细粒棘球蚴小细胞外囊泡的分离和树突状细胞摄取

我们的研究重点是细粒棘球绦虫细胞外囊泡的表征及其在寄生虫-宿主相互作用中的作用。我们研究了宿主树突状细胞对成分的摄取以及对免疫调节的潜在影响。我们证明 E. granulosus EV 被树突状细胞吸收，影响成熟和抗原呈递。我们还确定了EV货物中的关键免疫调节和抗原蛋白，这些蛋白可能影响寄生虫与宿主的相互作用和免疫反应。

我们的方案优化了体外寄生虫培养，以增强小EV的产生，并确保高质量的分离，并整合树突状细胞测定来研究免疫调节。它可以整体应用，也可以部分应用。我们未来的研究将探索颗粒肠杆菌 EV 对免疫反应的体内影响、它们作为疫苗成分的潜力，以及它们对树突状细胞、微噬细胞和这些细胞免疫模型的影响。

[旁白]首先，使用70%酒精清洁患有包虫病的安乐死小鼠的腹侧表面。使用剪刀和镊子手术打开腹膜腔以去除发育的后绦虫。然后，使用镊子将后绦虫肿块转移到无菌培养皿中。如果需要，使用镊子去除结缔组织，以将囊肿从后绦虫肿块中释放出来。用补充的PBS在4摄氏度下洗涤获得的后蛻虫。现在，使用所有必需的组分制备培养基，并通过倒置轻轻混合溶液。将五毫升制备的培养基转移到每个 Leighton 管中。将寄生虫加入培养基中，并在不更换培养基的情况下将试管在37摄氏度下孵育五天。从每个 Leighton 管中收集寄生虫培养基并将其转移到 15 毫升锥形管中。将收集的培养基在4摄氏度下以300g离心10分钟，并将上清液转移到新的15毫升锥形管中。现在，将上清液以 2,000g 离心，在 4 摄氏度下离心 10 分钟。使用移液器将所得上清液转移到新的 1.5 毫升管中。将试管以 10,000g 在 4 摄氏度下离心 30 分钟，以去除较小的细胞碎片。使用移液器，将上清液转移到适合超速离心机转子的管中。用记号笔标记管子的一侧。并将管子放入转子中，标记面朝上。将试管以 100,000g 在 4 摄氏度下离心一小时。快速倒出上清液，让管子倒置一分钟。用至少三毫升PBS洗涤沉淀以去除污染蛋白质。使用移液器沿着所有管面多次重悬沉淀，重点关注沉淀预期所在的标记侧。重复超速离心后，将沉淀重悬于 30 微升 PBS 中。将重悬的样品转移到 1.5 毫升管中，并将细胞外囊泡冷冻在零下 80 摄氏度下储存。在将其放入组织培养罩之前，用乙醇喷洒安乐死的五至八周龄雌性CF-1小鼠。将鼠标以仰卧位放在解剖板上。使用镊子和解剖剪刀，在尿道上方做一个垂直的 T 形切口，然后水平延伸到下肢顶部。使用镊子沿着两个后肢分离皮肤，露出腿骨和组织。用手从脚踝向腹部推后，去除每条腿的皮肤，将皮肤拉到另一侧，使双腿没有皮肤。现在，使用剪刀和镊子小心地取出股骨和胫骨，确保不会断裂。用镊子固定每块骨头的尖端。并切断肌腱以去除骨骼周围的肌肉筋膜。用餐巾纸彻底清洁肌肉组织。将每块取出的骨头放入含有两毫升补充的完全RPMI培养基的无菌50毫升管中，以去除碎屑。丢弃培养基后，用70%乙醇洗骨两次，每次五分钟。将洗净的骨头转移到无菌培养皿中，并使用锋利的解剖剪刀切掉两骨骨骺以进入骨髓细胞。使用连接到含有完全培养基的 20 毫升注射器的 25 号针头，小心地将四块骨头中的每块骨头中的骨髓细胞冲洗到无菌培养皿中。然后，通过移液轻轻均质含有逃避骨髓的培养基，以去除骨结缔组织和细胞块。将样品转移到无菌的 50 毫升锥形管中，将细胞通过无菌的 70 微米聚丙烯细胞过滤器，以去除结缔组织和骨碎片。将细胞以 450g 在 4 摄氏度下离心 7 分钟。 小心地取出并丢弃上清液，确保沉淀保持粘附在管壁上。将细胞在室温下孵育一分钟后，将其重悬于 500 微升红细胞裂解缓冲液中，并用三毫升完全培养基中和裂解缓冲液。将细胞以 450g 在 4 摄氏度下离心 7 分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于五毫升完全培养基中。如图所示过滤样品后，使用血细胞计数器计数细胞。向培养基中加入每毫升300纳克重组小鼠FMS相关酪氨酸激酶三配体或FLT3L。将细胞接种在多孔板中，浓度为10乘以每毫升6个细胞的幂。将细胞在37摄氏度下在含有5%二氧化碳的加湿气氛中孵育7天。在第三天，在不干扰细胞的情况下从每个孔中取出一毫升培养基，并用一毫升预热的新鲜完全培养基代替，并补充每毫升150纳克的重组小鼠FLT3L。从细粒棘球绦虫幼虫阶段纯化的细胞外囊泡或EV主要是大小在50至200纳米之间的小型EV，通过动态光散射和透射电子显微镜得到证实。骨髓来源的树突状细胞在 7 天内表现出形态分化，从小而圆的造血细胞进展为具有细胞质延伸的星状细胞。孵育一小时后，树突状细胞捕获荧光标记的小EV，这些EV与MHCIII分子共定位在内体-溶酶体区室中，经共聚焦显微镜证实。