Name: 人 BAMBI高MFGE8高 脐带来源的间充质基质细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 学习从人脐带间充质基质细胞中分离BAMBI高MFGE8高亚群的方法，用于干细胞生物学和再生医学研究。该方案结合单细胞转录组分析与流式细胞术分选，有助于理解细胞异质性并优化特定疾病的细胞治疗策略。

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本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82271843）的资助。

本研究遵循1989年《赫尔辛基宣言》提出的原则，并经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准（批准号：202019701）。人脐带来自南京大学医学院附属鼓楼医院健康产妇自然分娩后，产妇均已知情同意将其用于本研究。人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的分离方法如先前报道所述11。
1. 分离前脐带间充质干细胞的培养与鉴定
<ol>
	<li>当MSCs达到70-80%融合度（P0代）时，用PBS洗涤细胞一次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育2分钟。随后加入9 mL完全培养基以中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟收集细胞。弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将每皿细胞分种至三个T75培养瓶（P1代），置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。</li>
	<li>经胰蛋白酶消化传代2次后，在P3代时按照步骤1.1所述方法收获细胞。离心后弃去上清液，将细胞重悬于FACS染色缓冲液（含2% FBS的1× PBS）中并进行细胞计数。用FACS染色缓冲液调整细胞浓度至终浓度为5-10 × 106 个细胞/mL，并将细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>将上述细胞悬液按每管100 µL分装至不同的1.5 mL离心管中。在4 °C条件下，向各管中分别加入同型对照抗体以及针对CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、CD79和HLA-DR的FACS抗体（均为1:200稀释），避光孵育30分钟。</li>
	<li>用FACS染色缓冲液洗涤细胞两次，每次在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀细胞重悬于200 µL FACS染色缓冲液中，用于流式细胞术分析以鉴定MSC表面标志物。</li>
</ol>
2. 通过流式细胞术分离BAMBIhigh MFGE8high UC-MSCs
<ol>
	<li>分离BAMBIhighMFGE8high UC-MSC时，将UC-MSC培养至密度约为5-10 × 106个细胞。用0.5 mM EDTA消化细胞5分钟，直至细胞开始呈现圆形形态，加入完全培养基将细胞转移至15 mL锥形管中，并反复吹打细胞悬液数次以制备单细胞悬液。取10 µL细胞悬液进行细胞计数，计算收获的细胞总数。将含细胞悬液的锥形管在300 × g下离心5分钟以收集细胞。</li>
	<li>将细胞重悬于1 mL完全培养基中，终浓度为5-10 × 106个细胞/mL，并将细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>将细胞分装至四个1.5 mL微量离心管中（仅空白细胞；BAMBI标记细胞；MFGE8标记细胞；以及同时标记BAMBI和MFGE8的细胞）。</li>
	<li>向各管中加入适当浓度的一抗（MFGE8和BAMBI，均为1:100），混匀后室温孵育15分钟。</li>
	<li>用1× PBS洗涤标记后的细胞一次，并在300×g下离心5分钟。弃去上清液。将细胞重悬于1 mL完全培养基中，加入偶联荧光二抗（山羊抗兔IgG H&amp;#38;L Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647，均为1:1,000），混匀后避光室温孵育15分钟。</li>
	<li>按照步骤2.5所述方法，用1× PBS洗涤标记细胞一次。将细胞重悬于500 µL完全培养基中，经70 µm细胞筛过滤以去除团块和碎片，将滤液转移至15 mL管中用于流式细胞分选。</li>
	<li>运行未加抗体的空白细胞管（阴性对照），调节前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），以确定抗体染色阴性群体的设门范围。</li>
	<li>运行单抗体标记的细胞管（即MFGE8 + 山羊抗兔IgG H&amp;#38;L Alexa Fluor 488，或BAMBI + 山羊抗兔IgG H&amp;#38;L Alexa Fluor 647）作为设门对照，以确定图中阳性信号的起始位置。</li>
	<li>运行实验样本管进行分选，收集BAMBIhighMFGE8high细胞群体。</li>
	<li>将分选后的BAMBIhighMFGE8high MSC接种于24孔板中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。</li>
	<li>当分选后的BAMBIhighMFGE8high MSC传代两次以获得足够数量的细胞后，消化细胞并进行分选后分析，通过流式细胞术确认分选细胞群体的纯度，操作如步骤2.1–2.9所述。或者，若收集的细胞数量过少，可采用针对人BAMBI和MFGE8表达的传统免疫荧光法检测分选细胞的纯度。</li>
</ol>
3. BAMBIhigh MFGE8high 间充质干细胞的表征
<ol>
	<li>将分选后的BAMBIhighMFGE8high MSCs接种于12孔板中培养，在显微镜下观察其细胞形态，并与未分选的MSCs进行比较。 
	注意：通常情况下，BAMBIhighMFGE8high细胞的生长速度比未分选的脐带间充质干细胞（UC-MSCs）更快。</li>
	<li>当12孔板中的细胞融合度达到约90%时，吸除细胞培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后向每孔加入500 µL RNA提取试剂，在室温（RT）下缓慢振荡5分钟。</li>
	<li>用移液器吹打混匀后，将混合液转移至无RNase和DNase的离心管中。加入100 µL氯仿，盖紧管盖，涡旋剧烈振荡15秒，随后于室温静置3分钟。</li>
	<li>在11,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。</li>
	<li>将约200 µL上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分上下吹打数次混匀，然后于室温静置10分钟。</li>
	<li>在11,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向管中沉淀加入500 µL 75%乙醇，轻轻颠倒混匀数次。</li>
	<li>在6,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。再以6,000 × g离心10秒，小心用移液器吸除残留液体，并在室温下干燥沉淀。</li>
	<li>加入10 µL无RNase的水溶解RNA沉淀，使用分光光度计测定RNA浓度。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，以最多1 µg总RNA为模板合成第一链cDNA。</li>
	<li>根据试剂盒说明书，使用qPCR试剂盒检测并定量基因表达水平。 
	注意：所用DNA引物的序列列于表1中。</li>
</ol>

Functional Analysis of BAMBIhighMFGE8high UC-MSC Subpopulations

<ol><li>Liechty, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+engraft+and+demonstrate+site-specific+differentiation+after+in+utero+transplantation+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep.</a> Nat Med. 6 (11), 1282-1286 (2000).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 24(2021).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tnf-alpha-mediated+m%286%29a+modification+of+elmo1+triggers+directional+migration+of+mesenchymal+stem+cell+in+ankylosing+spondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tnf-alpha-mediated m(6)a modification of elmo1 triggers directional migration of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis.</a> Nat Commun. 12 (1), 5373(2021).</li>
<li>Mcguire, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+interleukin-28+drives+the+selection+of+apoptosis+resistant+bone+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived interleukin-28 drives the selection of apoptosis resistant bone metastatic prostate cancer.</a> Nat Commun. 12 (1), 723(2021).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapy+induces+flt3l+and+cd1c%28%2B%29+dendritic+cells+in+systemic+lupus+erythematosus+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapy induces flt3l and cd1c(+) dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients.</a> Nat Commun. 10 (1), 2498(2019).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+active+and+refractory+systemic+lupus+erythematosus%3A+A+multicenter+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in active and refractory systemic lupus erythematosus: A multicenter clinical study.</a> Arthritis Res Ther. 16 (2), R79(2014).</li>
<li>Ortiz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+engraftment+in+lung+is+enhanced+in+response+to+bleomycin+exposure+and+ameliorates+its+fibrotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8407-8411 (2003).</li>
<li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells%3A+Implications+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+of+human+mesenchymal+stem+cells+exploring+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas of human mesenchymal stem cells exploring cellular heterogeneity.</a> Clin Transl Med. 11 (12), e650(2021).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptomics+decodes+wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+heterogeneity+and+a+subpopulation+with+wound+repair+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptomics decodes wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells heterogeneity and a subpopulation with wound repair signatures.</a> Adv Sci (Weinh). 10 (4), e2204786(2023).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+heterogeneity+reveals+a+unique+bambi%28high%29+mfge8%28high%29+subpopulation+of+human+uc-mscs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Dissecting heterogeneity reveals a unique bambi(high) mfge8(high) subpopulation of human uc-mscs.</a> Adv Sci (Weinh). 10 (1), e2202510(2022).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplant. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Lai, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+detaching+adherent+cells+and+their+effects+on+the+cell+surface+expression+of+fas+receptor+and+fas+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of fas receptor and fas ligand.</a> Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).</li>
<li>Avinash, K., Malaippan, S., Dooraiswamy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+characterization+of+stem+cells+from+different+regions+of+oral+cavity+using+markers%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and characterization of stem cells from different regions of oral cavity using markers: A systematic review.</a> Int J Stem Cells. 10 (1), 12-20 (2017).</li>
<li>Galvao, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+inhibition+drives+resolution+of+acute+inflammation+by+enhancing+neutrophil+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Rock inhibition drives resolution of acute inflammation by enhancing neutrophil apoptosis.</a> Cells. 8 (9), 964(2019).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本方案描述了如何从人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中分离并富集 BAMBIhighMFGE8high 亚群。该方法对于进一步研究该间充质干细胞亚群的形态、生长及功能具有重要意义。其中某些步骤对于成功分离 BAMBIhighMFGE8high 细胞并获得较高得率至关重要。
首先，本方案中最关键的技术要点是使用适当的细胞解离溶液。尽管常规的0.25%胰蛋白酶-EDTA常用于间充质干细胞（MSCs）传代时的细胞解离，但在分选BAMBIhighMFGE8high亚群时，最好使用无酶的EDTA溶液，因为胰蛋白酶处理会降低BAMBIhighMFGE8high MSCs分选时的得率（图3）。可能的原因是胰蛋白酶会像影响其他蛋白一样，破坏细胞表面MFGE8和BAMBI跨膜蛋白的分布12。相比之下，EDTA溶液对MF...

人类间充质基质/干细胞（MSCs）是一类体细胞前体细胞，具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及其他细胞类型的潜能1。MSCs最初从骨髓中分离获得，目前也广泛来源于脐带、脂肪组织及其他组织2。由于脐带来源的MSCs（UC-MSCs）易于获取，并且具有低免疫原性和免疫抑制作用，因此在多种疾病的临床试验中得到广泛应用3,4,5。尽管MSC治疗在疾病干预方面展现出良好的应用前景，但其治疗效果在不同个体间存在不一致性6。然而，导致MSC治疗效果不稳定的原因仍不明确。
分子波动性、形态、分化潜能和治疗功能构成了间充质干细胞（MSC）的异质性。一些研究还提出，MSC包含具有不同功能的亚群7,8，并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术探索MSC的异质性9,10。研究结果表明，人脐带来源的MSC（UC-MSC）具有不同转录组特征的独特亚群，然而，目前仅有少数研究成功分离出所谓的MSC亚群。我们先前通过scRNA-seq和生物信息学分析，根据其分子特征将人UC-MSC划分为三个亚组，并进一步纯化和功能验证了其中BAMBIhighMFGE8high UC-MSC亚群11。然而，该亚群未能缓解狼疮性肾炎。因此，有必要在其他疾病模型中测试BAMBIhighMFGE8high MSC的治疗效果，以明确其真实功能。
本方案描述了通过流式细胞术结合荧光激活细胞分选（FACS）从人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中分离BAMBIhighMFGE8high亚群的方法，以及该BAMBIhighMFGE8high亚群的特征。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 微量离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Axygen MCT-060-A</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>北京莱伯格科技</td><td>MCT-001-150</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿&amp;nbsp;</td><td>北京莱伯格科技</td><td>12311</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>北京莱伯格科技</td><td>11210</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>南京诺唯赞材料科技</td><td>TCF00115</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>北京莱伯格科技</td><td>11310</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>南京诺唯赞材料科技</td><td>TCF00150</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底管</td><td>Corning</td><td>FALCON 352003</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>APC 抗人 CD79a (Ig&amp;alpha;) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>333505</td><td>581&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗人 CD73 (外切-5'-核苷酸酶) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>344022</td><td>G46-6&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>APC-Cy7 小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>557873</td><td>MOPC-31C (同型对照)&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>BAMBI 抗体</td><td>Bioss</td><td>bs-12418R</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗小鼠/人 CD44 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103044</td><td>5E10&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 大鼠 IgG2b, &amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BioLegend</td><td>400646</td><td>MOPC-21 (同型对照)&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>CD105 (内皮糖蛋白) 单克隆抗体&amp;nbsp; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1057-42</td><td>HM47&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>上海求精</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>北京百洋</td><td>BY-320C</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ Universal SYBR qPCR 主混合液</td><td>Vazyme</td><td>Q711-02</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>西陇科学</td><td>13700908</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (1:1) 基础培养基 (1x)</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)，pH 8.0，无 RNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>西陇科学</td><td>12803405</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC 小鼠抗人 CD34</td><td>BD Bioscience</td><td>555821</td><td>IM7&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>FITC 小鼠抗人 CD45</td><td>BD Bioscience</td><td>555482</td><td>AD2&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>FITC 小鼠抗人 HLA-DR</td><td>BD Bioscience</td><td>555811</td><td>SN6&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSAria&amp;trade; III 细胞分选仪 Aria</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Bioscience</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab150113</td><td>HI30&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG H&amp;L (AlexaFluor 594)</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA 擦除剂)</td><td>Vazyme</td><td>R223-01</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>西陇科学</td><td>12802505</td><td></td></tr><tr><td>MFGE8 抗体</td><td>Biorbyt</td><td>orb388429</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FRESCO 21</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 kappa 同型对照 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td>P3.6.2.8.1 (同型对照)&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 kappa 同型对照 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-42</td><td>eBMG2b (同型对照)&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b kappa 同型对照 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732-42</td><td>RTK4530 (同型对照)&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>生工生物 (上海)</td><td>E607016-0500</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 小鼠抗人 CD90&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555597</td><td>P3.6.2.8.1 (同型对照)&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200</td></tr><tr><td>PE-Cy5 小鼠 IgG1 &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Bioscience</td><td>550618</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100x</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific 公司 Applied Biosystems 品牌</td><td>Q6</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 水</td><td>QIAGEN</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop One(840-317400)</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液器吸头</td><td>北京莱伯格科技</td><td></td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>北京莱伯格科技</td><td>13212A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Thermo Fisher Scientific 公司 Applied Biosystems 品牌</td><td>Veriti</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>百川生物</td><td>BC-CE-005</td><td></td></tr><tr><td>水套式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp; 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr></tbody></table>

分离人bambihighmfge8high脐带来源间充质基质细胞

Isolation of Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells

脐带来源的间充质基质细胞/干细胞（UC-MSCs）具有低免疫原性和强大的免疫调节作用，可用于治疗多种疾病。人UC-MSCs是一类异质性细胞群体，包含三种主要亚群，其细胞形态、增殖速率、分化能力及免疫调节功能各不相同。此前研究发现，从UC-MSCs中成功分离出的第一个亚群——BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs，无法缓解狼疮性肾炎。因此，该亚群在MSC治疗疾病中的功能及其潜在机制仍不清楚。有必要对BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs进行分离，并进一步研究其表型、代谢特征和功能，以全面了解该MSC亚群的本质。本实验方案详细描述了从人UC-MSCs中分离BAMBIhighMFGE8high亚群的方法。通过流式细胞术分选，利用两种表面标志物BAMBI和MFGE8对UC-MSCs亚群进行标记。分离后的细胞进行培养，并通过流式细胞术分析进行验证。采用RT-qPCR技术鉴定BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs中特异性表达的基因。该方案可实现高效且高纯度的细胞分选，并阐明BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs的标志物表达谱。

图1&#160;显示了人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的细胞表面标志物表达谱。培养的间充质干细胞对CD44、CD73、CD90和CD105的表达呈强阳性，而对CD14、CD34、CD45、CD79和HLA-DR的表达呈阴性。BAMBIhighMFGE8high MSCs从培养的人UC-MSCs中分选获得，并在扩增3-4代后通过流式细胞术重新分析其BAMBI和MFGE8的表达水平（图2）。在此过程中，BAMBIhighMFGE8high MSCs的比例因供体差异和解离方法不同而有所波动（图3和 图4）。图5展示了与未分选的MSCs相比，BAMBIhighMFGE8high MS...

分离构成异质性人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）三大主要亚群之一的BAMBIhighMFGE8high 间充质干细胞（MSCs），有助于全面理解该亚型的特性与功能，从而为其未来在特定疾病中提升临床疗效的应用提供支持。本文介绍了一种分选BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs的方法。

分离人BAMBIhighMFGE8high脐带来源间充质基质细胞

脐带来源的间充质基质细胞/干细胞（UC-MSCs）具有低免疫原性及强大的免疫调节作用，可用于治疗多种疾病……

我们的目标是分离人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中的特定亚群，并根据其单细胞转录组学特征分析其基本特性。我们试图回答不同UC-MSC亚群具有哪些独特的特征和功能。本领域最新的进展主要是通过单细胞RNA测序技术揭示了混合间充质干细胞群体的异质性。我们鉴定了人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中的三个亚群，包括BAMBI高表达且MFGE8高表达的细胞。该亚群表现出独特的表型、特异的转录组谱、有限的成脂分化潜能，以及在狼疮性肾炎中减弱的免疫抑制活性。这些发现加深了对UC-MSCs的理解，并支持为治疗特定疾病选择最优亚群。我们正在为理解不仅BAMBI高表达MFGE8高表达的脐带间充质干细胞，还包括其他两个亚群的真实功能铺平道路，特别是它们在治疗不同疾病中的作用。我们将继续致力于开展人脐带间充质干细胞亚群在多种免疫介导性疾病中的应用研究，并探索其治疗这些疾病的分子机制。为分离BAMBI高表达MFGE8高表达的脐带间充质干细胞，需将脐带间充质干细胞在完全DMEM培养基中培养至密度约为5×10⁶至10×10⁶个细胞。加入 0.5 毫摩尔 EDTA，孵育 5 分钟以解离细胞。随后加入完全 DMEM 培养基，并将细胞悬液转移至 15 毫升锥形管中。用移液器将细胞悬液上下吹打数次，以制备单细胞悬液。取10微升细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算收获的细胞总数。计数后，将所需数量的细胞在300 ×g离心5分钟。将沉淀重悬于1毫升完全培养基中，使细胞浓度达到每毫升5×10⁶至10×10⁶个细胞，并将离心管置于冰上。接着，将收集的细胞分装至四个1.5毫升微量离心管中。向MFGE8和BAMBI管中加入一抗，按1:100比例稀释后加入。充分混匀内容物，并在室温下孵育细胞15分钟。孵育结束后，加入PBS洗涤标记的细胞。在300 ×g下离心5分钟，弃去上清液，然后将沉淀重悬于1毫升完全培养基中。将偶联的荧光二抗以1:1,000的稀释比例加入重悬的细胞中。充分混匀后，将离心管置于室温避光孵育15分钟。孵育结束后，加入PBS并离心以洗涤标记的细胞。将沉淀重悬于500微升完全培养基中，并通过70微米细胞滤网过滤，以去除团块和碎片。将滤液转移至15毫升离心管中，用于流式细胞术分选。运行未加抗体的空白细胞管作为阴性对照。调整流式细胞仪的前向散射和侧向散射设置，以确定未染色细胞群体的设门范围。然后运行单抗体标记的MFGE8和BAMBI样本作为设门对照，确定图中阳性信号的起始位置。接着运行实验样本管，分选BAMBI高表达且MFGE8高表达的细胞群体，并收集分选后的细胞。将分选后的MSCs接种至24孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。待分选细胞传代培养至第二代后，进行流式细胞术分析以确认分选细胞群体的纯度。培养的脐带间充质干细胞（UC-MSCs）高表达CD44、CD73、CD9

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人 BAMBI高MFGE8高 脐带来源的间充质基质细胞的分离

本方案描述了在不使用动物血清的情况下，分离并随后扩增间充质基质细胞和内皮集落形成细胞，以生成用于实验性移植的自体配对细胞。...

人脐带来源的间充质基质细胞（MSCs）和内皮集落形成祖细胞（ECFCs）的分离及无动物血清扩增

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从多孔骨基质中分离人类间充质干细胞及其培养

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人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

人脐带（UC）可在早产、足月及过期分娩的围产期获得。本方案中，我们描述了从妊娠19-40周的胎儿/婴儿脐带中分离和鉴定脐带来源的间充质干细胞（UC-MSCs）的方法。...

早产儿与足月儿来源的人脐带间充质干细胞的分离与鉴定

本研究介绍了一种独特的钝性分离方法，可保持华通胶（Wharton's jelly,...

高产率低损伤的脐带来源间充质干细胞分离

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C57BL/6J小鼠乳腺基质细胞与癌细胞移植

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。...

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

直接从人体组织中分离癌症干细胞（CSCs）是对其进行生物学表征的必要步骤。本文描述了一种从人体组织中分离前列腺癌症干细胞的方法，同时提供了针对困难步骤的故障排除建议。...

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从子宫切除标本中建立原代子宫内膜基质细胞培养体系是一种有价值的生物学技术，也是开展多种研究目标之前的关键步骤。本文中，我们描述了两种用于从人患者手术切除的子宫内膜组织中建立基质细胞培养的方法。...

从子宫切除标本中建立原代人子宫内膜基质细胞的两种方法

学习从人脐带间充质基质细胞中分离BAMBI高MFGE8高亚群的方法，用于干细胞生物学和再生医学研究。该方案结合单细胞转录组分析与流式细胞术分选，有助于理解细胞异质性并优化特定疾病的细胞治疗策略。

分离人BAMBI^highMFGE8^high脐带来源间充质基质细胞

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