Name: 在插入诱变细胞文库中鉴定功能相关的慢病毒整合位点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 了解InSET方法在功能基因组学中的应用，通过慢病毒插入诱变细胞文库鉴定人类基因组中的功能元件。该技术可发现蛋白质编码区和长非编码区的新功能外显子，为疾病研究提供新见解。

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D.X. 受国家自然科学基金（32000441）、中国福建省自然科学基金（2023J01130）、华侨大学中央高校基本科研业务费专项资金（ZQN-924）和华侨大学科研基金（18BS205）资助。P.K. 受国家自然科学基金（32170619）、国家自然科学基金国际资深科学家研究基金（32150710525）和中国福建省自然科学基金（2020J02006）资助。

图1展示了InSET方法的示意图。为了获得最佳覆盖度，需从1 µg基因组DNA制备五个平行文库，然后将其混合用于高通量测序。该流程在先前的实验中已成功连续完成，但用户可根据需要自行设置暂停点。本研究中所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。
1. 基因组中慢病毒整合位点的捕获
<ol>
	<li>使用先前研究中所述的基于慢病毒插入突变细胞文库提取的基因组DNA（1 µg）32作为模板，在50 µL反应体系中进行线性PCR扩增，反应体系包含1x Taq缓冲液、2.5 U Taq DNA聚合酶、4 µL dNTP混合物（各2.5 mM）以及0.3 µM生物素标记的引物3-LTR_prime（表1），置于PCR管中。 
	注意：3-LTR_prime引物与慢病毒序列的LTR区域退火。若其与5' LTR退火，则扩增片段包含侧翼基因组序列；若与3' LTR退火，则扩增片段包含慢病毒内部序列，无法比对至宿主基因组，因此将在后续测序数据分析中被过滤掉。该引物也可进行修饰以适配其他类型载体构建的插入突变细胞文库。</li>
	<li>在标准PCR仪中进行50个循环的线性PCR扩增，在反应开始时和第25个循环结束后立即各添加2.5 U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件如下：94 °C预变性5 min；50个循环（94 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s）；72 °C终延伸5 min。 
	注意：为维持Taq DNA聚合酶在长时间反应中的活性，建议在反应开始和中途各添加一次酶。</li>
	<li>将PCR产物转移至新的洁净1.5 mL离心管中。</li>
	<li>将PCR产物与10 µL生物素-链霉亲和素磁珠充分混匀。</li>
	<li>将混合物置于金属浴中，室温下以400 rpm振荡孵育2小时。 
	注意：每15分钟取出管子，用移液器充分混匀。</li>
	<li>使用磁力架收集磁珠，小心移除上清液。</li>
	<li>用300 µL结合/洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA、1 M NaCl、0.1% Tween-20）清洗磁珠6次，每次均弃去上清液。</li>
	<li>用300 µL（65 °C）无DNase/RNase的去离子水洗涤两次，每次均弃去上清液。</li>
	<li>进行第二链合成时，在PCR管中将磁珠重悬于24 µL反应体系中，体系包含1x Klenow片段缓冲液、2 µL dNTP混合物（各2.5 mM）以及6.25 µM的P5_N6引物（表1）。 
	注意：配制100 µM的P5_N6引物储备液。P5_N6引物由5'端固定的P5接头序列和3'端随机六聚体序列组成。该随机六聚体可结合多种目标序列，适用于扩增线性PCR产生的各类DNA片段。</li>
	<li>在PCR仪中于15 °C预孵育20分钟。</li>
	<li>加入2 U Klenow片段（大肠杆菌DNA聚合酶大片段 E.coli）。</li>
	<li>在PCR仪中按以下条件孵育：以0.5 °C/min的速率从15 °C缓慢升至25 °C，随后孵育30分钟；再以0.5 °C/min的速率升至37 °C，孵育1小时。</li>
	<li>将PCR产物转移至新的洁净1.5 mL离心管中。</li>
	<li>使用磁力架捕获磁珠，弃去上清液。</li>
	<li>用300 µL 4 °C无DNase/RNase的去离子水轻柔洗涤磁珠，收集磁珠并弃去上清液。</li>
</ol>
2. 使用巢式PCR构建NGS文库
<ol>
	<li>将步骤 1.15 中的磁珠重悬于 25 µL 的 PCR 反应体系中，反应体系包含 1x Taq Buffer、1.25 U Taq DNA 聚合酶、0.5 µM 引物 P5（表 1）、2 µL dNTP 混合物（每种 2.5 mM）以及 0.5 µM 引物 3-LTR_Nest（表 1），置于 PCR 管中。</li>
	<li>在 PCR 扩增仪中按以下条件进行 PCR 扩增反应：94 °C 预变性 3 min；进行 20 个循环（94 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s）；最后 72 °C 延伸 7 min。</li>
	<li>取步骤 2.2 中得到的 PCR 产物 5 µL 作为模板，进行下一轮 PCR 扩增，反应体系总体积为 50 µL，包含 1x Taq Buffer、2.5 U Taq DNA 聚合酶、4 µL dNTP 混合物（每种 2.5 mM）、0.4 µM 引物 Illumina_P5（表 1）和 0.4 µM 引物 Illumina_P7-3LTR（表 1）。</li>
	<li>在 PCR 扩增仪中按以下条件进行 PCR 扩增反应：94 °C 预变性 3 min；进行 15 个循环（94 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s）；最后 72 °C 延伸 7 min。</li>
	<li>将 PCR 产物转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。 
	注意：本步骤可暂停，样品可在 -20 °C 条件下保存。</li>
	<li>使用 1.2 倍体积的 DNA 纯化磁珠对 PCR 产物进行纯化，最终体积调整为 21 µL。 
	注意：从平行制备的 5 个文库中各取 10 µL PCR 产物，混合后进行纯化，最终体积为 21 µL。PCR 产物的纯化流程参照 DNA 纯化磁珠生产商提供的说明书（见 材料表）。
	<ol>
		<li>将磁珠从 2–8 °C 平衡至室温，约 30 min。</li>
		<li>通过倒置或涡旋充分混匀磁珠。</li>
		<li>用移液器将 1.2 倍体积的磁珠转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>将 PCR 产物加入磁珠中，通过上下吹打 10 次充分混匀。</li>
		<li>室温孵育 5 min，使 DNA 与磁珠充分结合。</li>
		<li>将样品置于磁力架上，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清液。</li>
		<li>加入 200 µL 80% 乙醇洗涤磁珠，室温孵育 30 s 后移除上清液。 
		注意：80% 乙醇需新鲜配制。</li>
		<li>重复步骤 2.6.7 一次。</li>
		<li>打开管盖，室温下空气干燥磁珠约 5 min。</li>
		<li>将离心管从磁力架上取下，加入 22 µL 无 DNase/RNase 的去离子水，通过上下吹打 10 次充分混匀，室温静置 2 min。</li>
		<li>将离心管放回磁力架，待溶液澄清后（约 2 min），转移 21 µL 上清液至新的洁净 1.5 mL 离心管中。 
		注意：本步骤可暂停，样品可在 -20 °C 条件下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 1 µL 纯化后的 PCR 产物，使用荧光计配合市售的双链 DNA 荧光检测试剂盒（见 材料表）测定浓度。 
	注意：浓度测定操作流程遵循双链 DNA 检测试剂盒生产商提供的说明书。
	<ol>
		<li>将试剂盒中提供的试剂与缓冲液按 1:200 的比例混合，配制工作液。</li>
		<li>分别取 10 µL 标准品 #1 和 10 µL 标准品 #2（试剂盒提供），各加入 190 µL 工作液，配制成检测用标准品，轻轻涡旋混匀 2–3 s。</li>
		<li>取 1 µL 纯化后的 PCR 产物与 190 µL 工作液混合，配制成检测样品，轻轻涡旋混匀 2–3 s。</li>
		<li>将检测标准品和检测样品于室温避光孵育 2 min。</li>
		<li>开启荧光计。</li>
		<li>从主菜单中选择 dsDNA High Sensitivity&#160;程序。</li>
		<li>进行校准：将标准品 #1 插入仪器，按下 Read standard 按钮测定第一个标准品；随后插入标准品 #2，按下 Read standard 按钮测定第二个标准品。</li>
		<li>进行样品测定：按下 Run samples 按钮进入样品测定界面。依次插入含有检测样品的离心管，按下 Read tube 按钮获取浓度值。 
		注意：本步骤可暂停，样品可在 -20 °C 条件下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 Illumina 测序平台上采用双端 150 bp（PE150）策略，进行 30 吉碱基（GB）规模的高通量测序。 
	注意：此步骤通常外包给测序公司完成。</li>
</ol>
3. 数据分析
注意：本节以人源细胞系中的分析为例。
<ol>
	<li>慢病毒整合位点的定位
	<ol>
		<li>使用 fastp 工具33（参见材料表）过滤测序读段，排除含有超过 50% 低质量碱基（Phred 分数 &#60;20）、超过 15 个 'N' 碱基或长度短于 150 个碱基的读段。</li>
		<li>仅保留第二端读段（read 2）以 LTR 标签 &#34;GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG 
		ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGA&#8203;AT 
		TAGCCCTTCCA&#34; 开头的成对读段。 
		注：该序列取决于用于构建插入突变细胞文库的载体序列。</li>
		<li>从步骤 3.1.2 筛选出的读段中切除 LTR 标签序列。</li>
		<li>使用 BWA-MEM 34（参见材料表）以默认参数将切除后的读段比对至 GRCh37/hg19 参考基因组。</li>
		<li>仅保留第一端读段（read 1）和第二端读段（read 2）均唯一比对至基因组、且具有正确构型和间距的读段对，其标志为 FLAG 147 和 FLAG 163。</li>
		<li>将插入位点定义为切除后 read 2 的第一个比对碱基位置。</li>
		<li>将每个唯一插入位点的读段数归一化至各样本中唯一比对读段总数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>影响细胞适应性的插入位点（IACFs）的鉴定 
	注：在统计分析中，建议对对照组和处理组各自的三个生物学重复进行成对比较，以识别显著富集或耗竭的位点。上述重复数为最低要求，建议在实际可行范围内尽可能增加重复数，以确保结果的可靠性和准确性。
	<ol>
		<li>将每个位点的归一化读段数转换为 log10 值。</li>
		<li>将读段数为零的位点的 log10 值设为 −5。</li>
		<li>对 log10 值进行双侧配对 Student's t-检验。</li>
		<li>在 R 环境中使用 Benjamini-Hochberg 方法对 p 值进行多重比较校正。</li>
		<li>选择错误发现率（FDR）阈值为 25% 的位点作为 IACFs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>影响细胞适应性的插入簇（CACFs）的鉴定 
	注：建议本分析使用对照组和处理组各三个生物学重复。
	<ol>
		<li>使用 SICER35（参见材料表）以 FDR 阈值 1% 鉴定对照组与处理组之间显著富集或耗竭的插入簇。SICER 分析命令为 &#34;sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01&#34;。 
		注：上述命令中各参数含义如下：[&#34;InputDir&#34;] [&#34;处理样本插入位点 bed 文件&#34;] [&#34;对照样本插入位点 bed 文件&#34;] [&#34;OutputDir&#34;] [&#34;物种&#34;] [&#34;冗余阈值&#34;] [&#34;窗口大小（bp）&#34;] [&#34;片段大小&#34;] [&#34;有效基因组比例&#34;] [&#34;间隔大小（bp）&#34;] [&#34;E 值&#34;]。</li>
		<li>使用 BEDTools 工具包36（参见材料表）中的 &#34;intersect&#34; 功能，获取至少在两个生物学重复中共同存在的簇区域，并将这些簇区域记为 CACFs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

<ol><li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+activity+in+chromosomes+21+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22.</a> Science. 296 (5569), 916-919 (2002).</li>
<li>Bertone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+human+transcribed+sequences+with+genome+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays.</a> Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+total+nuclear-encoded+non-ribosomal+RNA+in+a+human+cell+is+%27dark+matter%27+un-annotated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA.</a> BMC Biol. 8, 149(2010).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examples+of+the+complex+architecture+of+the+human+transcriptome+revealed+by+race+and+high-density+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays.</a> Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+use+of+distal+5%27+transcription+start+sites+and+discovery+of+a+large+number+of+additional+exons+in+encode+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions.</a> Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+RNA+sequencing+reveals+the+deep+complexity+of+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome.</a> Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).</li>
<li>Deveson, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+alternative+splicing+of+non-coding+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Universal alternative splicing of non-coding exons.</a> Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).</li>
<li>Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexities+of+mammalian+transcriptome+revealed+by+targeted+RNA+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques.</a> Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).</li>
<li>Amaral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+the+human+gene+catalogue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The status of the human gene catalogue.</a> Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).</li>
<li>Mattick, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs%3A+Definitions%2C+functions%2C+challenges+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).</li>
<li>Bassik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+non-coding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 6320(2017).</li>
<li>Bester, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+genome-wide+CRISPRa+approach+to+functionalize+lncRNAs+in+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance.</a> Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+for+functional+long+non-coding+RNAs+in+human+cells+by+Cas9+targeting+of+splice+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites.</a> Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas13-based+approach+demonstrates+biological+relevance+of+vlinc+class+of+long+non-coding+RNAs+in+anticancer+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response.</a> Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).</li>
<li>Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+approaches+for+biochemical+reactions+independent+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).</li>
<li>Recinos, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-dCas13d-based+deep+screening+of+proximal+and+distal+splicing-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements.</a> Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).</li>
<li>Stojic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+RNAi%2C+LNA+and+CRISPRi+as+loss-of-function+methods+in+transcriptional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis.</a> Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).</li>
<li>Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-genetics+studies+of+lncRNAs-what+we+have+learnt+and+paths+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward.</a> Genome Biol. 21 (1), 93(2020).</li>
<li>Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+walking+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Genome walking in eukaryotes.</a> FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploid+genetic+screens+in+human+cells+identify+host+factors+used+by+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens.</a> Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).</li>
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作者无披露信息。

在正向遗传学分析中，基因组步行法对于鉴定插入诱变细胞文库中的整合位点至关重要。传统的基因组步行方法，如 I-PCR&#160;和 LAM-PCR&#160;，通常需要限制性酶切和连接步骤，这些步骤可能因依赖酶切位点而降低文库复杂性并引入偏差27,28,29。InSET 方法通过省去限制性酶切和连接步骤，克服了这些局限性。该方法类似于侧翼序列指数锚定 PCR（FLEA-PCR）37，但进一步简化：无需使用阻断性寡核苷酸来避免扩增逆转录病毒内部序列；这些内部序列可在后续的高通量测序（NGS）数据分析中去除。InSET 方法专为 NGS 应用设计，非常适合检测插入诱变细胞文库中的整合位点。该方法操作简便、易于使用，完成 NGS 文库制备约需九小时。
InSET 实验方案包含以下几个关键步骤：（1）线性扩增：使用生物素标记的引物扩增慢病毒整合位点。随后利用生...

即使在后基因组时代，功能基因组学仍然是一个至关重要且充满挑战的领域，基因组中仍有相当大比例的区域缺乏功能注释。造成这些挑战的一个主要原因是人类基因组和转录组的复杂性，其特征是在蛋白质编码区和非编码区均普遍存在转录活动以及广泛的可变剪接1,2,3,4,5。这种复杂性已通过靶向RNA的富集研究得到广泛揭示6,7,8,9。人们日益认识到，除了人类基因组中已有明确注释的片段外，仍存在大量尚未定位且功能未注释的新型基因组元件10,11,12。
近年来，反向遗传学工具取得了显著进展，例如RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas系统13,14,15,16,17,18,19,20,21。然而，这些方法存在明显缺点，包括非特异性效应，以及构建短发夹RNA（shRNA）或单导向RNA（sgRNA）复杂文库所带来的高成本22,23,24,25。此外，这些方法主要针对已有注释的基因组元件。相比之下，正向遗传学的优势在于能够识别新颖的、尚未注释的功能性基因组元件。鉴于人类基因组和转录组的高度复杂性，以及大量未知基因组元件的存在，正向遗传学的这一能力具有重要意义。
正向遗传学细胞文库通常通过逆转录病毒的随机整合来构建，因此高效检测全基因组范围内的整合位点对于正向遗传学分析至关重要。检测这些整合位点通常需要借助基因组步移技术26。尽管此类技术已取得显著进展，但其中很少有方法针对下一代测序（NGS）应用进行了优化，并随后应用于插入突变研究中。细胞系中的插入突变通常采用反向PCR（I-PCR）或线性扩增介导PCR（LAM-PCR）等方法来检测整合位点27,28,29。然而，这些方法通常需要限制性酶切或连接步骤，可能导致效率降低并引入结果偏差。
为了提高正向遗传学筛选中全基因组整合位点的检测效率，本文介绍了一种名为基于插入的基因功能元件与转录本筛选（Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts，InSET）的方法。通过将基因组步移技术与高通量测序（NGS）相结合，InSET能够实现对基于慢病毒插入突变文库中慢病毒整合位点的高通量鉴定。与现有方法27,28,29相比，InSET操作相对直接且简便，无需限制性酶切或连接步骤，因而更加便捷且易于推广。此外，尽管现有的哺乳动物细胞正向遗传学筛选仅限于极少数单倍体或接近单倍体的细胞系27,28,29,30,31，InSET已被证实可在非整倍体细胞系中有效应用32。
本研究提供了实施InSET方法的详细分步实验方案，并展示了InSET在插入突变研究中的应用。InSET是一种强大的工具，可用于鉴定人类细胞系基因组元件中的新外显子，涵盖蛋白质编码RNA和非编码RNA。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>用于配制结合/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>用于配制结合/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>10&amp;times; Klenow 片段缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Taq 缓冲液</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9659</td><td>用于配制结合/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>BeaverBeads 链霉亲和素磁珠</td><td>Beaver</td><td>22307-1</td><td>1 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>BEDTools</td><td></td><td>软件，v2</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td></tr><tr><td>BWA-MEM</td><td></td><td></td><td>软件，v0.7.12</td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>Takara</td><td>4030</td><td>每种 2.5 mM</td></tr><tr><td>Equalbit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Vazyme</td><td>EQ111-02</td><td></td></tr><tr><td>fastp</td><td></td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>HiSeq X Ten</td><td>Illumina</td><td>SY-412-1001</td><td>Illumina 测序平台，外包给诺禾致源公司（北京）</td></tr><tr><td>Klenow 片段</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>20012850</td><td>Illumina 测序平台，外包给诺禾致源公司（北京）</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>SICER</td><td></td><td></td><td>软件，v1.1</td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>HuShi</td><td>30189328</td><td>用于配制结合/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA 纯化磁珠</td><td>Vazyme</td><td>N411-01</td><td></td></tr></tbody></table>

插入突变细胞文库中功能相关慢病毒整合位点的鉴定

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

人类基因组中功能序列的范围是生物学领域一个关键但尚存争议的话题。尽管高通量反向遗传学筛选已在此方面取得进展，但这些方法通常局限于已知的基因组元件，且可能引入非特异性效应。这凸显了开发新型功能基因组学工具的迫切需求，以实现对基因组功能更深入、无偏倚的理解。本实验方案介绍了基于插入的功能元件与转录本筛选方法（Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts, InSET），该方法用于鉴定基于慢病毒的插入诱变细胞文库中的慢病毒整合位点。InSET可捕获全基因组范围内的慢病毒整合位点，并利用下一代测序技术检测和量化侧翼序列。InSET的设计支持在表型筛选中大规模分析整合位点丰度的变化，使其成为正向遗传学研究及功能基因组元件鉴定的有力工具。InSET的一个关键优势在于其能够独立于已有注释，发现先前未被识别的基因组元件，包括蛋白质编码RNA和非编码RNA中的新功能外显子。总体而言，InSET在研究人类基因组和转录组复杂性方面具有重要价值，目前仍有大量基因组元件有待功能表征。

NGS文库的质量控制评估通常由测序服务提供方完成，是测序前的标准质量检查步骤。为了展示文库质量的影响，本研究对两个样本进行了比较。高质量文库标记为s2-20-15，采用标准的嵌套PCR流程制备，包含两个连续的扩增步骤：第一步扩增20个循环，第二步扩增15个循环。相比之下，低质量文库标记为s1-30，采用单步PCR流程制备，通过30个循环扩增将Illumina接头引入。
如表2所示，与高质量样本相比，低质量样本通过荧光法和qPCR法测得的文库浓度均较低。值得注意的是，qPCR浓度测定结果比荧光法测定结果更能可靠地反映NGS文库的质量。进一步使用生物分析仪对文库进行分析。在低质量样本中，约83 bp处出现一个显著的主峰，表明存在接头二聚体污染（图2）。相比之下，高质量NGS文库在150 bp至1500 bp范围内呈现多个主峰，符合成功构建的InSET文库的特征（图2）。
低质量和...

插入突变是正向遗传学中用于鉴定功能性基因组元件的重要工具。本文中，我们描述了一种基于插入的功能元件与转录本筛选方法（InSET），该方法可用于检测基于慢病毒的插入突变细胞文库中的慢病毒整合位点。

人类基因组中功能性序列的范围是生物学中一个关键但尚存争议的话题。尽管高通量反向遗传学筛选……

我们正在开展功能基因组学研究，重点在于识别和表征人类基因组中的功能元件。我们的主要兴趣是探索基因组中尚未被充分注释的部分，以更深入地理解其潜在作用及其在人类生物学与疾病中的可能贡献。目前的反向遗传学工具存在一些局限性，例如非特异性效应，以及构建SSI或SGI复杂文库时的高成本。另一个挑战在于，该方法可能仅能靶向已知的基因组元件，导致基因组的大部分区域仍未被充分探索。本文开发的方案提供了一种新方法，可用于鉴定先前未知的基因组元件，包括蛋白质编码基因和长链非编码 RNA 中的新型功能外显子。首先，以从基于慢病毒的插入突变细胞文库中分离得到的基因组 DNA 作为模板，在 50 微升反应体系中进行线性 PCR 扩增。然后。将此处所示其他所需试剂加入PCR管中。在标准的PCR扩增仪中，按照给定的PCR条件进行50个循环的线性PCR反应。将PCR产物转移至新的洁净1.5毫升离心管中。将PCR产物与10微升链霉亲和素-生物素磁珠充分混合，在金属浴中室温下以400 RPM振荡孵育两小时。然后，使用磁力架收集磁珠，并小心移除上清液。用300微升结合缓冲液或洗涤缓冲液洗涤磁珠六次，每次洗涤后弃去上清液。对于第二链合成，将磁珠重悬于含有Klenow片段缓冲液、dNTP混合物和P5N6引物的24微升反应体系中，置于PCR管内。在PCR仪中于15摄氏度预孵育20分钟，然后向反应体系中加入2单位的Klenow片段。在指定条件下，于PCR仪中孵育反应体系。然后，将PCR产物转移至一个新的洁净1.5毫升离心管中。使用磁力架捕获磁珠，并弃去上清液。随后，在4°C下，用300 µL无DNase和RNase的去离子水轻轻洗涤磁珠。收集磁珠并弃去上清液。将磁珠重悬于25 µL PCR反应体系中，该体系包含Taq缓冲液、Taq DNA聚合酶、引物P5、dNTP混合物以及引物3-LTR_Nest，并置于PCR管中。使用此处所示程序在热循环仪中进行PCR反应。取5 µL PCR产物作为模板，使用Illumina P5引物和Illumina P73-LTR引物进行下一轮PCR反应。在热循环仪中按照给定条件进行PCR。然后，将PCR产物转移至洁净的1.5 mL离心管中。将磁珠从2–8摄氏度平衡至室温30分钟后，通过倒置或涡旋充分混匀。用移液器吸取磁珠体积1.2倍的量，转移至一个洁净的1.5毫升离心管中。将PCR产物加入磁珠中，并通过上下吹打10次充分混匀。孵育磁珠，使DNA结合到磁珠上。然后将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清液。接着用200微升80%乙醇洗涤磁珠。室温孵育30秒，去除上清液。打开管盖，室温下将磁珠晾干约5分钟。然后，将试管从磁力架上取下。加入 22 微升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水。用移液器上下吹打 10 次以充分混匀，并在室温下静置两分钟。将离心管放回磁力架上，直至溶液变澄清。然后，将21微升上清液转移至一支洁净的1.5毫升离心管中。使用荧光计测量浓度时，通过将试剂与缓冲液按1:200的比例混合，配制工作液。分别取10微升标准品一和10微升标准品二，各与190微升工作液混合，以制备检测用标准品。轻轻涡旋混合物2到3秒。接下来，通过将1微升纯化的PCR产物与199微升工作液混合，制备检测样品。再次轻轻涡旋混合物2到3秒。将检测标准品和检测样品在室温下避光孵育两分钟，然后打开荧光仪。从主菜单中选择双链DNA高灵敏度检测程序。进行校准：将标准品一插入仪器，按下读取标准品按钮，以测定第一个标准品。然后，插入标准品二并按下读取标准品按钮，以测定第二个标准品。进行样品测定时，按下运行样品按钮，进入样品测定页面。插入每个含有待测样品的试管，并按下读取试管按钮，以获得样品浓度。在低质量样本中，约83个碱基处出现一个主导峰，表明存在接头二聚体污染。相比之下，高质量的NGS文库在150至1,500个碱基之间呈现主峰，反映出成功文库的特征谱型。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在插入诱变细胞文库中鉴定功能相关的慢病毒整合位点

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

本文介绍一种在人类细胞中对基于莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录病毒载体整合位点进行全基因组定位的实验方案。...

逆转录病毒扫描：绘制MLV整合位点以界定细胞特异性调控区域

我们介绍了整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLVs）的制备策略，该载体可用于向细胞递送CRISPR/Cas9系统。IDLVs能够快速高效地介导细胞基因编辑，与具有整合酶活性的载体相比，其作为一种基因递送载体平台具有更高的安全性，且编辑效率相当。...

一种用于在分裂细胞中通过CRISPR/Cas9介导基因敲除的整合酶缺陷型慢病毒载体的制备方案

我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。...

基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型

基于基因编码的组蛋白-miniSOG可在蓝 光依赖的方式下诱导全基因组范围内的可遗传突变。该诱变方法操作简便、速度快、无需有毒化学试剂，非常适合用于正向遗传筛选和转基因整合。...

使用组蛋白-miniSOG在C. elegans中进行光遗传学随机诱变

靶向 原位 酿酒酵母组蛋白基因的诱变

生成大规模gRNA文库的方法应具备简单、高效且成本低廉的特点。本文介绍了一种基于靶DNA酶切的gRNA文库制备方案。该方法称为CORALINA（通过可控核酸酶活性实现全面gRNA文库构建），为昂贵的定制寡核苷酸合成提供了替代方案。...

一种从任意DNA来源大规模制备gRNA文库的通用方案

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内...

CRISPR/Cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

本文介绍了一种在裂殖酵母中对目标基因进行随机突变的详细方法。以rpt4+基因为例，该基因编码19S蛋白酶体的一个亚基，我们筛选能够破坏异染色质稳定性的突变。...

通过基因靶向随机诱变筛选裂殖酵母中破坏异染色质稳定的蛋白酶体突变体

了解InSET方法在功能基因组学中的应用，通过慢病毒插入诱变细胞文库鉴定人类基因组中的功能元件。该技术可发现蛋白质编码区和长非编码区的新功能外显子，为疾病研究提供新见解。

插入突变细胞文库中功能相关慢病毒整合位点的鉴定

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