在插入诱变细胞文库中鉴定功能相关的慢病毒整合位点
2025年1月10日
插入诱变是正向遗传学中鉴定功能基因组元件的重要工具。在这里，我们描述了基于插入的功能元件和转录本筛选 （InSET），这是一种在基于慢病毒的插入诱变细胞库中检测慢病毒整合位点的方法。
我们正在进行功能基因组学研究，重点是识别和表征人类基因组中的功能元件。我们的主要兴趣是探索基因组中尚未得到充分分配的部分，以更好地了解它们的潜在作用以及它们如何为人类生物学和疾病做出贡献。目前的反向遗传学工具存在一些局限性，例如非特异性效应和创建复杂的 SSI 或 SGI 文库的成本高。
另一个挑战是，这种方法可能只针对分配的基因组元件，而基因组的很大一部分没有得到充分探索。这里开发的方案提供了一种识别以前未知的基因组元件的新方法，包括蛋白质编码和长编码眼中的新型功能性外显子。首先，使用从基于慢病毒的插入诱变细胞文库中分离的基因组 DNA 作为模板，在 50 μL 反应中进行线性 PCR。然后。
在 PCR 管中添加此处显示的其他所需试剂。在给定的 PCR 条件下，在标准热循环仪中进行 50 个循环的线性 PCR。将 PCR 产物转移到新的干净的 1.5 ml 离心管中。
将 PCR 产物与 10 μL 生物素-链霉亲和素磁珠充分混合，并在室温下孵育混合物 2 小时，在金属浴中以 400 RPM 振荡。然后，使用磁力架收集磁珠并小心去除上清液。用 300 μL 结合或洗涤缓冲液洗涤珠子 6 次，每次洗涤后弃去上清液。
对于第二链合成，将微珠重悬于 PCR 管中含有 Klenow 片段缓冲液、DNTP 混合物和 P5N6 引物的 24 μL 反应体积中。在 PCR 热循环仪中将混合物在 15 °C 下预孵育 20 分钟，然后向反应混合物中加入两个单位的 Klenow 片段。在给定条件下，在 PCR 热循环仪中孵育混合物。
然后，将 PCR 产物转移到新的干净的 1.5 ml 离心管中。使用磁力架捕获磁珠并丢弃上清液。之后，在 4 摄氏度下用 300 微升 DNase 和不含 RNase 的蒸馏水轻轻洗涤珠子。
收集珠子并丢弃上清液。在 PCR 管中将微珠重悬于 25 μL PCR 反应体积中，该体积含有 Taq 缓冲液、Taq DNA 聚合酶、引物 P5、DNTP 混合物和引物 3-LTR_Nest。使用此处显示的设置在热循环仪中进行 PCR。
使用 5 微升 PCR 产物作为模板，使用引物 Illumina P5 和引物 Illumina P73-LTR 进行下一轮 PCR 反应。在给定条件下在热循环仪中进行 PCR。然后，将 PCR 产物转移到干净的 1.5 mL离心管中。
将微珠从 2 °C 平衡至 8 °C 至室温 30 分钟后，通过倒置或涡旋彻底混合微珠。将 1.2 倍体积的珠子移液到干净的 1.5 毫升离心管中。将 PCR 产物添加到珠子中，上下吹打 10 次，充分混合。
孵育磁珠，让 DNA 与它们结合。然后，将样品放在磁力架上，溶液澄清后去除上清液。现在，用 200 微升 80% 乙醇洗涤珠子。
在室温下孵育 30 秒，然后去除上清液。在室温下风干珠子，打开盖子约 5 分钟。现在，从磁力架上取下管子。
加入 22 μL 不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水。上下吹打 10 次，充分混匀，并在室温下静置 2 分钟。将试管放回磁力架上，直到溶液澄清。
然后，将 21 μL 上清液转移到干净的 1.5 mL离心管中。要使用荧光计测量浓度，请以 1 比 200 的比例混合试剂和缓冲液来制备工作溶液。混合 10 微升标准品 1 和 10 微升标准品 2，每剂与 190 微升工作溶液混合，以制备检测标准品。
轻轻涡旋混合物 2 到 3 秒钟。接下来，通过将 1 μL 纯化的 PCR 产物与 199 μL 的工作溶液混合来制备检测样品。轻轻涡旋混合物 2 到 3 秒钟。
将检测标准品和检测样品在室温下孵育 2 分钟，避光保存，然后打开荧光计。从主菜单中选择双链 DNA 高灵敏度检测程序。校准时，将标准品 1 插入机器，然后按下读取标准按钮以测量第一个标准品。
然后，插入标准品 2 并按下读取标准品按钮测量第二个标准品。对于样品测量，按 Run samples 按钮进入样品测量页面。插入每个包含检测样品的试管，然后按下读取试管按钮以获得浓度。
在低质量样品中，83 个碱基对附近的主峰表明接头二聚体污染。相比之下，高质量的 NGS 文库显示 150 到 1， 500 个碱基对之间的主峰，反映了成功文库的概况。
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概述
本文介绍了一种使用插入突变技术来识别功能性基因组元件的新方法。基于插入筛选功能元件和转录本（InSET）方法允许在细胞文库中检测慢病毒整合位点。
关键研究组成部分
科学领域
- 功能基因组学
- 基因组元件识别
- 基于慢病毒的方法
背景
- 研究集中在人类基因组的未探索区域。
- 当前的逆向遗传工具有限制，包括高成本和非特异性效应。
- 许多基因组元件因为靶向问题仍未被充分探索。
- 该研究旨在识别蛋白质编码和长非编码区域中的新型功能外显子。
研究目的
- 开发一种新方法来识别以前未知的基因组元件。
- 增强对人类基因组功能成分的理解。
- 解决现有逆向遗传工具的局限性。
使用的方法
- 利用基于慢病毒的插入突变细胞文库中的基因组DNA。
- 线性PCR反应来扩增整合位点。
- 筛选功能元件和转录本。
- 分析慢病毒整合模式。
主要结果
- 成功识别了新型基因组元件。
- 证明了InSET方法的有效性。
- 对于以前未探索的基因组区域的角色提供了见解。
- 对于理解人类生物学和疾病的潜在影响。
结论
- InSET方法为功能基因组学研究提供了一个有价值的工具。
- 它为探索人类基因组开辟了新的途径。
- 未来的研究可以在这种方法的基础上进一步阐明基因组功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Unbiased identification of functionally relevant genomic elements is a critical inflection point in early drug discovery, directly impacting target validation and mechanistic de-risking. The InSET protocol enables genome-wide mapping of lentiviral integration sites, revealing novel exons and regulatory elements beyond annotated regions. This capability strengthens predictive confidence in target selection and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of uncharacterized genomic regions for functional relevance.
- Supports biological de-risking by uncovering novel exons in both coding and non-coding RNAs.
- Facilitates robust target validation by linking integration site abundance to phenotypic outcomes.
- Improves predictive confidence for downstream target nomination and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated insertional mutagenesis libraries for high-throughput phenotypic screening.
- Standardizes detection of integration sites using next-generation sequencing for quantitative outputs.
- Enables reproducible identification of functional genomic elements across large-scale screens.
- Supports scalable workflows for compound evaluation in genetically diverse backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional genomics findings with disease-relevant transcriptomic features when supported by phenotypic screens.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by mapping novel elements implicated in disease biology.
- De-risks translational progression by clarifying the functional landscape of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
The InSET protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling unbiased functional genomics screens that inform target selection and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping integration sites to functional outcomes.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts of insertional events for robust assay development.
- Analytics: Provides high-resolution sequencing data to compare integration site abundance across conditions.
- Translational Research: Connects novel genomic elements to disease-relevant phenotypes when phenotypic screens are applied.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics interrogation across diverse cell libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales functional genomics workflows for reproducibility.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing previously uncharacterized functional elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in functional genomics, lentiviral systems, and next-generation sequencing.
- Demands access to high-throughput sequencing and robust bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of library preparation and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or model systems.
- Potential limitations include non-specific integration effects and the need for rigorous quality control of sequencing libraries.
