Name: 保留气道中真菌孢子空间动力学的小鼠肺成像的有效方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 了解一种保留小鼠气道真菌孢子空间位置的高效肺成像方法。该方案通过空气充气与血管灌注固定，避免传统液体固定导致的气道内容物移位，实现真菌孢子自然定位的精确分析。

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本研究的资金和支持来自美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 K22 AI153678-01 以及罗格斯大学研究生院。我们感谢罗格斯大学生物医学健康科学细胞成像与组织学核心实验室的 Fawad Yousufzai 和 Luke Fritzky 在获取免疫荧光图像方面所提供的工作支持与专业技术。

本方案中描述的所有方法均已获得罗格斯大学生物医学健康科学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 用细胞内荧光标记孢子
<ol>
	<li>将 1 × 106 个孢子用 5 µM 的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）、Cell Tracker Orange 或 Cell Tracker Red（或其他选择的细胞内染料）在 30 °C 下染色 30 分钟，然后用 PBS 洗涤，并在 12,000 × g 条件下离心孢子。重复洗涤一次。</li>
	<li>将孢子接种物配制为适当浓度，使 25 µL 中含有每只小鼠所需的适当孢子剂量。</li>
</ol>
2. 使用异氟烷麻醉通过吸入法使小鼠感染孢子
警告：异氟烷是一种挥发性麻醉剂，必须在带管道的生物安全柜或通风橱内使用。
<ol>
	<li>准备异氟烷暴露罐时，将一张折叠的纸巾放入一个1 L带螺口盖的Nalgene罐中，并在纸巾上放置一个圆形塑料网作为小鼠的平台。向纸巾上加入2 mL异氟烷，盖紧罐子，静置1–2分钟，使气体在容器内达到平衡。</li>
</ol>
<img alt="细胞培养孵育、密封容器、实验室设置、组织生长观察、无菌环境。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：异氟烷开放滴注法接种孢子的装置示意图。 在一个1 L带螺口盖的广口瓶底部放置一张折叠的纸巾，然后插入一个圆形塑料网，作为放置小鼠的平台。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>在将小鼠暴露于麻醉之前，用移液器吸取 25 µL 接种物。将小鼠放入异氟烷容器中，并倾斜容器以观察翻正反射的消失，即小鼠失去意识并呈倒置状态。此过程通常需要约 10 秒。</li>
	<li>监测呼吸频率（RR），直至其减慢至稳定在每分钟 50–80 次（bpm），约为静息呼吸频率的 50%。此过程通常还需约 10 秒。此时，将小鼠从异氟烷容器中取出。 
	注意：此为高浓度异氟烷，可快速诱导麻醉，必须密切监测小鼠状态。由于异氟烷浓度可能不稳定，且其剂量-反应曲线极为陡峭，存在致死性过量风险。若呼吸频率低于 50 bpm 和/或出现不规则，应立即将小鼠移出异氟烷环境，使其恢复 3–5 分钟后再次尝试（最多重复两次）。</li>
	<li>通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度。随后，用一只手将小鼠置于仰卧位，使其进行 3–5 次逐渐加快且力度增强的规律性张口呼吸（起始频率为 50–60 bpm）。当张口呼吸开始时，将移液器尖端置于小鼠口咽后部，并在吸气过程中释放接种物。 
	注意：由于呼吸辅助肌被动员，经口的深大呼吸会导致头部突然向下移动。在深大呼吸期间插入移液器时，小鼠应每次呼吸时张口。若未见张口，表明麻醉深度不足，小鼠很可能无法吸入口咽部的接种物。移液器应压下舌头，将其推向口腔底部前方，以防止接种物被吞咽。当移液器位于口腔内且小鼠麻醉充分时，每次深大呼吸均会伴随张口动作。</li>
	<li>用手及拇指固定小鼠，触诊其胸廓前后部位，感知是否存在爆裂音，以确认接种物已被吸入。</li>
</ol>
3. 小鼠安乐死
<ol>
	<li>在预定处死时间点前10分钟，对小鼠进行腹腔注射，注射液为每公斤体重200 mg的氯胺酮和每公斤体重24 mg的赛拉嗪混合物。</li>
	<li>注射后等待10分钟，直至小鼠进入外科麻醉状态，通过脚趾夹捏无反应来确认。</li>
</ol>
4. 用 PBS 和甲醛灌注肺组织
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒麻醉后的小鼠。用剪刀剪开小鼠背部皮肤，并将皮肤向四周拉开，暴露腹膜。将小鼠上半身的皮肤拉过头部，并将前肢从皮肤中抽出。</li>
	<li>在胸骨处及肋骨下缘切开腹膜，暴露腹腔。将肝脏向下推移，显露膈肌。用剪刀小心地在远离肺实质的位置刺穿膈肌，避免直接刺破肺组织本身。 
	注意：若不慎刺破肺部，将导致后续无法进行充气操作。</li>
	<li>膈肌刺穿后，空气进入胸腔，使肺组织塌陷。剪开小鼠左侧肋骨以暴露心脏。使用30 G针头以每5秒1 mL的速度向右心室注入5–10 mL PBS，使肺迅速变白。 
	警告：福尔马林是一种有害的挥发性物质，应在通风式生物安全柜或通风橱中操作。</li>
	<li>操作完成后，拔出针头，并换用新针头以相同速度向右心室注入5 mL 10%中性缓冲福尔马林（NBF）。</li>
</ol>
5. 对灌注肺进行空气膨胀
<ol>
	<li>移除肋骨笼的前半部分。为暴露气管，从颈部左右两侧剪断上方的肋骨和锁骨，注意避免在靠近正中线处切割，因为气管位于此处。用镊子夹住颈部正中线残留的上部肋骨和锁骨，向上牵拉，直至气管暴露。</li>
	<li>准备一根10 cm长的缝合线，将其从气管下方穿过，并在暴露气管的下端预先打一个松结。准备一支装有空气的1 mL注射器，连接18 G导管。使用18 G针头在暴露气管区域的上端刺一个小孔。</li>
	<li>将导管插入该孔中，确保贴合较紧密，防止漏气。在10秒内缓慢将1 mL空气注入肺部，观察各肺叶是否膨胀。充分膨胀时，肺组织会轻微包绕心脏，并充满未穿刺膈肌时所占据的空间。</li>
	<li>拉紧气管周围的结扎线，然后拔出导管。握住气管，使用钝头剪刀小心将肺从小鼠体内取出，注意避免刺破肺组织。</li>
</ol>
6. 浸入式固定与脱水
<ol>
	<li>将肺组织置于装有20 mL 10% NBF的50 mL锥形管顶部边缘，使缝合线位于锥形管外，拧紧管盖，倒置锥形管，使肺组织悬垂于20 mL NBF中。于4 °C放置24–48小时。</li>
	<li>用PBS冲洗肺组织，然后将其放入30%蔗糖-PBS（w/v）溶液中，在4 °C下处理72–96小时，以脱水并为冷冻保存做准备。将肺组织从蔗糖溶液中取出，放入包埋模具中，加入最佳切割温度（OCT）包埋剂，于-80 °C冷冻保存。</li>
</ol>
7. 冷冻切片
<ol>
	<li>在切片前，将OCT包埋的标本置于恒冷切片机中，在-20 °C下平衡1小时。将包埋块切成20–100 µm厚度的切片。 
	注意：充气可能导致标本脆性增加，而增加切片厚度可防止切片过程中组织破裂。</li>
	<li>将切片转移至玻璃载玻片上，干燥30分钟至1小时，以确保组织牢固黏附于载玻片。 
	注意：此步骤后载玻片可于-80 °C保存。</li>
</ol>
8. 载玻片制备与封闭
<ol>
	<li>将切片置于 PBS 浴液中（置于培养皿或 Coplin 染色缸内），在室温（RT）下孵育 30 分钟，以去除切片上的 OCT 包埋剂。 
	注意：较厚的切片（40–100 µm）可能不如较薄切片牢固地贴附于玻璃载片上，因此最好将其平放或直立放置于培养皿中，而不是侧置于 Coplin 染色缸内。</li>
	<li>OCT 从组织中完全溶解后，将切片干燥。用擦拭纸去除组织样本周围载片边缘的多余液滴。</li>
	<li>使用疏水性 Pap 笔在样本周围画出一圈封闭区域，并静置干燥 5 分钟。</li>
	<li>每张切片用 300 mL 动物源-free 封闭液，加入 0.3% Tween-20 和 1:100 稀释的 Fc Block，配制封闭缓冲液。 
	注意：针对细胞内靶标，可使用 1% Tween-20。通常 300 µL 体积已足够，但实际所需体积取决于疏水标记圈定的面积，应确保完全覆盖组织。从此步骤开始，组织切片不得干燥。</li>
	<li>在室温下将封闭液孵育于切片上，持续 1 小时。</li>
</ol>
9. 免疫染色
<ol>
	<li>用移液器吸去液体，加入 300–500 µL PBS 清洗载玻片。重复清洗一次。</li>
	<li>在无动物成分的封闭液中配制含 0.33% Tween-20（针对细胞表面靶标）或 1% Tween-20（针对细胞内靶标）的一抗 AlexaFluor-647 标记的大鼠抗小鼠 EpCAM 抗体（克隆号 G8.8，气道上皮细胞标志物）。每张载玻片加入 300 µL 该溶液，于 4 °C 避光孵育过夜。 
	注意：抗体的染色浓度、孵育时间和温度应通过实验优化确定。薄切片（8–20 µm）通常在 37 °C 孵育 30 分钟，厚切片（20–100 µm）则在 4 °C 孵育过夜，多数抗体使用 1:100 稀释比例。若使用未标记的一抗，需按上述方法清洗两次，再加入荧光标记的二抗，孵育时间和温度根据实验条件确定。通常二抗染色在室温下以 1:1000 稀释比例孵育 1 小时。</li>
	<li>移除样本上的抗体溶液，用 300 mL PBS 洗涤载玻片 5 分钟。重复洗涤一次。将载玻片干燥，彻底去除样本及周围玻璃表面的多余液体。</li>
	<li>向每份组织样本滴加一滴室温的软性封片介质（例如 SlowFade Glass）。为避免产生气泡，可先将试剂瓶倒置静置片刻，再缓慢将液滴滴加至组织上。盖上大小合适的盖玻片，使其边缘超出样本及疏水性标记圈的范围。</li>
</ol>
10. 荧光显微镜成像
<ol>
	<li>使用多通道荧光显微镜，采用具有足够分辨率以分辨单个孢子和宿主细胞的物镜（例如，Zeiss Axioscan 7 配备数值孔径 NA = 0.8 的 20 倍油镜或类似设备），对整个肺组织切片进行无偏扫描。 
	注意：应设置激光功率和光电倍增管（PMT）电压增益，以使目标信号相对于荧光减一（FMO）对照所确定的背景达到最高的信噪比。</li>
	<li>采集足够数量的图像瓦片以覆盖整个肺叶（例如，约 200 个尺寸为 400 μm × 400 μm 的瓦片）。使用显微镜配套软件（例如，Zeiss ZEN 3.7 或类似软件）导出合并后的瓦片图像，用于后续分析。</li>
</ol>
11. 通过 QuPath 进行空间分析
<ol>
	<li>在 QuPath（一款免费的开源软件14）中创建项目文件，并将荧光图像添加到该文件中。</li>
	<li>通过点击顶部菜单选项 分类，然后选择 像素分类 &gt; 创建阈值器，将 EpCAM+ 像素分类为上皮组织。选择最适合识别目标区域的分辨率、通道、平滑 sigma 值和阈值。将分类器以唯一名称保存，并选择 创建对象。</li>
	<li>在新的 创建对象 窗口中，选择 新对象类型 为 注释。对于肺上皮组织，将最小对象大小和最小孔洞大小均设置为 100 mm2。此处无需选择 分割对象。点击 确定 后，将生成注释，可使用左上角区域的 画笔 工具进行目视修改。</li>
	<li>为对孢子进行分类，重复步骤 11.3–11.4，使用捕获孢子的通道，并将新对象类型设为 检测 而非 注释。将最小对象大小和最小孔洞大小均设置为 0 mm2，并选择 分割对象。</li>
	<li>为进行孢子的空间分析，选择顶部菜单选项 分析 &gt; 空间分析 &gt; 计算到注释的二维有符号距离。系统将计算每个检测到的孢子到 EpCAM+ 上皮组织的距离。通过顶部菜单选项 测量 &gt; 导出测量结果 导出这些数据。</li>
</ol>

Preserving Fungal Spore Localization in Lungs for Fluorescent Microscopy Analysis

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们建立了一套用于孢子吸入及分析吸入孢子空间分布的实验流程。该流程可提供重要信息，用以确定吸入Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ关节孢子后肺部相关间质区域的影响情况。我们观察到，Coccidioides孢子以及大小相似的惰性颗粒（数据未显示）主要积聚在远端细支气管区域和支气管-肺泡交界处，而非均匀分散于肺泡气道腔内。本模型仅需相对简单的设备和较低的技术操作水平，即可制备用于免疫荧光（或其他下游分析流程，如免疫组织化学[IHC]）的冷冻切片，同时保持气道内容物的生理完整性及肺部自然形态。若不进行充气，肺泡的塌陷将导致细支气管周围肺实质自然结构的扭曲13,15。在定义肺结构定量评估标准时，美国胸科学会与欧洲呼吸学会联合发布的官方研究政策声明已指出，组织学处理过程中肺部气体容积的丧失是一个&#34;严重问题&#34;16。此外，经气管灌注定型剂可能破坏近端气道中分子和细胞组分的性质与定位，例如黏蛋白、表面活性物质和气道纤毛17,18,19。本文所述方法可充分保留肺部气体容积，同时维持气道中与吸入真菌孢子相互作用的分子和细胞组分的完整性。
免疫荧光显微镜技术为研究肺组织组分的空间动态提供了强有力的工具，该方法已有充分综述20,21。除对甲醛固定敏感的抗原表位可能导致抗体结合效果不佳外，这些切片的免疫荧光染色目标几乎不受限制。使用新抗体时，最好设置荧光减一（FMO）对照，以判断该抗体是否产生超出背景水平的信号。若使用二抗，应设置不加一抗的处理组，以控制二抗的非特异性结合。直接标记的一抗单克隆抗体特异性很高，因此通常在较高温度（37 °C）下孵育较短时间（30 min），即可实现对靶标的特异性结合。相反，未标记的多克隆抗体检测抗原的灵敏度较高但特异性较低，因此需在较低温度（4 °C）下长时间孵育（约16 h），以优化信噪比。所有抗体均需通过实验条件优化。
本研究中用于孢子定位的空间分析模型，通过测量单个孢子到最近细支气管上皮的距离来实现。这需要利用细支气管上皮在EpCAM信号强度较高以及其作为管状结构内衬的柱状上皮所具有的形态学特征，来准确识别细支气管上皮。肺泡上皮也可能以较低水平表达EpCAM，因此在QuPath中对EpCAM信号设置阈值非常重要，以确保所定义的注释区域仅限于形态学上确认的细支气管区域。由于细支气管具有解剖学上的最小尺寸，我们可以将QuPath中这些区域的定义限制为最小面积100 mm2，&#160;如步骤11.3所述。这将排除肺泡腔内孤立的高EpCAM表达细胞或伪影（例如肺泡II型上皮细胞）进入QuPath的注释区域。通过这些步骤，我们能够将细支气管上皮特异性地定义为QuPath注释区域，并确定孢子与该定义的细支气管上皮之间的接近程度。
本文所述的感染模型采用异氟烷麻醉，以诱导小鼠产生口腔喘息反应，从而吸入真菌孢子。异氟烷开放滴注法是一种快速、低资源消耗的技术，用于对小鼠实施短期麻醉9,22,23。该方法需要一定练习才能稳定操作。麻醉时间必须足够长，以确保小鼠充分麻醉，从而吸入咽部内容物。若麻醉不足，小鼠可能吞咽接种物而非将其吸入。麻醉充分的标志是小鼠出现规律性口腔喘息，力度逐渐增强，频率约为每分钟50–60次喘息。仰卧小鼠的头部应在每次喘息时向前移动。麻醉不足的表现包括无喘息动作，或胡须、舌头或四肢出现任何活动。最佳操作实践是在接种时用移液器吸头压住舌头，以防吞咽。异氟烷过量可能导致小鼠死亡，必须避免。防止过量的一个经验法则是：在小鼠失去翻正反射所需时间的相同时长后，即将其移出异氟烷环境。例如，若小鼠失去翻正反射耗时10秒，则应在额外10秒后将其移出。由于在连续处理多只小鼠过程中异氟烷气体会逐渐逸散，该时间间隔可能需要适当延长。在我们的操作中，无需补充异氟烷即可处理6–8只小鼠。
本方案的组分存在一些局限性。接种过程采用悬浮于25 µL液体PBS培养基中的孢子，与气溶胶化孢子接种相比，其生理相关性较低。目前尚不清楚吸入液体是否会影响孢子/颗粒在体内的定位，而与其他接种方法（如吸入空气中孢子）相比可能存在差异。然而，气溶胶吸入需要大量资源投入，并存在其他局限性（如接种剂量有限、暴露程度不一致、职业暴露风险等），这些因素可能因研究性质和实验室环境的不同而不尽理想。本方案的另一局限性在于冷冻切片过程中可能出现组织脆弱的问题，这可能是由于组织中存在气体，或与经气管固定相比血管灌注固定的效率降低所致。此类冷冻切片脆弱性可通过切取较厚的切片（60–100 µm）并利用共聚焦显微镜对组织内部的二维（2D）平面进行成像来克服。
我们认为，该方法的简便性和适应性将使其他研究团队能够将其应用于各自选定的吸入性病原体及感兴趣的宿主反应研究中。

人类每天可能从多种环境真菌中吸入多达数十亿个孢子1。为了理解我们对这些吸入孢子的屏障防御机制，必须明确这些孢子在气道和肺实质内沉降所处的精确微解剖环境。气道的细胞组成（即上皮细胞）在气管、支气管、细支气管和肺泡中存在显著差异。这些不同区域各自含有功能各异的细胞类型，共同构成一系列防御机制，以防止病理性感染的发生。
肺部真菌孢子沉积的精确位置可能因柱状上皮衬覆的细支气管、肺泡管或肺泡的管腔而异2。大多数具有临床意义的真菌种类产生的孢子直径在1 µm至10 µm之间3。这些孢子颗粒在肺内的沉积取决于多种因素，例如空气动力学特性、密度、电荷以及趋性力，这些因素均可影响吸入后沉降的机制4。通常，较大颗粒（&#62; 6 µm）沉积于上呼吸道，中等大小颗粒（2–6 µm）可沉积于较小气道，而较小颗粒（&#60;2 µm）则可到达肺泡区域5。Aspergillus孢子（2–3 µm）已被证实可进入肺泡腔，但临床病理报告也表明支气管和细支气管疾病负担显著6。随着可弯曲支气管镜检查的日益普及，人们也逐渐认识到由Aspergillus fumigatus、Coccidioides immitis、Candida属、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum以及接合菌（Zygomycetes）引起的支气管内真菌感染7。近年来对小鼠Aspergillus感染的显微成像研究还发现，较近端的气道空间（如支气管和细支气管）可能是病理性真菌增殖负担最重的部位8。关于宿主对肺部真菌感染免疫应答的研究表明，细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞均作为免疫哨兵发挥重要作用，因此阐明孢子沉积的确切部位及其与上皮细胞的相互作用，对未来的研究至关重要2,9,10。
研究这些近端气道的发病机制动态十分困难，因为标准的肺组织固定和切片制备技术可能会使孢子从上皮衬覆气道的近端位置发生移位，并将其推向远端终末肺泡区域。通常，使用10%福尔马林或4%多聚甲醛对肺进行膨胀，以使整个肺组织迅速接触固定剂。在为冷冻切片制备肺组织时，一些研究团队会向肺内注入最佳切割温度（OCT）包埋剂，以改善冷冻切片效果11。这些方法在适当的情境下具有实用性，但本实验室及其他研究团队发现，这些操作会导致孢子和颗粒从近端位置移位，从而干扰对暴露于孢子的细胞类型及其后续宿主反应的准确判断12。
为准确建立吸入性真菌孢子的微解剖定位，我们开发了一种快速且低资源消耗的小鼠气道内真菌孢子定位保存方法。该方法改编自 Thomas 等人（2021）报道的小鼠气道膨胀血管灌注固定法，通过减少所需设备、操作时间和技术难度，实现了满意的固定效果13根据本文所述方法，我们观察到 球孢子菌 posadasii cts2/ard1/cts3Δ 关节孢子（大小为 3–5 µm）的积聚位置比先前报道的更靠近近端，主要位于远端细支气管及支气管肺泡交界处，而非终末肺泡。这一信息可为&#160;与肺部这些区域相关的关键细胞类型及其对吸入性真菌孢子早期反应的影响所涉及的生物学问题。

<table><tbody><tr><td>18 G，1 1/2 英寸针头（305185）</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&amp;nbsp; 螺口瓶&amp;nbsp; （Nalgene）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite 非无菌大容量注射器 10 mL 鲁尔锁</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>亚甲基蓝注射液（赛拉嗪无菌溶液）</td><td>阿克恩</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>无动物源性封闭剂与稀释液，即用型</td><td>载体</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard 带翼保护型静脉导管，含 BD Vialon 导管材料，18 G × 1.88 英寸</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）&amp;trade;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA 染料</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&amp;Delta;&amp;nbsp;</td><td>BEI 资源</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 微米细胞筛</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 单克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International 皮下注射针 30 G × 1/2&quot;</td><td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性无菌注射器（1 mL，鲁尔接头）</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖一水合物</td><td>Azer Scientific&amp;nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 20 mM（5 mL）</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>德克拉</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES® 细致任务擦拭纸（4.4'' x 8.4''）&quot;)</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer 婴儿剪刀</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>微型阿德森镊子</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林（10%）（Azer Scientific）</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 细胞培养瓶，T75，带滤膜瓶盖</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 包埋模具</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 软件</td><td>开源</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr><tr><td>3/0 规格的丝线缝合线</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>载玻片 微型载玻片 Superfrost Plus&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set 抗荧光淬灭封片剂（2 mL）</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 化合物，Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605.AP</td><td></td></tr><tr><td>Vector Laboratories ImmEDGE 疏水屏障笔套装（2 支装）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR 微型盖玻片，矩形（24 mm × 40 mm，#1.5）</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>白色塑料网状物</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 AxioScan 7&amp;nbsp;</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>多通道荧光显微镜</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 软件</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>显微镜软件</td></tr></tbody></table>

一种高效成像小鼠肺部的方法，可保留气道内真菌孢子的空间动态

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

当环境中的孢子被吸入肺部时，真菌可感染人类。肺是一种具有异质性的器官。传导性气道（包括支气管和细支气管）不断分支，最终终止于进行气体交换的肺泡腔。起源于细支气管或肺泡的感染会引发不同的宿主反应和疾病表现。因此，明确了解孢子在肺内自然定植的具体位置（尤其是在感染初期），有助于拓展对宿主-病原体相互作用的研究。本文中，我们详细描述了感染了Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子的小鼠肺组织的原位分析方法。传统的组织学保存方法通常使用固定液对气道进行液体灌注，但这种方法会改变吸入性真菌颗粒的原始位置，使孢子从近端细支气管被推挤至终末气腔。
相反，这种结合空气膨胀与血管灌注固定的染色方法可保持真菌孢子在细支气管内的生理位置。此外，我们介绍了一种简单的方法，用于肺组织样本的冷冻保存、包埋和成像。我们还通过开源的 QuPath 程序分享了高通量的计算技术，用于分析肺内真菌孢子的空间分布。本文所述方法简便快捷，所需设备极少，且可轻松适用于多种呼吸道真菌感染模型。

该方法最终通过生理状态下的空气膨胀来制备小鼠肺组织的免疫荧光图像，从而保持气道不受干扰。重要的是，整个过程中设置有多个关键质控节点，用于确认实验方案的各个步骤已成功完成。在接种过程中，需通过触诊小鼠背部胸壁是否存在“爆裂音”来确认接种物是否已被吸入气道，该体征表明液体已进入气道。若未感觉到爆裂音，则小鼠可能已将接种物吞咽。用PBS灌注小鼠肺组织时，肺部应先出现白色斑驳状改变，随后整个肺组织完全变白（图2A）。若肺组织未完全变白，则后续的甲醛灌注将无法到达肺实质的所有区域（图2B）。在用空气膨胀肺组织时，肺应缓慢扩张，直至达到生理大小。在结扎气管缝线以锁住肺内空气后，肺的体积不应发生回缩。若出现回缩，则提示肺组织可能在操作过程中被刺穿。
此处展示了经标记的Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ孢子（绿色）和EpCAM+柱状细支气管上皮（品红色）在经空气膨胀和经福尔马林液体膨胀肺组织中的代表性图像（分别为图3A、B）。这些孢子主要积聚在远端细支气管内以及紧邻这些远端细支气管的肺泡腔中，可能位于肺泡导管内。经空气膨胀并灌注固定剂的肺组织中，孢子更多出现在细支气管内部，并且更靠近细支气管聚集（图3A）；而在液体固定剂处理的样本中，孢子则表现出略为分散，距离细支气管上皮稍远（图3B）。通过QuPath空间分析，我们测量了各个孢子到最近EpCAM+细支气管上皮的距离，以反映孢子从细支气管向更远端肺泡腔扩散的程度。结果显示，与生理状态下的空气膨胀相比，液体膨胀使孢子更远离细支气管（图4A、B）。采用空气膨胀结合血管灌注固定的方法，能够保留这些孢子在远端细支气管内的自然分布位置，避免因经气管灌注固定剂而导致孢子人为地扩散至更远端的肺泡腔中。
<img alt="肺解剖，保存标本对比，解剖学研究，教学图示" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：肺灌注成功指示。 （A）成功灌注的肺组织将完全呈白色。（B）灌注不完全的肺组织则呈现粉红色或斑驳外观。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构的荧光显微镜图像；显微照片显示蛋白质定位模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：空气膨胀甲醛灌注肺与甲醛膨胀肺中孢子分布的代表性图像。 在多通道荧光显微镜下以20倍放大倍数获取小鼠左肺叶后表面深度为1.2 mm的组织切片图像，并使用显微镜软件拼接图块。结果显示，在（A）空气膨胀肺中，细胞内荧光孢子（绿色）较（B）甲醛膨胀肺更接近EpCAM+细支气管上皮（洋红色）。比例尺 = 800 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="支气管上皮距离分析；比较空气和液体固定剂的柱状图与散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：空气膨胀与福尔马林膨胀的孢子处理肺组织中，孢子至支气管上皮距离（mm）的比较。 每组3只小鼠的肺组织在接种1 × 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子后1.5小时采集、处理并成像。每只小鼠在左肺叶后表面0.8 mm、1.2 mm、1.6 mm和2.0 mm处取四个切片，染色后在多通道荧光显微镜下成像。使用QuPath对每组所有孢子进行检测和空间分析，以确定（A）至最近EpCAM+柱状支气管上皮的距离，以及（B）以微米为单位显示的中位数和95%置信区间。空气膨胀组孢子数n = 11,673；液体膨胀组孢子数n = 9,837。由于数据不符合正态分布，采用Mann-Whitney t检验，p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种真菌致病模型方法，该方法可保持真菌孢子在肺部气道中的自然定位，以便通过荧光显微镜进行分析。

真菌感染人类时，环境中的孢子会被吸入肺部。肺是一个具有异质性的器官。传导性气道包括支气管和……

本研究旨在建立一种高效的小鼠肺部感染模型中保存气道内容物的实验方案。我们正在开发一种技术，以解答吸入的真菌孢子在肺内具体定植位置的问题。近年来，许多研究团队已发现多种气道上皮细胞在感知感染并启动保护性免疫反应中发挥重要作用。这些上皮细胞从支气管中的克拉拉细胞到终末肺泡中的II型上皮细胞不等。常规的肺组织制备技术是用液体固定液灌注肺部，以保存肺组织用于后续的组织学分析。然而，该技术会置换气道内容物，例如吸入的真菌孢子。本方案通过气道充气及血管灌注实现肺部的适当膨胀和固定，在保持肺组织正常形态的同时，保留吸入的真菌孢子在肺内的自然分布位置。我们希望利用该方案来表征在本模型中孢子着陆的支气管-肺泡交界区域，并通过分析孢子在不同上皮细胞附近的分布位置，研究由此引发的免疫应答。首先，在30摄氏度条件下，用5 µM浓度的CFSE对一乘以十的六次方个球孢子菌（Coccidioides posadasii）孢子染色30分钟。染色后，用 PBS 洗涤孢子。在 12,000 g 条件下离心孢子，并将沉淀重悬于 25 µL PBS 中，制备适当浓度的孢子接种液。用移液器吸取 25 µL 孢子接种液备用。将小鼠置于Nalgene容器中麻醉后，用一只手将其呈仰卧位固定，并使其进行3至5次规律的喘息呼吸。将移液器吸头置于小鼠口咽后部，并在小鼠吸气时释放接种物。用手和拇指触诊小鼠胸廓的背侧与腹侧，感知爆裂音，以确认接种物已被吸入。用70%乙醇喷洒深度麻醉的小鼠。使用剪刀小心剪开小鼠皮肤，然后将其拉开以暴露腹膜。接着，将上半身的皮肤向小鼠头部方向翻卷，使前肢脱离皮肤。现在，在胸骨处及肋骨下缘沿腹膜膜进行剪切，暴露腹膜。将肝脏向下移位以显露膈肌。使用剪刀在远离肺实质的位置小心刺破膈肌。接着，在左侧肋骨处剪开以暴露心脏。使用30号针头，向右心室注入5至10毫升PBS。拔出针头后，换用新针头向右心室注入5毫升10%中性缓冲福尔马林。使用剪刀切除肋骨前半部分。为暴露气管，从颈部左右两侧剪断上方的肋骨和锁骨，注意避开位于中线的气管。用镊子夹住靠近颈部中线处残留的上部肋骨和锁骨，并向上牵拉，直至气管暴露。 准备一根10厘米的缝合线，将其从气管下方穿过。在暴露的气管下端预先打一个松结。然后，准备一支装有空气的1毫升注射器，并连接18号导管针。使用18号针头在暴露区域的气管上端穿一个孔。然后将导管插入孔中，确保紧密贴合，以防止空气泄漏。接着，在10秒内缓慢向肺部注入1毫升空气，观察各肺叶是否充分膨胀。完全膨胀后，肺会轻微包裹心脏，并充满未穿刺膈肌所占据的体积。将肺从大鼠体内分离后，将其置于装有20毫升10%中性缓冲福尔马林的50毫升锥形管顶部边缘。将缝合线置于管外，然后拧紧管盖。首先，用 PBS 冲洗分离的小鼠肺组织，然后将其置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，在 4 摄氏度下保存 72 至 96 小时。随后，去除多余组织，将肺组织放入包埋模具（Cryomold）中，并加入 OCT 包埋剂。将样本在 -80 摄氏度下冷冻。在切片前，将包埋于OCT中的组织样本在-20摄氏度下平衡1小时，然后将组织块切成20至100微米厚度。将切片收集到载玻片上，室温干燥30分钟至1小时。将载玻片置于室温的PBS溶液中浸泡30分钟，以去除组织中的OCT包埋剂。然后，用擦拭纸清除组织样本周围载玻片边缘的多余液滴。使用疏水性PAP笔在载玻片上的样本周围画一圈边界，室温下静置干燥5分钟。接着，向载玻片上加入300 µL新配制的无动物成分封闭液，在室温下孵育。现在，将载玻片置于300微升Alexa Fluor 647标记的鼠抗小鼠EpCAM一抗溶液中，在4摄氏度下孵育过夜。次日，移除抗体溶液，并用300微升PBS洗涤载玻片两次，每次5分钟。干燥后，向每份组织滴加一滴室温的Soft-Set SlowFade封片介质。将盖玻片覆盖在组织上，确保其边缘超出样本及疏水性标记的边界。首先，将接种真菌孢子并经免疫荧光染色的小鼠肺组织切片置于多通道荧光显微镜下，选择合适的物镜。为完整捕获整个肺叶，需采集足够的图像平铺并进行拼接。使用显微镜的软件导出整个肺叶的图像，用于后续处理。在 QuPath 中创建项目文件，并将荧光图像添加到该文件中。通过依次选择“分类”、“像素分类”和“创建阈值器”，将 EpCAM 阳性像素分类为上皮组织。选择分辨率、通道、平滑sigma值和阈值以识别目标区域。将分类器保存为唯一的名称，然后选择“创建对象”。在新出现的“创建对象”窗口中，选择“新对象类型”为“注释”。对于肺上皮，将最小对象大小和最小孔洞大小均设置为100平方微米。选择“确定”后，将生成标注，并可使用画笔工具进行修改。要对孢子进行分类，请重复肺上皮标注演示的步骤。然后，在“创建对象”窗口中，选择“检测”作为新对象类型。将最小对象大小和最小孔洞大小均设置为0平方微米，并选择“分割对象”。接下来，为了对孢子进行连续的空间分析，依次选择“分析”、“空间分析”和“计算二维标注的有符号距离”。将计算每个检测到的孢子到 EpCAM 阳性上皮的距离。最后，单击“测量”，然后单击“导出测量结果”以导出数据。球孢子菌（Coccidioides posadasii）的孢子主要聚集在充气肺组织的远端支气管及邻近的肺泡腔内。与充气肺相比，甲醛固定和液体充盈肺中的孢子在支气管远处分布更为弥散。与生理状态下的空气充盈肺相比，液体充盈肺中孢子与EpCAM阳性细支气管上皮之间的距离更大，表明孢子分布更为分散。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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