Name: 一种使用 mRNA 生成瞬时嵌合抗原受体 T 细胞用于癌症免疫治疗的非病毒方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解使用非整合性mRNA电穿孔技术制备瞬时嵌合抗原受体T细胞的方法，用于癌症免疫治疗研究。该技术避免病毒载体整合风险，降低生产成本，适用于评估CAR-T细胞功能与细胞毒性。

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本工作由 ProMab Biotechnologies 资助。

本研究所用的外周血单个核细胞（PBMC）系先前根据机构审查委员会（IRB）批准的方案（13942），采用先前所述的Ficoll-Paque密度梯度法42，从斯坦福医院血液中心提供的全血中分离获得。由于我们用于获取PBMC的血液系从斯坦福医院血液中心商业购得，因此无需获得参与者的知情同意。
1. CAR mRNA 的制备
<ol>
	<li>模板制备 
	注意：线性化质粒或PCR片段均可作为合成CAR mRNA的模板 体外，前提是它们包含适当的5' SP6或T7启动子、5'非翻译区（UTR）、CAR转基因以及带有合适poly(A)尾的3'UTR。在本研究中，我们使用了一种CAR质粒DNA构建体，其包含SP6启动子、一段短的人β-珠蛋白5'UTR、CAR转基因，以及由两个串联的β-珠蛋白3'UTR组成并后接一段112 bp poly(A)尾的3'UTR43UTR、编码序列和poly(A)尾均影响RNA的稳定性和翻译效率43,44,45120 bp的poly(A)尾已被证明与较短的poly(A)尾相比可提高细胞培养中的蛋白产量43.
	<ol>
		<li>使用质粒提取试剂盒，按照制造商说明书制备CAR载体质粒DNA。高质量的质粒DNA对于获得高产量的CAR mRNA至关重要。</li>
		<li>用限制性内切酶 BglII 线性化 CAR 质粒 DNA。选择一种在 poly(A) 尾巴之后切割的限制性内切酶，优先选择靠近 poly(A) 尾巴末端的酶。在 37 °C 下，将经分光光度计定量的 10 µg（或 10,000 ng）质粒 DNA 与 10 U 酶、10 µL 消化缓冲液及无核酸酶水共同加入 100 µL 反应体系中，过夜消化。 
		注意：确保限制性内切酶不在CAR转基因及其侧翼的启动子、UTR和poly(A)尾序列内进行切割。CAR质粒的完全线性化对于高效的CAR mRNA转录是必需的。</li>
		<li>加入200 µg/mL蛋白酶K和0.5% w/v SDS至消化液中，50 °C孵育1小时。</li>
		<li>纯化线性化的CAR质粒DNA。向消化反应体系中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v/v）。剧烈涡旋振荡约15秒。在室温（RT）下，将样品于台式离心机中以最大速度离心5分钟。</li>
		<li>将含有DNA的上层水相转移至新的微量离心管中，避免转移含有蛋白质和苯酚杂质的中间层和下层。使用氯仿进行第二轮抽提以减少杂质。</li>
		<li>加入1/10th 加入7.5 M醋酸铵或3 M醋酸钠，终体积为7.5 M或3 M，轻轻混匀。加入2.5倍体积的乙醇以沉淀DNA。将样品于−20 °C保存至少30分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以最大速度离心15分钟，使DNA沉淀。小心移除上清液。加入500 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。</li>
		<li>在4 °C下再次离心样品2分钟。小心移除上清液，管中保留少量溶液。</li>
		<li>在4°C下再次离心2分钟。小心移除残留的上清液。将DNA沉淀置于无菌操作台中室温下晾干约10分钟，直至管底无可见乙醇溶液。 
		注意：避免将DNA沉淀过度干燥，否则可能难以溶解。</li>
		<li>加入20 µL无核酸酶水，轻轻吹打混匀以溶解DNA。将样品在最大转速下短暂离心。使用分光光度计测定DNA浓度。</li>
		<li>将样品置于冰上用于立即使用，或于 −20 °C 保存以备后续使用。取 100 ng 纯化后的 DNA 加样至琼脂糖凝胶，检测其大小和完整性。DNA 应呈现为一条单一、清晰的条带，大小符合预期，不应观察到额外条带或弥散条带。 
		&#8203;注意：模板 DNA 的质量对高效的 mRNA 转录至关重要。请避免使用不纯、断裂或降解的 DNA 作为 mRNA 转录的模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 体外转录（IVT）
	<ol>
		<li>合成CAR mRNA 体外确保整个操作过程中使用无核酸酶的试剂、离心管和移液器吸头。</li>
		<li>解冻下列所列试剂 表1 室温放置，SP6 RNA聚合酶混合物除外，后者应保存在−20 °C直至使用。按照下述顺序准备转录反应： 表1 室温下轻柔混匀，37 °C孵育至少2 h。 
		注意：可根据所需 mRNA 的量对反应体系进行放大或缩小。上述反应在使用高质量模板 DNA 时，通常可产生至少 100 µg（或 100,000 ng）的加帽 mRNA。延长孵育时间（例如过夜）可能会提高 mRNA 产量。</li>
		<li>加入 2 µL 无 RNase 的 DNase I 至反应体系中，轻轻混匀，37 °C 孵育 15 分钟以降解模板 DNA。</li>
		<li>使用RNA纯化试剂盒纯化转录的CAR mRNA（参见 材料清单）。按照试剂盒生产商的说明进行纯化。用无核酸酶的水洗脱 mRNA。 
		注意：mRNA 也可使用上述苯酚-氯仿提取法（步骤 1.1.4）进行纯化。</li>
		<li>使用分光光度计测定 mRNA 浓度。取至少 200 ng mRNA 上样至琼脂糖凝胶，检测其大小和完整性。mRNA 应呈现为一条主带，大小符合预期，无额外条带或弥散条带。将 mRNA 储存于 −80 °C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. T细胞的激活与电穿孔
<ol>
	<li>将1 × 106个冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）重悬于1 mL CAR-T培养基中（AIM-V培养基添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和10 ng/mL人重组IL-2）。使用等量预洗涤的人T细胞激活剂CD3/CD28磁珠激活T细胞（参见材料表）。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养并扩增细胞数天。 
	注意：可根据后续实验所需的T细胞数量按比例增加或减少PBMCs的用量。</li>
	<li>在冰上解冻预先制备的CAR mRNA。向12孔板中的两个孔各加入1 mL CAR-T培养基，并将培养板置于37 °C培养箱中平衡培养基。</li>
	<li>将5 × 106个T细胞转移至无菌离心管中，将离心管置于磁力架上，去除磁珠，小心吸取细胞悬液至新的离心管中。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL无菌PBS中。</li>
	<li>再次离心。弃去上清液，将细胞重悬于200 µL Neon Buffer T中（参见材料表）。</li>
	<li>吸取100 µL细胞悬液转移至新离心管中，加入5 µg（或5,000 ng）CAR mRNA46。用Neon Buffer T补足总体积至125 µL，通过反复吹打混匀。 
	注意：每1 × 106个T细胞经电穿孔转染的CAR mRNA量可增至8 µg（或8,000 ng），而不会对细胞活力产生负面影响，且增加mRNA用量可能提高CAR表达水平46。</li>
	<li>向剩余的100 µL细胞中加入25 µL Neon Buffer T。此组作为阴性对照。</li>
	<li>对T细胞进行电穿孔。使用Neon移液器将T细胞/CAR mRNA混合物或阴性对照T细胞吸入Neon 100 µL电转杯中，以1800 V、10 ms脉冲进行电穿孔。</li>
	<li>电穿孔后立即将细胞转移至步骤2.2中已预平衡的12孔板培养基中。</li>
	<li>将培养板放回培养箱继续扩增细胞，直至可用于实验。为确保CAR T细胞健康快速生长，使用新鲜培养基维持细胞密度在1−3 × 106个细胞/mL，直至使用。</li>
</ol>
3. CAR 表达的评估
<ol>
	<li>用移液器在每个孔中轻轻吹打数次，混匀CAR T细胞，并将至少1 × 105个细胞转移至一个5 mL的FACS管中。</li>
	<li>向管中加入3 mL冷洗涤缓冲液（含2 mM EDTA和0.5% w/v BSA的PBS）。在室温下以500 × g离心5分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于100 µL洗涤缓冲液中。向悬浮细胞中加入2 µL CAR检测试剂——别藻蓝蛋白（APC）标记的山羊抗人IgG F(ab')2抗体（见材料表）以及2 µL活死染料7-AAD。 
	注意：如果CAR含有标签（如FLAG），也可使用相应标记的靶抗原或抗标签抗体进行检测。若使用未标记的一抗进行CAR检测，则在步骤3.4之后需孵育相应的荧光标记二抗。</li>
	<li>轻轻振荡混匀样品，冰上避光孵育30分钟。孵育结束后用3 mL冷洗涤缓冲液洗涤细胞，并在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于100 µL洗涤缓冲液中，立即使用流式细胞仪进行分析。确保使用适当的阳性和阴性对照对检测试剂的荧光标记和活死染料进行正确补偿。</li>
	<li>采用以下设门策略评估CAR表达：在FSC-A与SSC-A图中设门选择细胞；在FSC-A与FSC-H图中设门选择单细胞；根据7-AAD染色情况设门选择活细胞。</li>
	<li>计算被抗人IgG F(ab')2抗体染色的活T细胞所占百分比，并将CAR-T细胞与阴性对照T细胞进行比较，后者应几乎无染色信号。</li>
</ol>
4. CAR-T 细胞功能分析
<ol>
	<li>细胞毒性分析
	<ol>
		<li>确保靶肿瘤细胞表达的抗原具有可被CAR识别的空间构象。为确认抗原表达情况，使用衍生CAR的亲本抗体通过流式细胞术分析肿瘤细胞。如果CAR无法识别肿瘤细胞，则CAR-T细胞将无法杀伤肿瘤细胞。</li>
		<li>准备表面表达CAR抗原的靶肿瘤细胞。用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液在37 °C下消化贴壁肿瘤细胞1分钟，并用适当的培养基制备成浓度为1−4&#160;x 105 个细胞/mL的单细胞悬液。 
		注：肿瘤细胞应具有良好的贴壁性，以确保后续步骤的准确分析。若肿瘤细胞贴壁能力差、易脱落或悬浮生长，可在下一步所用培养板的孔中包被适当的抗体、多阳离子聚合物或纤连蛋白、胶原蛋白等生物材料，以促进细胞贴附。</li>
		<li>准备E-Plate（见材料表）。设计实验方案。向每孔中加入50 µL预热的肿瘤细胞培养基，将E-Plate放入实时细胞分析（RTCA）仪器中测量背景阻抗。以每分钟一次（或一次扫描）的频率进行3次扫描，测量阻抗。 
		注：背景阻抗用于将细胞指数设为零。若未测量背景阻抗，则各孔之间无法比较，导致结果不可解读。</li>
		<li>从RTCA&#160;仪器中取出E-Plate，向每孔中加入100 µL肿瘤细胞悬液。因此，每孔总反应体积为150 µL，含1−4 x 104个细胞。 
		注：每孔接种的肿瘤细胞数量应在实验前确定。可对E-Plate接种不同数量的细胞，随后在24−48小时内监测细胞指数变化。理想接种数量应使细胞指数在至少24小时内持续稳定上升而不进入平台期。接种过多细胞会加速营养耗竭和培养基酸化，导致细胞指数过早进入平台期。此外，每组应设置重复孔，以便识别潜在的异常值。</li>
		<li>将E-Plate在室温下平衡30分钟。此步骤使肿瘤细胞沉降并贴附于孔底。 
		注：此步骤对准确测量细胞指数至关重要。跳过此步骤通常会导致孔间细胞指数测量值差异增大，以及孔内肿瘤细胞贴附不均，从而增加实验噪声。</li>
		<li>将E-Plate重新放回RTCA仪器中，继续监测细胞指数约24小时，每5−15分钟进行一次扫描。</li>
		<li>次日，制备CAR-T细胞悬液。将第2.10步获得的CAR-T细胞（效应细胞）重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，浓度根据靶肿瘤细胞（靶细胞）数量和所需的效应细胞:靶细胞（E:T）比例确定。例如，若肿瘤细胞悬液浓度为2 x 105 个细胞/mL，且所需E:T比例为10:1，则CAR-T细胞应重悬至2 x 106 个细胞/mL。应设置适当的对照组，如仅含肿瘤细胞（无效应细胞）组和对照T细胞组（经电穿孔但未转染mRNA或转染对照mRNA的T细胞）。 
		注：为获得最佳结果，建议在电穿孔后1-2天使用CAR-T细胞，此时细胞表面CAR表达水平较高。为探索最佳E:T比例，可测试一系列比例（例如3:1至20:1）。除非CAR-T细胞频率极低（即低于10%），否则通常E:T比例为10:1或20:1即可实现接近完全的肿瘤细胞杀伤。</li>
		<li>暂停细胞指数记录，并将E-Plate从RTCA仪器中取出。</li>
		<li>轻微倾斜培养板，小心从每孔中移除50 µL培养基，避免触碰肿瘤细胞，然后向每孔中加入100 µL CAR-T细胞或对照T细胞悬液。</li>
		<li>将E-Plate放回RTCA仪器中，恢复细胞指数监测，至少持续24小时，每5−15分钟进行一次扫描。 
		注：细胞指数监测时长取决于CAR-T细胞靶向杀伤肿瘤细胞的速度。通常24小时孵育足以使CAR-T细胞发挥最大细胞毒性效应。</li>
		<li>停止细胞指数监测，将E-Plate从RTCA仪器中取出，分析细胞毒性结果。将CAR-T细胞杀伤的肿瘤细胞比例计算为细胞毒性百分比。使用RTCA软件计算CAR-T细胞和对照T细胞的平均细胞毒性。若需手动计算细胞毒性，请使用以下公式： 
		&#8203;细胞毒性 = （（肿瘤细胞的细胞指数）−（肿瘤细胞加效应细胞的细胞指数））/（肿瘤细胞的细胞指数）× 100%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞因子分泌分析
	<ol>
		<li>为分析CAR-T细胞在细胞毒性实验过程中分泌的IFN-ϒ等细胞因子，将E-Plate中的上清液转移至圆底或V型96孔板。 
		注：若需进行细胞因子分泌的时间进程分析，可在步骤4.1.10暂停细胞指数监测，从各孔中收集少量上清液，将E-Plate放回RTCA仪器并恢复监测。</li>
		<li>在室温下以300 x g离心96孔板5分钟。小心将上清液转移至新的96孔板，避免扰动细胞沉淀。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测上清液中的细胞因子水平。通常在检测前需对上清液进行稀释，有时稀释倍数超过100倍，具体取决于所检测的细胞因子。</li>
		<li>通过将样品吸光度值与系列稀释标准品生成的标准曲线进行插值来分析数据。使用适当的软件绘制图表，误差线表示均值±标准差（SD）。为比较不同处理组之间的差异，可进行Student's t检验。通常将p值小于0.05视为具有统计学显著性。 
		注：明显偏离的异常数据点（可能由实验误差引起）应从分析中剔除。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者Liang Hu、Robert Berahovich、Yanwei Huang、Shiming Zhang、Jinying Sun、Xianghong Liu、Hua Zhou、Shirley Xu、Haoqi Li和Vita Golubovskaya为ProMab Biotechnologies公司员工。Lijun Wu为ProMab Biotechnologies公司员工及股东。

本研究中，我们描述了一种详细的非病毒、非整合性方法，用于生成瞬时表达的CAR-T细胞，并提供了评估CAR-T细胞功能的技术操作流程。该方法避免使用传统的逆转录病毒和慢病毒载体进行永久性且随机的CAR转基因递送，而是利用电穿孔技术高效导入 体外 将修饰后的CAR mRNA导入T细胞。该方法可实现T细胞表面高水平、瞬时的CAR表达，显著降低与插入突变相关的继发性恶性肿瘤风险。
为了优化CAR mRNA的翻译，mRNA结构的精心设计至关重要。5'非翻译区（5'UTR）、编码序列、3'非翻译区（3'UTR）以及poly(A)尾均会影响mRNA的稳定性或翻译效率42。在设计mRNA的5'UTR时，通常采用来源于细胞内丰度较高的蛋白质对应mRNA的短5'UTR，例如肌动蛋白（actin）、β-微管蛋白（beta-tubulin）或胶原蛋白（collagen）的5'UTR50。在我们的CAR mRNA构建体中，选用了人β-珠蛋白（human beta-globin）的5'UTR，因其...

癌症正日益成为威胁人类健康的重要因素，全球每年估计有2360万例新诊断病例和1000万例死亡病例1。对于多种局部性的非侵袭性和侵袭性癌症，手术联合放疗和化疗仍是治疗的金标准2,3,4。尽管传统的系统性治疗在早期癌症管理中取得了巨大成功，但其毒性显著，且对转移性及血液系统癌症疗效有限5。患有此类癌症的患者需频繁接受治疗，承受显著的毒性反应，以期稳定病情并延缓疾病进展。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法近年来作为一种革命性的靶向治疗手段崭露头角，在B细胞血液系统癌症中展现出强大疗效，为这些迫切需要治疗的患者带来了希望6。
CAR-T细胞是经过基因工程改造的T淋巴细胞，其细胞表面表达一种嵌合抗原受体（CAR），可特异性识别肿瘤相关抗原（TAAs），并在无需主要组织相容性复合物蛋白（MHC）呈递抗原的情况下激活细胞7。激活后，CAR-T细胞可分泌一系列细胞因子，并以非MHC依赖的方式裂解肿瘤细胞，从而在免疫抑制性肿瘤微环境导致MHC下调或缺失的情况下仍能增强对肿瘤的杀伤作用8,9。CAR由至少三个不同结构域组成：一个胞外单链可变区片段（scFv），包含特异性识别TAA的抗体可变区；一个跨膜结构域，用于将CAR锚定在细胞膜上；以及一个胞内结构域，负责介导接头蛋白的募集和下游信号传导10。根据胞内结构域的不同，CAR结构迄今已发展出五代，其中第一代仅包含CD3ζ激活结构域，后续各代则增加了一个或多个来自如4-1BB和CD28等分子的共刺激结构域11。这些胞内结构域影响CAR-T细胞的信号转导机制、增殖能力、存活时间及毒性，共同决定了其临床抗肿瘤疗效。CAR-T细胞治疗的临床成功主要源于第二代CAR-T细胞，其靶向特异性识别B细胞谱系标志物CD19，用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤12,13。截至目前，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准六种靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的第二代CAR-T细胞疗法，用于治疗复发或难治性血液系统恶性肿瘤，包括大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤6。新一代CAR-T细胞目前正处于广泛的临床前和临床研究阶段14,15。
CAR-T细胞的临床制备是一个复杂、昂贵且耗时的过程。目前，用于制备CAR-T细胞的白细胞来源于患者自身，以避免异体反应，尽管来源于供体的通用型（即“现成可用”）CAR-T细胞正在积极研发并处于临床评估阶段。16通过白细胞分离术从患者外周血中分离出白细胞后，采用病毒或非病毒方法将编码CAR的外源基因片段导入活化的T细胞中17,18,19逆转录病毒和慢病毒是用于CAR基因递送最常见的病毒载体，可导致编码CAR的DNA随机且永久地整合到T细胞基因组中20非病毒方法，包括mRNA-脂质纳米颗粒、转座子系统和CRISPR/Cas9基因组编辑，较为少见21随后，扩增表达CAR的T细胞 离体 大规模扩增后收集并重新回输至患者体内22,23制造符合严格药品生产质量管理规范（GMP）标准的病毒载体极为困难、复杂且成本高昂，给生产商、监管机构和患者带来重大负担，从而限制了其在临床上的广泛应用。
尽管CAR-T疗法取得了令人振奋的成功，但其安全性问题日益引起关注。由于在病毒或转座子转导过程中，CAR转基因随机整合至T细胞基因组，可能导致抑癌基因被破坏或原癌基因被激活，从而引发T细胞的恶性转化24,25。自2017年美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个CAR-T细胞治疗产品以来，随访研究显示，接受该疗法的患者中多达15%会发展为继发性原发性恶性肿瘤（SPMs），例如T细胞淋巴瘤（TCL）、非小细胞肺癌（NSCLC）和皮肤癌26,27,28,29。值得注意的是，在部分SPMs中高频率检测到CAR转基因的存在30,31，且某些TCL病例直接由CAR-T细胞的异常扩增所致24,32,33，表明CAR-T产品在诱发某些SPMs中具有直接作用。其他研究进一步在SPMs的肿瘤细胞中鉴定出CAR转基因插入关键基因的现象，如TET234、JAK135和PBX236。鉴于越来越多的证据表明CAR-T细胞治疗后可能出现T细胞恶性肿瘤，FDA近期得出结论：所有目前获批的靶向CD19和靶向BCMA的CAR-T细胞疗法均需添加黑框警告，以强调其存在T细胞恶性肿瘤的重大风险37。然而，针对CAR-T治疗长期效应的大样本队列研究报道，接受治疗患者中SPMs的发生率介于3.8%至15%之间26,27,28,38,39，该发生率并不显著高于接受传统系统性治疗的血液系统肿瘤患者40,41，提示CAR-T细胞疗法整体具有相对良好的安全性。尽管如此，仍迫切需要通过更具成本效益的方法开发出安全且高效的CAR-T细胞，以最大限度降低SPMs的风险。
本文介绍了一种非病毒、非整合型生成CAR-T细胞的详细实验方案。该方案旨在提供一种简单、分步的操作指南，用于制备小规模、具有高效功能且CAR表达短暂的CAR-T细胞，从而避免插入突变，并最小化继发性恶性肿瘤（SPMs）的风险。我们证明，通过电穿孔将编码靶向肿瘤相关抗原HER2的修饰mRNA导入T细胞后，可在T细胞表面实现抗HER2 CAR的高效且短暂的表达。在CAR表达期间，这些T细胞能够有效杀伤HER2阳性肿瘤细胞，并分泌高水平的干扰素-γ（IFN-ϒ）。本方案分为四个独立但连续的部分，包括CAR mRNA的制备、T细胞的活化与电穿孔、CAR表达水平的检测以及CAR-T细胞功能的分析。该方法适用于学术研究和临床细胞治疗中短暂表达CAR-T细胞的开发与生产。

<table><tbody><tr><td>7-AAD 活性染料&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>ACEA Novocyte 流式细胞仪</td><td>Agilent</td><td>NovoCyte 3000</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V 培养基</td><td>Gibco</td><td>12055083</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记的山羊抗人 IgG F(ab')2 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-136-097</td><td></td></tr><tr><td>BglII 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs (NEB)</td><td>R0144L</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;acute;-O-甲基-m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构类似物</td><td>NEB</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28 磁珠</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 96</td><td>Agilent</td><td>5232376001</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>459844-4L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza.com</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA 合成试剂盒</td><td>New England BioLabs (NEB)</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-2 重组蛋白</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Millennium RNA 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA 纯化试剂盒 (500 &amp;mu;g)</td><td>NEB</td><td>T2050L</td><td></td></tr><tr><td>N1-甲基假尿苷三磷酸 (N1-Methylpseudo-UTP)</td><td>Trilink</td><td>N-1081-10</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染仪</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 100-&amp;mu;L 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (10000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300120</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence 实时细胞分析 (RTCA) 仪器</td><td>Agilent</td><td>RTCA MP</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II 质粒中量提取试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4201</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用mrna生成非病毒性短暂嵌合抗原受体t细胞用于癌症免疫治疗的方法

A Nonviral Approach to Generate Transient Chimeric Antigen Receptor T Cells Using mRNA for Cancer Immunotherapy

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法作为一种开创性的癌症治疗方法，在治疗某些血液系统恶性肿瘤（如淋巴瘤和白血病）方面取得了前所未有的成功。然而，随着越来越多的癌症患者接受CAR-T细胞治疗，与治疗相关的继发性原发性恶性肿瘤的报道也逐渐增多，部分原因在于CAR转基因的意外插入，这引发了严重的安全性担忧。为解决这一问题，本文介绍了一种非病毒、非整合的方法，通过mRNA技术生成瞬时表达的CAR-T细胞。我们采用电穿孔法将编码人表皮生长因子受体2（HER2）特异性CAR的修饰mRNA导入T细胞，从而获得瞬时靶向HER2的CAR-T细胞。电穿孔后第1天，CAR在T细胞表面高效表达，第2天表达水平升高，至第5天则显著下降。这些瞬时CAR-T细胞对HER2阳性的SKOV-3卵巢癌细胞表现出强烈的细胞毒性，并分泌高水平的干扰素-γ（IFN-ϒ）。本实验方案提供了小规模制备瞬时CAR-T细胞的逐步操作指南，详细描述了CAR mRNA的制备、T细胞的活化与转染、CAR表达水平的检测以及CAR-T细胞功能的体外分析。该方法适用于临床前研究和临床研究中瞬时CAR-T细胞的制备。

我们构建了一种第二代靶向HER2的CAR，其包含一个源自人源化抗HER2小鼠单克隆抗体（mAb）4D5的scFv47，一个跨膜区，以及胞内4-1BB共刺激结构域，其后接CD3ζ激活结构域（图1A）。编码CAR的DNA序列包含一个5' SP6启动子，用于驱动CAR mRNA的转录 体外 (图1B）。CAR mRNA 长度约为 2 kb，通过凝胶电泳验证图1C).
随后通过电穿孔将CAR mRNA转染至活化的T细胞中，操作步骤如上所述。电穿孔后一天，超过50%的细胞表达CAR，而未转染mRNA的对照T细胞则不表达CAR（图2A）。CAR-T细胞的比例在第2天上升至超过70%（图2B），随后在第5天下降至10%（<strong ...

本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。

一种利用mRNA生成非病毒性短暂嵌合抗原受体T细胞用于癌症免疫治疗的方法

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法作为一种前沿的癌症治疗方法，已在治疗某些类型癌症方面取得前所未有的成功……

CAR T细胞疗法在治疗某些病理型癌症方面已取得前所未有的成功。在本研究中，我们提出了一种非病毒性、长片段整合的方法，用于生成瞬时性CAR T细胞，并提供了评估CAR T细胞功能的靶向性操作流程。我们的研究目标是以更具成本效益的方式生成安全且高效的CAR T细胞。CAR T细胞通常通过病毒转导技术制备。逆转录病毒和慢病毒是CAR基因递送最常用的病毒载体。病毒载体的生产过程复杂且成本较高，而病毒转导会导致CAR编码DNA随机且永久性地整合到T细胞基因组中，可能引发安全性问题。本方案提供了一种非病毒性方法，用于生成仅瞬时表达CAR的CAR T细胞。该方法利用mRNA表达CAR，并通过电穿孔将mRNA导入T细胞。该技术不会将基因整合至T细胞基因组，且制备流程更简便、成本更低。首先，使用限制性内切酶 BGL2 将 CAR 质粒 DNA 线性化，并进行苯酚-氯仿-异戊醇 DNA 提取操作。纯化线性化 DNA 后，通过琼脂糖凝胶电泳验证模板的大小和完整性。进行体外转录时，混合反应组分，并将反应体系在 37°C 下孵育至少两小时。转录完成后，向反应体系中加入两微升核糖核酸酶III和DNase I。轻轻混匀，37摄氏度孵育15分钟，以降解模板DNA。使用RNA纯化试剂盒纯化转录得到的CAR mRNA，并用无核酸酶水稀释。在将mRNA于-80摄氏度保存之前，使用分光光度计测定其浓度。将体外转录并纯化的car mRNA样本置于冰上解冻。将一乘以十的六次方个冷冻保存的人类外周血单个核细胞悬浮于一毫升CAR T细胞培养基中。为了激活T细胞，加入等量的预洗涤人T细胞激活用CD3/CD28磁珠。将细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养并扩增数天。向12孔板的两个孔中各加入1毫升CAR T细胞培养基，于37摄氏度孵育以平衡环境。现在，将五乘以十的六次方个T细胞转移至一个无菌离心管中。为去除CD3/CD28磁珠，将离心管置于磁力架上，小心吸取细胞悬液至新的离心管中。在室温下以300 G离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升无菌PBS中。再次离心试管，并将细胞沉淀重悬于200微升Neon Buffer T中。取5微克溶于Neon Buffer T的CAR MNA与100微升细胞混合，总体积为125微升。向剩余的100微升细胞中加入25微升Neon Buffer T，作为阴性对照。将 Neon 电穿孔系统设置为 1,800 伏、10 毫秒，单次脉冲。使用 Neon 移液器将 T 细胞与 CAR mRNA 混合物吸入 Neon 100 微升枪头中，并对细胞进行电穿孔。立即将电穿孔后的细胞转移至 12 孔板中已平衡的培养基中，并将培养板放回培养箱，扩增细胞直至可用于后续实验。电穿孔后最早可在六小时时取出转染了CAR mRNA的T细胞，用于流式细胞术分析。用移液器将CAR T细胞混匀数次，转移至少1 × 10⁵个细胞至一个5 mL荧光激活细胞分选（FACS）管中。向管中加入3 mL冷洗涤缓冲液，并在室温下以500 × g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 100 微升洗涤缓冲液中。向悬浮细胞中加入 2 微升荧光标记的检测抗体和 7 微升 AAD 活性染料。混匀样品后避光冰上孵育 30 分钟，然后加入 3 毫升预冷的洗涤缓冲液洗涤细胞，并在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于100微升洗涤缓冲液中，并立即使用流式细胞仪分析细胞。去除表达细胞表面CAR抗原的肿瘤细胞的培养基。用PBS洗涤细胞后，在37摄氏度下用1毫升0.05%胰蛋白酶EDTA溶液孵育1分钟，然后在适当的培养基中制备单细胞悬液，细胞密度为每毫升1×10⁵至5×10⁵个细胞。接下来，向E-板中加入50微升预热的肿瘤细胞培养基，将其放入实时细胞分析（RTCA）仪器中，测定背景阻抗；然后向每孔加入100微升肿瘤细胞悬液，在室温下平衡30分钟。将E-板重新放回RTCA仪器中，监测24小时的细胞指数，每5至15分钟记录一次数据。次日，制备CAR T细胞悬液。暂停细胞指数记录，将E-板从RTCA仪器中取出。轻轻倾斜培养板，小心地从每个孔中移除50微升培养基，注意不要扰动肿瘤细胞，然后向每孔加入100微升CAR T细胞或对照T细胞。将E-板放回RTCA仪器中，恢复细胞指数监测，至少持续24小时，每5至15分钟进行一次读数扫描。停止细胞指数监测，并分析细胞毒性结果。进行细胞因子分泌分析时，将每孔中的上清液转移至圆底或V型96孔板中。在室温下以300 ×g离心96孔板5分钟，然后小心地将上清液转移至新的96孔板中。最后，使用商用ELISA试剂盒检测上清液中的细胞因子水平。通过凝胶电泳验证，CAR mRNA序列大小约为两千个碱基。电穿孔后第一天，超过50%的活化T细胞表达CAR，第二天上升至超过70%，到第五天时下降至约10%。CAR T细胞对HER2阳性的SK-OV-3肿瘤细胞表现出显著的细胞毒性，表现为肿瘤阻抗急剧下降，而对照组T细胞则几乎无此效应。在CAR T细胞培养基中检测到高水平的干扰素γ分泌，而对照组中未检测到。

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