一种高效成像小鼠肺部的方法，可保留气道内真菌孢子的空间动态

本研究旨在建立一种高效的小鼠肺部感染模型中保存气道内容物的实验方案。我们正在开发一种技术，以解答吸入的真菌孢子在肺内具体定植位置的问题。近年来，许多研究团队已发现多种气道上皮细胞在感知感染并启动保护性免疫反应中发挥重要作用。

这些上皮细胞从支气管中的克拉拉细胞到终末肺泡中的II型上皮细胞不等。常规的肺组织制备技术是用液体固定液灌注肺部，以保存肺组织用于后续的组织学分析。然而，该技术会置换气道内容物，例如吸入的真菌孢子。

本方案通过气道充气及血管灌注实现肺部的适当膨胀和固定，在保持肺组织正常形态的同时，保留吸入的真菌孢子在肺内的自然分布位置。我们希望利用该方案来表征在本模型中孢子着陆的支气管-肺泡交界区域，并通过分析孢子在不同上皮细胞附近的分布位置，研究由此引发的免疫应答。首先，在30摄氏度条件下，用5 µM浓度的CFSE对一乘以十的六次方个球孢子菌（Coccidioides posadasii）孢子染色30分钟。

染色后，用 PBS 洗涤孢子。在 12,000 g 条件下离心孢子，并将沉淀重悬于 25 µL PBS 中，制备适当浓度的孢子接种液。用移液器吸取 25 µL 孢子接种液备用。

将小鼠置于Nalgene容器中麻醉后，用一只手将其呈仰卧位固定，并使其进行3至5次规律的喘息呼吸。将移液器吸头置于小鼠口咽后部，并在小鼠吸气时释放接种物。用手和拇指触诊小鼠胸廓的背侧与腹侧，感知爆裂音，以确认接种物已被吸入。

用70%乙醇喷洒深度麻醉的小鼠。使用剪刀小心剪开小鼠皮肤，然后将其拉开以暴露腹膜。接着，将上半身的皮肤向小鼠头部方向翻卷，使前肢脱离皮肤。

现在，在胸骨处及肋骨下缘沿腹膜膜进行剪切，暴露腹膜。将肝脏向下移位以显露膈肌。使用剪刀在远离肺实质的位置小心刺破膈肌。

接着，在左侧肋骨处剪开以暴露心脏。使用30号针头，向右心室注入5至10毫升PBS。拔出针头后，换用新针头向右心室注入5毫升10%中性缓冲福尔马林。

使用剪刀切除肋骨前半部分。为暴露气管，从颈部左右两侧剪断上方的肋骨和锁骨，注意避开位于中线的气管。用镊子夹住靠近颈部中线处残留的上部肋骨和锁骨，并向上牵拉，直至气管暴露。

准备一根10厘米的缝合线，将其从气管下方穿过。在暴露的气管下端预先打一个松结。然后，准备一支装有空气的1毫升注射器，并连接18号导管针。

使用18号针头在暴露区域的气管上端穿一个孔。然后将导管插入孔中，确保紧密贴合，以防止空气泄漏。接着，在10秒内缓慢向肺部注入1毫升空气，观察各肺叶是否充分膨胀。

完全膨胀后，肺会轻微包裹心脏，并充满未穿刺膈肌所占据的体积。将肺从大鼠体内分离后，将其置于装有20毫升10%中性缓冲福尔马林的50毫升锥形管顶部边缘。将缝合线置于管外，然后拧紧管盖。

首先，用 PBS 冲洗分离的小鼠肺组织，然后将其置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，在 4 摄氏度下保存 72 至 96 小时。随后，去除多余组织，将肺组织放入包埋模具（Cryomold）中，并加入 OCT 包埋剂。将样本在 -80 摄氏度下冷冻。

在切片前，将包埋于OCT中的组织样本在-20摄氏度下平衡1小时，然后将组织块切成20至100微米厚度。将切片收集到载玻片上，室温干燥30分钟至1小时。将载玻片置于室温的PBS溶液中浸泡30分钟，以去除组织中的OCT包埋剂。

然后，用擦拭纸清除组织样本周围载玻片边缘的多余液滴。使用疏水性PAP笔在载玻片上的样本周围画一圈边界，室温下静置干燥5分钟。接着，向载玻片上加入300 µL新配制的无动物成分封闭液，在室温下孵育。

现在，将载玻片置于300微升Alexa Fluor 647标记的鼠抗小鼠EpCAM一抗溶液中，在4摄氏度下孵育过夜。次日，移除抗体溶液，并用300微升PBS洗涤载玻片两次，每次5分钟。干燥后，向每份组织滴加一滴室温的Soft-Set SlowFade封片介质。

将盖玻片覆盖在组织上，确保其边缘超出样本及疏水性标记的边界。首先，将接种真菌孢子并经免疫荧光染色的小鼠肺组织切片置于多通道荧光显微镜下，选择合适的物镜。为完整捕获整个肺叶，需采集足够的图像平铺并进行拼接。

使用显微镜的软件导出整个肺叶的图像，用于后续处理。在 QuPath 中创建项目文件，并将荧光图像添加到该文件中。通过依次选择“分类”、“像素分类”和“创建阈值器”，将 EpCAM 阳性像素分类为上皮组织。

选择分辨率、通道、平滑sigma值和阈值以识别目标区域。将分类器保存为唯一的名称，然后选择“创建对象”。在新出现的“创建对象”窗口中，选择“新对象类型”为“注释”。

对于肺上皮，将最小对象大小和最小孔洞大小均设置为100平方微米。选择“确定”后，将生成标注，并可使用画笔工具进行修改。要对孢子进行分类，请重复肺上皮标注演示的步骤。

然后，在“创建对象”窗口中，选择“检测”作为新对象类型。将最小对象大小和最小孔洞大小均设置为0平方微米，并选择“分割对象”。接下来，为了对孢子进行连续的空间分析，依次选择“分析”、“空间分析”和“计算二维标注的有符号距离”。

将计算每个检测到的孢子到 EpCAM 阳性上皮的距离。最后，单击“测量”，然后单击“导出测量结果”以导出数据。球孢子菌（Coccidioides posadasii）的孢子主要聚集在充气肺组织的远端支气管及邻近的肺泡腔内。

与充气肺相比，甲醛固定和液体充盈肺中的孢子在支气管远处分布更为弥散。与生理状态下的空气充盈肺相比，液体充盈肺中孢子与EpCAM阳性细支气管上皮之间的距离更大，表明孢子分布更为分散。