mtb 生存所需的因素之一是分泌型毒力因子。细菌在生长过程中分泌到培养基中的蛋白质被称为培养滤液（CF）蛋白。2这些培养滤液蛋白有助于细菌在宿主细胞内的恶劣环境中存活。 Mtb 具有三种不同类型的分泌系统：一种特化的Ⅶ型分泌系统（T7SS）、一种通用的Sec分泌系统（Sec系统）和一种双精氨酸分泌系统（Tat系统）。T7SS是放线菌中最特有的分泌系统，不同于革兰氏阴性菌中的Ⅰ至Ⅵ型分泌系统3跨膜分泌非折叠蛋白主要由Sec系统介导，这些蛋白通过其N端信号序列被识别。4,5折叠或部分折叠的蛋白质通过Tat系统进行转运，该系统由N端含有双精氨酸基序的信号序列所识别6,7Sec 和 Tat 系统如何调控蛋白质分泌仍有待阐明。
已知在结核分枝杆菌（Mtb）中，某些培养滤液蛋白有助于抵御并存活于宿主感染后产生的氧化攻击，例如过氧化氢酶（KatG）和超氧化物歧化酶（SodA）8,9，这些酶对于降解活性氧物种至关重要。此外，CFP10-ESAT6 是一种异源二聚体蛋白复合物，在调节细胞因子反应、细菌逃逸及活性氧（ROS）产生等方面发挥关键作用10。RD1 基因座参与调控Ⅶ型分泌系统，该系统包括 CFP10-ESAT6 的分泌；而cpf10-esat6基因的缺失会损害细菌在离体（ex vivo）和体内（in vivo）感染模型中的存活能力。Mycobacterium bovis BCG 疫苗株缺乏负责分泌毒力因子的 RD1 基因座，因此可作为减毒活疫苗使用11。多种尚未充分研究的细胞过程严格调控着这一分泌过程。培养滤液蛋白中含有促进复苏因子（RpFs），可帮助细菌从潜伏状态重新生长。复苏促进因子（Rpfs）是一类肽聚糖水解酶，已知在休眠过程中发挥作用。Mtb 编码五种rpf类似基因（rpf A-E），这些基因可单独作用或通过与其他蛋白相互作用，帮助细菌从休眠状态恢复生长12。Rpfs 存在于细菌培养滤液中，已被证实参与Mtb的毒力及宿主免疫反应13,14。被广泛研究的rpf基因rpfE和rpfB在体外（in vitro）显示出保护性免疫效应13，并在体内（in vivo）增强免疫应答。因此，rpfE和rpfB可作为Mtb疫苗候选抗原。
可逆磷酸化15是一种翻译后修饰，能够调节多种细胞过程、细胞稳态、细胞分裂等。例如，CFP10的磷酸化具有重要的调控作用，其中CFP10的磷酸化缺陷突变体和磷酸化模拟突变体均无法恢复CFP10-ESAT6缺失株中观察到的表型16。另一方面，SecA2是一种参与宿主细胞DNA损伤的分泌蛋白17。SecA2突变株的分泌组足以改变宿主的免疫应答和信号级联反应18,19。因此，研究H37Rv及分泌蛋白基因被敲除的Mtb突变株（未发表数据）的分泌组，对于理解它们如何影响宿主免疫调节和存活具有重要意义且令人兴奋。
本报告重点关注以下三个方面：制备结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液的步骤、将样品处理用于质谱分析的方法，以及利用培养滤液进行离体（ex vivo）实验以检测其免疫调节功能。早期研究通过二维凝胶电泳分离培养滤液蛋白，随后进行质谱分析，实现了对培养滤液蛋白的鉴定8。已有研究利用质谱技术鉴定了药物敏感株和耐药株的培养滤液蛋白，以深入了解分泌组的变化，并识别可能在耐药性中发挥作用的毒力因子20。我们此前已借助质谱技术研究过Mtb的分泌组和磷酸化分泌组16。诸如二维凝胶电泳等技术通量较低，难以用于全面分析蛋白质组或分泌组的全局变化。培养滤液中的蛋白质会因细菌菌株、细胞生长阶段以及不同应激条件而有所差异。在不同条件下，细胞内分泌蛋白库的变化为整体性探索整个分泌组提供了机会，也有助于更深入地了解细菌分泌系统，从而为治疗干预提供依据。进一步研究分泌系统基因敲除株或蛋白耗竭株的分泌组，将更有助于揭示各分泌途径的相关通路与作用靶点。使用培养滤液蛋白而非完整细菌处理细胞，可改变细胞因子水平及其他免疫调节因子的表达17。通过分泌组研究，可鉴定新的毒力因子并阐明其在致病过程中的作用。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>mdi</td><td>SYPL0601MNXX204</td><td></td></tr><tr><td>0.2&amp;micro;m 硝酸纤维素膜</td><td>Amersham</td><td>10600001</td><td></td></tr><tr><td>37% 盐酸</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>EMPLURA MERCK</td><td>SL9F690866</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851-2L</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>BIORAD</td><td>1610107</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白</td><td>Bio Basic Canada</td><td>货号：AD0023</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck, Millipore</td><td>UFC900396</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ag85B 抗体</td><td>Abcam</td><td>AB43019</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的抗小鼠二抗</td><td>Thermo Fischer</td><td>62-6520</td><td></td></tr><tr><td>天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-500G</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>SIGMA</td><td>146072-500G</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>MB083-500G</td><td></td></tr><tr><td>C-18 柱</td><td>Thermo Fischer</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759-500G</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middle brook 7H9 肉汤&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>甲酸 98-100%</td><td>Merck</td><td>Z0823704246</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸 100%</td><td>Merck</td><td>CD0C700160</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>SIGMA</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immobilion Western 化学发光 HRP 底物</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Amersham</td><td>RPN6302V</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mycobroswer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>油酸</td><td>Sigma</td><td>货号：O1008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Fischer</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 胰蛋白酶蛋白酶</td><td>Thermo Fischer</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive HF（Thermo Scientific）（蛋白质组学实验——肽段测序、蛋白质鉴定与定量）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>货号：S3014</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7773-1KG</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-1KG</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AMRESCO</td><td>0234-500G</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>UniProt 蛋白质数据库</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>MP Bio</td><td>194857</td><td></td></tr></tbody></table>

制备 结核分枝杆菌 利用培养滤液研究结核病发病机制

Preparation of Mycobacterium tuberculosis Culture Filtrate to Understand TB Pathogenesis

结核分枝杆菌（Mtb）会向宿主细胞分泌多种蛋白质，以调控宿主的多种细胞过程，例如宿主信号通路、免疫应答、细胞凋亡等，从而增强其存活能力。尽管少数分泌因子的功能已被阐明，但仍有大量分泌蛋白尚未被表征。因此，研究Mtb的分泌蛋白是当前重要的科研方向。Mtb在三种不同的分泌系统——通用分泌系统、双精氨酸转运系统以及特化的Ⅶ型分泌系统——的协助下，将蛋白质分泌至胞外空间。为了鉴定新的分泌分子并功能表征已知因子，研究人员需要制备分泌组（secretome）。本文概述了分泌组制备及质谱分析样品前处理的方法。分泌组的制备需格外谨慎，以避免胞质蛋白的污染，可通过使用针对已明确表征的膜蛋白、分泌蛋白和胞质蛋白的抗体进行检测来监控污染情况。所获得的培养滤液可用于多种研究目的，包括探究其对宿主免疫调节的特性。

在本实验方案中，我们展示了从Mycobacteria中分离培养滤液蛋白的方法（图1A）。随后通过检测多种标志物来验证培养滤液蛋白的分离效果。如方案所述，采用考马斯亮蓝染色检测蛋白上样量。在WCL组分中可观察到呈条带状分布的蛋白条带（最末泳道，图1B），而在CF（培养滤液）泳道中，所有蛋白均不可见，且各泳道的蛋白上样量均一。通过使用不同抗体进行蛋白质印迹（Western blot）检测所分离的不同组分。其中，Ag85B用于检测培养滤液组分，在图1C中可见大小约为35 kDa的蛋白条带，该条带在培养滤液和WCL中均存在。PknB用于检测胞质组分，在图1C中，大小约为75 kDa的PknB条带仅出现在WCL中，而未在培养滤液组分中检出，表明培养滤液的分离未受到胞质蛋白的污染。
将培养滤液蛋白用于质谱样品制备（<strong class...

本文演示了结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液（CF）的制备方法，该滤液是含有细菌分泌蛋白的培养基。Mtb通过分泌蛋白质来调控宿主的信号通路和免疫应答，这对致病过程至关重要。所制备的CF通过质谱分析，以鉴定所有分泌因子。

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）向宿主细胞分泌多种蛋白质，以调控多种细胞过程，例如宿主信号转导、免疫应答等。

结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液的分泌物有助于揭示该病原体分泌的毒力因子或其他蛋白质，从而为治疗干预提供线索。在此，我们试图鉴定细菌分泌的蛋白质，以了解Mtb的分泌系统、其未知的毒力因子以及这些因子在宿主内调控宿主细胞以利于病原体存活的作用机制。在Mtb研究领域，可使用如贝达喹啉、德拉马尼等药物来治疗耐多药（MDR）及广泛耐药菌株。目前，针对耐多药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核分枝杆菌的药物研发以及结核分枝杆菌（Mtb）疫苗的开发仍在持续进行中。由于患者对药物治疗方案的依从性差，Mtb 的耐药性正变得越来越严重。治疗 MDR 和 XDR 菌株是 Mtb 研究领域中最具有挑战性的任务。本研究团队在该领域已取得多项重要发现。本实验室揭示了结核分枝杆菌（Mtb）中CFP-10磷酸化对其毒力的影响，并建立了Mtb的磷酸化蛋白质组、磷酸化分泌组及分泌网络。此外，本实验室发表的一项研究还表明，SecA2分泌系统介导了宿主细胞的DNA损伤。使用经培养过滤的蛋白质而非细菌处理细胞，会改变细胞因子水平及其他免疫调节因子。通过分泌物研究，可以鉴定新的毒力因子及其在致病性中的作用。首先，从-80摄氏度取出四份独立的结核分枝杆菌（Mtb）甘油菌种，并在室温下解冻。取10毫升含10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶的7H9培养基，加入带有螺旋盖的100毫升高压灭菌锥形瓶中。将全部解冻的甘油菌种接种至该培养基中以复苏菌种，作为初级培养物。将培养瓶置于37摄氏度摇床培养箱中，以每分钟100转的速度振荡培养3至4天。第五天，测定600纳米处的吸光度。当菌液的光密度达到0.8至1.0时，将其接种于含有10% ADC的100毫升7H9培养基中，接种至500毫升的锥形瓶中，用于继代培养。将继代培养物置于37摄氏度的摇床培养箱中，以每分钟100转的速度培养2至3天。当600纳米处的光密度达到约0.8时，使用带滤芯吸头的移液器吸取10微升菌液，在细菌操作台内将其点种于不含抗生素的LB琼脂平板上。将平板在37摄氏度下培养12至16小时，以检测细菌污染情况。随后，将无污染的二次培养菌接种至500毫升锥形瓶中的100毫升Sauton培养基中。在37摄氏度下培养菌液三至四天，直至光密度达到约0.8。使用光密度约为0.8的Sauton培养基培养的菌液接种新的300毫升培养物，用于滤液制备。首先，获取在Sauton培养基中培养的300毫升对数生长期的结核分枝杆菌（Mtb）菌液。在4°C条件下，将50毫升离心管中的细胞以2,100 × g离心10分钟。使用25毫升血清移液管将45毫升上清液转移至新离心管中，并将未触碰的沉淀物保留用于全细胞裂解液的制备。将上清液再次在4°C条件下以2,100 × g离心10分钟。将40毫升上清液转移至新管中，留下5毫升不移动。使用0.2微米注射器滤器将培养上清液过滤至新管中。取1毫升培

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培养滤液蛋白（CFPs）的分离与分级 结核分枝杆菌

学习制备结核分枝杆菌培养滤液的方法，通过质谱分析鉴定分泌蛋白，揭示其毒力因子及宿主调控机制，为开发抗耐药结核病新疗法提供研究基础。

制备结核分枝杆菌利用培养滤液研究结核病发病机制

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