Name: 使用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程肺 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 了解使用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞进行肺生物工程的标准化方案。该方法通过去细胞化和再细胞化技术优化器官移植研究，为可扩展和可重复的器官生物工程提供实验框架。

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本研究获得了科学研究费补助金（KAKENHI）(C) #20K09174、#23K08308，促进国际共同研究基金（培育国际共同研究（B））#22KK0132（TS），日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 21K08877（TW），Leave a Nest 公司池田理香奖（FT），以及 JSPS 研究生奖学金 #21J21515（FT）的资助。我们非常感谢东北大学医学研究科生物医学研究核心的技术人员上田舞子女士在组织学观察方面的大量工作。同时，我们也感谢东北大学综合研究机构（IDAC）研究仪器中心的吉田由美女士和梶浩二先生在图像处理方面提供的技术支持。

所有实验均遵循东北大学动物实验及相关活动管理条例（15th （第X版），由东北大学出版23本研究已获得东北大学机构动物护理和使用委员会的批准（#2020AcA-041-01）。
1. 脱细胞材料的准备
<ol>
	<li>脱细胞溶液的制备（1 L 可高压灭菌玻璃瓶中的 1,000 mL 规格）
	<ol>
		<li>无菌去离子水：将1,000 mL蒸馏水或去离子水加入1 L可高压灭菌的玻璃瓶中，在121 °C下高压灭菌20 min。</li>
		<li>Triton X-100：在1 L可高压灭菌的玻璃瓶中，将1 mL Triton X-100加入1,000 mL无菌去离子水中。（可选）加入10 mL青霉素-链霉素溶液（终浓度为500 units/mL青霉素和500 µg/mL链霉素）。 
		注意：请勿进行高压灭菌。</li>
		<li>脱氧胆酸钠：将20 g脱氧胆酸钠粉末加入1 L可高压灭菌玻璃瓶中的1,000 mL无菌去离子水中。盖紧瓶盖并翻转瓶子以溶解粉末。（可选）加入10 mL青霉素-链霉素溶液。 
		注意：请勿进行高压灭菌。</li>
		<li>1 M NaCl：将58.44 g NaCl加入1,000 mL去离子水或蒸馏水中，置于1 L可高压灭菌玻璃瓶中。在121 °C条件下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>DNase I 储存液：用A型培养基稀释至10 mg/mL浓度。
		<ol>
			<li>溶液A：配制5 mM CaCl2 （5 mg 的 CaCl₂）2 在9 mL无菌去离子水中进行1:10稀释。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>DNase I 工作液：将 33 µL DNase I 储存液加入 10 mL 介质 B 中。
		<ol>
			<li>培养基B：配制10倍浓度的培养基B（155 mg MgSO₄）4 + 220 mg 的 CaCl2 在100 mL无菌去离子水中）并用无菌去离子水按1:10稀释。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺动脉（PA）和气管导管的制备（无菌操作）
	<ol>
		<li>将PA导管（大鼠颈静脉导管）剪成约15 mm的长度。</li>
		<li>将导管上的管套移至导管末端。</li>
		<li>将导管连接器插入肺动脉导管，并将其连接至注射器。已准备好的肺动脉导管如图所示。 图1A.</li>
		<li>将PA导管保存在70%乙醇中，直至使用。</li>
		<li>将20 G静脉导管截成约15 mm长度，用于制备气管导管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠心脏-肺组织块采集手术
	<ol>
		<li>安乐死一只雄性小鼠（C57BL/6，体重 &#62; 28 g）用过量的二氧化碳或异氟烷处死。</li>
		<li>将小鼠仰卧位固定于手术台上，并固定四肢。用70%乙醇喷洒胸部和腹部表面进行消毒。</li>
		<li>沿中线用不锈钢剪刀从腹部开口至颈部，用剪刀剪开胸骨。将膈肌从胸壁上切除，剪开腹侧胸壁以充分暴露胸腔，并移除胸腺。用4-0丝线结扎下腔静脉和右上腔静脉，以防止在步骤1.3.5中PBS反流，从而增强肺血管内血液的冲洗效果。</li>
		<li>用不锈钢剪刀剪断腹主动脉以进行引流。若腹主动脉难以辨认，可一并剪断下腔静脉和腹主动脉。</li>
		<li>用5 mL无菌注射器连接27 G针头，穿刺右心室壁，从右心室注入3 mL无菌PBS。</li>
		<li>使用Dumont镊子，以4-0丝线将主肺动脉打结。 
		注意：主肺动脉和升主动脉可一并套环。</li>
		<li>用弹簧剪在肺动脉瓣下方剪开右心室壁，形成一个2 mm的窗口。</li>
		<li>通过窗口插入肺动脉导管，并固定先前打结的4-0丝线（图1B). 
		注意：操作过程中避免触碰肺动脉（PA），以免损伤肺动脉壁。主肺动脉与升主动脉可一并结扎并固定。</li>
		<li>使用5 mL无菌注射器通过肺动脉导管缓慢注入2 mL PBS。注入过程中应确保双肺轻微膨胀。</li>
		<li>用气管导管插管气管，并用4-0丝线缝合固定图1C).</li>
		<li>通过气管导管，使用一支5 mL无菌空注射器缓慢注入2 mL空气，保持10秒。确保肺部无空气泄漏。</li>
		<li>取出心脏和肺 整块用Dumont镊子夹住气管，并在气管插管就位的情况下，切断颈段食管，并将其从椎体上分离。切断双侧锁骨下静脉和动脉。最后，在膈肌水平切断食管和下腔静脉。 
		注意：切勿用任何器械接触肺表面。轻微接触也可能导致漏气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠肺组织脱细胞（3天操作流程） 
	注意：第1.4节中的所有操作均应在洁净的生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>第1天
		<ol>
			<li>将切除的心肺组织块转移至直径10 cm的塑料培养皿中，并在4 °C下用无菌去离子水孵育1小时。</li>
			<li>通过气管导管用5 mL无菌注射器注入2 mL无菌去离子水，重复3次；再通过肺动脉导管注入2 mL无菌水。每次注射后暂停片刻，待液体随肺组织回缩而流出图1C). 
			注意：以大约 0.5 mL/s 的速度注射水。</li>
			<li>向气管导管注入 2 mL 0.1% Triton X-100 溶液，同时向肺动脉导管注入 2 mL 该溶液。</li>
			<li>将心肺组织块置于培养皿中，加入Triton X-100溶液，于4 °C静置孵育过夜。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第2天
		<ol>
			<li>按照步骤1.4.1.2所述，用无菌去离子水从肺组织中去除Triton X-100溶液。</li>
			<li>向气管导管中注入2 mL 2%脱氧胆酸钠溶液，同时向肺动脉导管中注入2 mL该溶液。在4 °C条件下于脱氧胆酸钠溶液中孵育24 h。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第3天
		<ol>
			<li>按照步骤1.4.1.2所述，用无菌去离子水从肺组织中去除脱氧胆酸钠溶液。</li>
			<li>向气管导管中注入2 mL 1 M NaCl溶液，向肺动脉导管中注入2 mL 1 M NaCl溶液。在室温下用NaCl溶液孵育1小时。</li>
			<li>按照步骤1.4.1.2所述，用无菌去离子水从NaCl溶液中去除。</li>
			<li>向气管导管内注入 2 mL DNAse I 工作液，向肺动脉导管内注入 2 mL DNAse I 工作液。室温下在 DNAse 工作液中孵育 1 小时。</li>
			<li>按照步骤1.4.1.2所述方法，用无菌PBS代替DNase溶液从肺组织中去除。脱细胞处理后，确认肺组织边缘呈白色且透明。 
			注意：随着脱细胞过程的进行，肺组织会变得更加脆弱。请始终小心操作心肺组织块，避免触碰肺表面。脱细胞完成后，心肺组织块可在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中于4 °C保存，最长可达3周。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人类原代细胞的培养
<ol>
	<li>将内皮细胞生长培养基-2（EGM2）与含有胎牛血清（终浓度 2%）、氢化可的松（终浓度 0.2 µg/mL）、人碱性成纤维细胞生长因子（终浓度 4 ng/mL）、血管内皮生长因子（终浓度 2 ng/mL）、R3-胰岛素样生长因子-1（终浓度 5 ng/mL）、抗坏血酸（终浓度 75 µg/mL）、人表皮生长因子（终浓度 10 ng/mL）、庆大霉素/两性霉素-1000（终浓度：庆大霉素 30 µg/mL，两性霉素 15 ng/mL）以及肝素（终浓度 1 ng/mL）的Bullet Kit混合。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中解冻冻存管中的 2 × 106 个人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。</li>
	<li>将细胞与 EGM2 混合于 15 mL 圆锥形离心管中，在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>计数细胞，并以适当的细胞密度进行传代培养（推荐密度为 2.0 × 104 个细胞/cm2）。起始使用 6 孔板培养，随后转移至 T75 培养瓶。</li>
	<li>持续传代细胞，直至获得所需数量的细胞。 
	注意：若使用 HUVECs 实现肺血管系统的完全覆盖，需要 3 × 107 个 HUVECs19。</li>
</ol>
3. 生物反应器设置与灌注式器官培养
<ol>
	<li>器官腔室和细胞储液罐的制备
	<ol>
		<li>使用打孔器在硅胶塞上打孔，如图2A所示。孔的直径分别为5 mm（i、ii和iii）以及7 mm（iv和v）。图2A中的每个孔编号（i-v）对应于图2B中的孔编号。</li>
		<li>按照图2B所示，将泵管穿过硅胶塞。</li>
		<li>使用打孔器在开顶螺口盖的硅胶隔垫上打一个5 mm的孔。将一段L/S 14铂固化管插入该孔中（图2B、C）。</li>
		<li>将上述材料（包括带管路的硅胶塞、玻璃罐体、带管路的GL-45螺口盖、250 mL可高压灭菌玻璃瓶，以及带鲁尔接头的L/S 14管路（图3A中的管路B和管路C））在121 °C条件下高压灭菌20分钟。选择合适的鲁尔接头，确保管路B和C形成回路。 
		注：玻璃罐体用作器官腔室，250 mL玻璃瓶用作细胞储液罐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于灌注的生物反应器回路组装 
	注：以下操作应在洁净工作台中进行。
	<ol>
		<li>向玻璃罐体中加入70 mL培养基，然后将硅胶塞盖在玻璃罐体上。</li>
		<li>使用三通旋塞，按照图3A所述，组装硅胶塞、玻璃罐体、带管路的GL-45螺口盖、250 mL可高压灭菌玻璃瓶，以及带鲁尔接头的L/S 14管路。将一根20 G针头插入GL-45螺口盖的硅胶隔垫中。</li>
		<li>使用连接至旋塞i）和iii）的10 mL注射器，向管路A、B和C中填充培养基（填充1 m管路约需3–5 mL培养基）。通过三通旋塞反复进行培养基的注入与抽出，确保管路内无气泡。</li>
		<li>通过连接至管路C的鲁尔接头，将去细胞化心肺组织块的肺动脉导管连接。避免导管或管路中产生气泡。</li>
		<li>收获HUVECs，并以0.5–1 × 106 cells/mL的密度重悬于EGM2培养基中。将步骤2.5中获得的细胞悬液加入细胞储液罐。 
		注：建议在步骤3.2.4和3.2.5之间制备细胞悬液。在细胞储液罐中放入搅拌子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重力驱动的内皮细胞灌注
	<ol>
		<li>将含有HUVECs的细胞储液罐置于磁力搅拌器上。确保细胞储液罐底部高于器官腔室30 cm（图2D和图3A）。</li>
		<li>开启磁力搅拌器，转速约为120 rpm。</li>
		<li>打开旋塞i）和ii），使细胞悬液通过管路A、管路C和肺动脉导管注入去细胞化支架中。 
		注：当以1 × 106 cells/mL的密度注入3 × 107个细胞时，细胞悬液体积应为30 mL。典型的灌注速率为1–2 mL/min。</li>
		<li>完成细胞悬液的全部注入后，将管路A从旋塞ii）上拆下。 
		注：此步骤可进行细胞计数，以测定去细胞化支架中的细胞滞留率。典型的细胞滞留率为80–90%，与注入细胞数量无关19。 
		&#8203;去细胞化肺支架的质量严格决定了细胞滞留率。任何来自去细胞化肺的泄漏（例如主肺动脉或肺表面）都会导致细胞滞留率降低。使用连接至灌注式生物反应器中任一旋塞的无菌注射器注入2–3 mL培养基，确认无明显泄漏，并观察到去细胞化肺在注入培养基时轻微膨胀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注器官培养
	<ol>
		<li>将器官腔室放入CO2培养箱中。</li>
		<li>将管路B固定在连接脉动泵的泵头上。</li>
		<li>关闭CO2培养箱的玻璃门。确保管路正确穿过玻璃门与橡胶密封圈之间（图3B）。</li>
		<li>在37 °C下孵育去细胞化支架3小时，使注入的内皮细胞在支架中沉降。 
		注：确保在步骤3.4.1至3.4.4之间脉动泵始终处于关闭状态。</li>
		<li>以6 rpm的速率启动泵，使用L/S 14管路可实现2 mL/min的培养基灌注。观察去细胞化肺在灌注过程中轻微膨胀。</li>
		<li>关闭培养箱门（图3C）。</li>
		<li>通过旋塞iii）更换培养基。每2或3天更换一半培养基。
		<ol>
			<li>停止泵运转，将50 mL无菌注射器连接至旋塞iii），从腔室中抽出50 mL培养基。</li>
			<li>用50 mL预热的培养基填充另一支50 mL无菌注射器，并通过旋塞iii）将培养基转移至腔室中。正确切换旋塞后，重新启动脉动泵。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在至少2天的灌注器官培养后，收获再细胞化的心肺组织块。 
		注：在本研究中，使用3 × 107个HUVECs进行2天的灌注培养，已足以实现去细胞化肺支架的均匀再血管化。当使用少于3 × 107个HUVECs时，可能需要更长的孵育时间以提高再细胞化效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生物工程肺的原位移植
<ol>
	<li>药物制备
	<ol>
		<li>使用临床级生理盐水配制MMB复合麻醉剂，混合咪达唑仑（终浓度4 mg/kg）、美托咪定（终浓度0.75 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（终浓度5 mg/kg）。</li>
		<li>通过将肝素与临床级生理盐水混合，配制终浓度为1000 U/mL的肝素溶液。</li>
		<li>将头孢唑林钠与临床级生理盐水混合配制（单次剂量，30 mg/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作步骤
	<ol>
		<li>袖带的制备
		<ol>
			<li>用细砂纸轻轻打磨三种类型的套管针，以利于血管保持袖状结构。</li>
			<li>使用#11手术刀，从20 G聚四氟乙烯（Teflon）套管针上截取一段长度为1 mm的支气管套管。在切割套管针前，用#11手术刀的刀背在套管针上压出凹痕，以便结扎10-0尼龙线。</li>
			<li>使用22 G特氟龙套管制备长度为0.8 mm的肺静脉（PV）套管，使用24 G特氟龙套管制备长度为0.6 mm的肺动脉（PA）套管。 
			注意：此步骤可在实验当天之前完成。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将袖带连接至生物工程肺
		<ol>
			<li>将心肺组织块置于用冷生理盐水浸湿的无菌纱布上，其下垫一块干燥洁净的纱布，并将培养皿放入装有洁净冰块的泡沫盒中。 
			注意：放置干燥纱布可防止心肺组织块意外冻结。</li>
			<li>放置动脉瘤夹以固定气管和纱布（图 4A). 将一小块纱布放在心脏上，同时覆盖右肺。在左肺上另放一块纱布。用湿润的纱布调整牵拉，尽可能清晰地暴露左肺门。</li>
			<li>使用直头或弯头显微镊，根据个人偏好小心分离肺门结构（图4B从肺韧带开始，沿迷走神经进行解剖。在肺静脉下方切开脏层胸膜，将降主动脉和迷走神经一同从左侧肺门后方向头侧移动。</li>
			<li>从肺动脉干解剖分离左主肺动脉，直至左肺边缘图4C然后，在肺动脉干水平切开肺动脉，以获得足够的长度。</li>
			<li>从左心房左侧切至左肺边缘处的左肺静脉图 4D在左心房水平离断左侧肺静脉，以获得足够的长度。</li>
			<li>使用稳定夹将PA套管悬置于肺动脉（PA）上方，并将肺动脉插入套管内（&#8203;图4E）。将肺动脉（PA）折叠至套管上，暴露内皮表面，用10-0尼龙线在套管周围固定图4F）。以相同方式将套管放置在门静脉（PV）上（图4G，H).</li>
			<li>在隆突水平离断左支气管。以相同方式将套囊放置于支气管上。图 4I).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>受体小鼠操作步骤
		<ol>
			<li>用 MMB 混合物经腹腔注射（27 G 针头）麻醉受体小鼠，并在显微镜下插入 20 G 聚氨酯血管导管进行气管插管。将受体小鼠置于可调节温度的电热垫上，呈右侧卧位，并将血管导管连接至呼吸机。呼吸机参数设置如下： 氧流量 2 L/min，呼吸频率 120 次/分，潮气量 0.5 mL用70%乙醇对胸壁进行消毒，并皮下注射头孢唑林混合液。</li>
			<li>用剪刀切开皮肤。使用电灼器切割皮下组织和肌肉。通过第3肋间切口打开胸腔rd 肋间隙并放置胸腔拉钩。 
			注意：尽管开胸切口需足够大以方便植入，但切勿损伤胸廓内动脉，以免引起大出血。</li>
			<li>用棉签和大型弹簧剪解剖肺韧带。将弯形动脉剥离器置于受体左肺，以便轻松牵拉肺组织。使用角形显微镊解剖左肺门周围的纵隔胸膜。 
			注意：胸膜解剖的基础与人体肺组织的解剖性肺切除相似。</li>
			<li>使用弯头显微镊从纵隔向左肺边缘仔细分离肺动脉与支气管图 5A以类似方式从肺静脉分离支气管。 
			注意：当在先前操作步骤（4.2.3.3）中已解剖胸膜时，解剖可更易进行。</li>
			<li>在肺动脉根部放置一个10-0丝线滑结以阻断（图5B）。在肺静脉（PV）和支气管根部放置一枚细长角度的动脉瘤夹（图5C).</li>
			<li>用10-0尼龙线环绕支气管、肺动脉和肺静脉，暂不打结，留待后续步骤中固定套管。</li>
			<li>使用微弹簧剪在受体左肺边缘处切开肺动脉（PA）、支气管和肺静脉（PV）图5D）。使用直显微镊子轻轻扩张肺动脉（PA）和肺静脉（PV）。用1 mL注射器和24 G套管针，以生理盐水冲洗肺动脉和肺静脉中的血液。 
			注意：肺动脉、支气管和肺静脉的切口约为管壁周长的三分之一。直型显微镊子操作轻柔，适用于扩张。</li>
			<li>将覆盖有湿润纱布的生物工程肺置于受体左肺上方（图5E尽可能靠近受体的纵隔。</li>
			<li>将供体肺动脉套管插入受体肺动脉（图5F). 
			注意：供体肺动脉会受到一定程度的牵拉。如果肺动脉切口大小合适，供体袖套便不易脱落。将生物工程肺移近纵隔也有助于防止供体袖套移位。</li>
			<li>用10-0尼龙线将袖带固定图 5G）。以类似方式，插入并固定供体支气管（图5H）以及PV套管（图5I，J).</li>
			<li>移除细角度动脉瘤夹（图5L观察到血液逆流超过PV袖带后，移除肺动脉上的丝线结扎，以恢复向前血流至生物工程肺。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者对本文稿无任何利益冲突。

器官生物工程是一项要求极高的事业。昂贵的筛选过程一直阻碍着该领域研究与开发的周期。通过使用小鼠作为实验平台，与先前使用的大鼠平台相比，显著减少了所需的空间、细胞和培养基用量。尽管目前尚未实现对气体交换、血管阻力或肺顺应性等详细物理参数的测量，但小鼠肺模型能够加快研究进程，因为它支持实验方案的快速迭代，并可用于测试细胞活力、细胞整合能力以及支架相互作用。小鼠繁殖迅速，且拥有大量基因修饰品系可供选择，为在活体条件下研究多种基因和细胞修饰提供了灵活性。这种快速验证假设并优化实验方案的能力，有助于加深我们对成功实现肺组织生物工程所必需的最佳细胞环境和培养技术的理解。通过在小鼠模型中不断完善技术，研究人员可以建立可扩展的方法和流程，进而推广至更大的动物模型，并最终应用于人类。
该操作的关键步骤是肺动脉导管的插入与固定。只有使用带尖端套环的小直径导管（&#60;3 Fr）才能实现肺动脉导管的固定。由于肺组织较为脆弱，手术过程中必须格外谨慎。任何金属器械均不得接触肺表面，否则将导致严重的漏气。必要时可使用棉签轻柔移动肺组织。作者认为，研究人员在使用10至15只小鼠进行训练后，即可熟练掌握插管操作...

肺移植已成为治疗终末期肺病患者的决定性疗法1，例如特发性肺纤维化，此类疾病使用药物治疗无法阻止呼吸功能的恶化。每年有更多符合条件的患者加入等待名单；然而，来自已故供体的器官捐献数量一直未能跟上等待移植患者人数的增长2,3。即使接受了肺移植，仍存在多种问题会损害移植肺的功能，包括原发性器官功能障碍、异体反应综合征以及感染，这些因素显著降低了肺移植受者的5年生存率4。
解决当前器官移植问题的多种方案包括利用边缘供体5，供体肺的复苏 离体 肺灌注系统6以及利用基因编辑猪进行的异种移植7这些替代方案可以扩大供体器官的来源，但均无法完全解决供体器官短缺、免疫原性及功能异质性等问题。
尽管距离现实尚远，但将患者特异性细胞整合到去细胞化动物器官支架中的生物工程人工器官，是实体器官移植的一个极具吸引力的潜在来源8。自2010年以来，已有数项开创性研究报道了生物工程肺的潜在应用价值9,10。在这些研究中，通过去污剂对大鼠或猪的肺进行去细胞化处理，然后经气管或肺血管注入动物或人类细胞，在基于灌注的生物反应器中再生肺组织，其中部分肺器官被原位移植到动物胸腔内11,12,13,14,15。然而，生物工程肺的结构与功能仍不成熟，可能原因是生物反应器中培养的细胞数量不足，或细胞间连接整合程度较低。
推动器官生物工程研究进展的一个障碍是缺乏小规模的实验平台。虽然大鼠或猪是该领域常用的实验动物，但每只肺需要&#62;108个肺细胞16，这对学术实验室而言成本极高。如果能将小鼠用于器官生物工程研究，我们将能够显著降低每次实验的成本，并加快研究进程。尽管小鼠肺与人类肺存在解剖学差异17，但哺乳动物肺的基本结构是相似的18。因此，小鼠规模实验的结果可通过按体重比例放大细胞数量，推广应用于更大的动物。
本方案旨在描述利用小鼠心肺组织块和人原代细胞进行肺生物工程的详细实验步骤19。本研究采用了此前已报道且广泛使用的小鼠肺脱细胞方案20,21,22。肺生物工程中的难点在于对脱细胞后毛细血管脉管系统的再细胞化20；因此，本方案将使用人脐静脉内皮细胞。

<table><tbody><tr><td>脱细胞化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td>或同等规格的 27 G 注射针头</td></tr><tr><td>BD Insyte 静脉导管 20 GA X 1.8 8 英寸</td><td>BD</td><td>381237</td><td>或同等规格的 20 G 静脉导管</td></tr><tr><td>丝线缝合线（4-0）</td><td>Nesco</td><td>GA04SB</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>大鼠颈静脉导管，PU 2Fr 10 cm</td><td>Instech</td><td>C20PU-MJV1301</td><td>推荐用于体重 30 g 及以下的小鼠。</td></tr><tr><td>大鼠颈静脉导管，PU 3Fr 10 cm</td><td>Instech</td><td>C30PU-RJV1307</td><td>推荐用于体重超过 30 g 的小鼠。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PinPort 注射器</td><td>Instech</td><td>PNP3M</td><td></td></tr><tr><td>PinPorts，22 G</td><td>Instech</td><td>PNP3F22-50</td><td>适配 C30PU-RJV1307</td></tr><tr><td>PinPorts，25 G</td><td>Instech</td><td>PNP3F25-50</td><td>适配 C20PU-MJV1301</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器，5 mL</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC &amp;ndash; 人脐静脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>C2519A</td><td></td></tr><tr><td>基于灌注的生物反应器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G 针头</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打孔器</td><td>通用</td><td></td><td>打孔尺寸：6–10 mm</td></tr><tr><td>EasyLoad III 泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>243934</td><td></td></tr><tr><td>玻璃罐</td><td>Hario</td><td>SCN-200T</td><td>内径：80 mm</td></tr><tr><td>加热磁力搅拌器</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9965-01</td><td>雌性接头，适配内径 1.5 mm 的管路（L/S 14）</td></tr><tr><td>鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9964-01</td><td>雄性接头，适配内径 1.5 mm 的管路（L/S 14）</td></tr><tr><td>鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9965-03</td><td>雌性接头，适配内径 3 mm 的管路（L/S 16）</td></tr><tr><td>鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9964-03</td><td>雄性接头，适配内径 3 mm 的管路（L/S 16）</td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 数字精密模块化驱动器，带远程 I/O 和台式控制器</td><td>Cole-Parmer</td><td>07557-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管，PharMed BPT 材质，L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>06508-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管，铂金固化硅胶材质，L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>96410-14</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 注射式滤器单元，0.22 &amp;micro;m，聚醚砜材质，33 mm，伽马射线灭菌</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 250 mL 玻璃瓶，GL-45 螺口盖</td><td>Corning</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>GL45 开口顶 PBT 螺口盖用硅胶垫片</td><td>Corning</td><td>1395-455S</td><td></td></tr><tr><td>硅胶光密封塞</td><td>IMG</td><td>07763-18</td><td>上端直径：87 mm，下端直径：75 mm</td></tr><tr><td>无菌注射器，10 mL，50 mL</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠手术（心脏-肺组织块分离 | 肺移植）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 尼龙结扎线</td><td>Kono Seisakusho</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>10-0 丝线结扎线</td><td>Kono Seisakusho</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>4-0 丝线结扎线</td><td>Kono Seisakusho</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>动脉夹，45 mm 弯型，带槽</td><td>Natsume Seisakusyo</td><td>C-17-45</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte 静脉导管 24GA</td><td>BD</td><td>381512</td><td>或同等规格的 24G 静脉导管</td></tr><tr><td>Bulldog 血管钳，45 mm 弯型</td><td>Natsume Seisakusyo</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸布托啡诺&amp;nbsp;</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林钠</td><td>Otsuka Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>1251-35</td><td></td></tr><tr><td>精细弹簧剪，Vannas 型</td><td>Fine Science Tools</td><td>15403-08</td><td>45&amp;deg; 尖端，0.01 x 0.06 mm</td></tr><tr><td>Gemini 电凝仪套装</td><td>Harvard Apparatus</td><td>RS-300</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito 止血钳，弯头，125 mm</td><td>Bioresearch Center</td><td>16181670</td><td></td></tr><tr><td>Hegar 持针器，150 mm</td><td>B Braun/Aesculap</td><td>BM065R</td><td></td></tr><tr><td>肝素溶液</td><td>Mochida Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>直头微型镊子</td><td>B Braun/Aesculap</td><td>BD33R</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Sandoz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>小动物呼吸机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 687&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水，临床级</td><td>Otsuka Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，60 x 15 mm</td><td>BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Safelet Cath PU 20 号聚氨酯导管</td><td>Nipro</td><td>09-031</td><td></td></tr><tr><td>Sakaki 不锈钢剪刀，弯型，14 cm</td><td>Bioresearch Center</td><td>64152034</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Bioresearch Center</td><td>16101040</td><td></td></tr><tr><td>小型动物牵开系统</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>备用刀片，手术刀 #11</td><td>Muranaka Medical Instruments</td><td>567-001-03</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪，15 cm</td><td>Bioresearch Center</td><td>PRI13-3736</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M525</td><td>建议使用带柔性臂系统的临床级手术显微镜。</td></tr><tr><td>Sugita 钛合金动脉瘤夹，弯型细窄，No.98</td><td>Mizuho Medical</td><td>17-001-98</td><td></td></tr><tr><td>Sugita 钛合金夹施加器，110 mm</td><td>Mizuho Medical</td><td>17-013-53</td><td></td></tr><tr><td>可调温电热保温装置</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超细棉签</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血管与支气管袖套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细砂纸</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Venula 20 号特氟龙血管导管</td><td>Top</td><td>1160</td><td></td></tr><tr><td>Venula 22 号特氟龙血管导管</td><td>Top</td><td>1161</td><td></td></tr><tr><td>Venula 24 号特氟龙血管导管</td><td>Top</td><td>1124</td><td></td></tr></tbody></table>

利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

肺移植是治疗特发性肺纤维化等终末期肺部疾病患者的关键疗法，但仍面临供体短缺和移植后并发症等挑战。通过将患者特异性细胞整合到脱细胞动物支架中构建的生物工程肺，提供了一种有前景的替代方案。尽管在动物模型中应用生物工程肺已取得进展，其功能和结构仍不够成熟。本方案旨在解决器官生物工程领域的一个关键障碍：缺乏一种经济高效的实验平台。通过采用小鼠模型而非大鼠或猪等较大的动物，研究人员可显著减少每次实验所需的资源，从而加快研究进程。
该方案详细阐述了利用小鼠心肺组织块和人原代细胞进行肺脏生物工程的实验流程，重点包括小鼠心肺组织块的分离策略、脱细胞处理、生物反应器的构建、基于灌注的器官培养以及生物工程化肺脏的原位移植。该适用于小鼠规模的研究平台不仅可降低实验成本，还为优化再细胞化过程中细胞类型与数量的选择、利用组织学和分子生物学方法检测不同细胞类型的效果，以及确保移植后血流灌注的可行性提供了有效框架。该方法具有广泛的应用潜力，可用于研究三维培养条件下的细胞间相互作用、细胞与基质间的相互作用等 离体 癌症建模，从而推动器官生物工程领域的发展。

按照脱细胞化方案处理后，小鼠肺组织在外观上呈现白色且半透明（图6A）。组织学观察显示，细胞成分应被完全去除，但肺泡结构仍保持完整（图6B、C）。使用3 × 107个HUVECs并通过为期2天的灌注式生物反应器培养对小鼠肺进行再细胞化后，HUVECs在肺组织中呈均匀分布（图7A）。HUVECs迁移至外周肺泡区域，形成毛细血管网络（图7B）。生物工程肺原位移植并恢复血流灌注后，可在生物工程肺内均匀观察到含有红细胞的血流（图8A、B）。
<img alt="手术插管过程；示意图、导管装置、大鼠模型、心脏血管连接。" cl...

本文介绍了利用脱细胞和再细胞化方法构建生物工程小鼠肺脏的技术，同时详细描述了后续的原位肺移植过程。

肺移植是治疗特发性肺纤维化等终末期肺部疾病患者的关键疗法，但供体短缺等问题仍是重大挑战……

生物工程化构建人体尺寸的器官需要大量资源，这通常超出了学术实验室的承受能力。降低迭代性实验方案开发的成本将加速该领域的研究进展。本研究旨在提供一种利用小鼠心肺组织块进行肺脏生物工程化的标准化操作流程。目前尚不清楚哪些细胞适用于器官生物工程化，以及这些细胞应如何整合到器官生物反应器培养系统中。为了建立可扩展且可重复的实验方案，需要对多种类型的细胞及培养条件进行比较。小鼠体型小且易于操作，是常用的实验动物。然而，尽管其体型较小，哺乳动物肺部的基本结构具有相似性。通过在此小型平台上优化实验方案，我们只需根据动物体型按比例放大优化后的参数，即可将其扩展应用于其他激光动物模型。这种适用于小鼠肺部的生物工程平台，使研究人员能够高效地测试其干细胞。这些经过基因修饰的细胞在全肺工程中可能十分珍贵或成本较高。此外，还可利用患者来源的细胞在体外构建疾病模型。目前的研究工作包括测试多种类型的工程化干细胞和祖细胞，以确定肺部生物工程所需的增殖潜能和分化能力。一旦确定了合适的细胞类型，该研究将扩展到更大的动物模型，例如猪。[旁白] 首先，将已实施安乐死的小鼠仰卧位放置于手术台上，并固定四肢。用70%乙醇均匀喷洒胸部和腹部表面以进行消毒。接着，使用不锈钢剪刀沿中线切开腹腔并延伸至颈部，剪开胸骨。将膈肌从胸壁上分离。剪开胸骨前壁以暴露胸腔，并移除胸腺。使用4/0丝线结扎下腔静脉和右上腔静脉。用不锈钢剪刀剪断腹主动脉以进行引流。使用配备27号针头的5毫升无菌注射器，通过穿刺心室壁向右心室注入3毫升无菌PBS。用Dumont镊子将4/0丝线环绕主肺动脉打结。接着，使用弹簧剪在肺动脉瓣下方剪出一个2毫米的窗口，以进入右心室壁。将肺动脉导管经此窗口插入，并用预先打好的4/0丝线固定。使用5毫升注射器通过肺动脉导管缓慢注入2毫升PBS。将气管插管插入气管，并用4/0丝线结扎固定。现在，使用一个空的5毫升注射器通过气管插管缓慢注入2毫升空气。保持10秒，确保肺部无空气泄漏。取出心肺组织块。随后，将切除的心肺组织块转移至一个直径为10厘米的塑料培养皿中，其中盛有去离子水，用于肺组织的脱细胞处理。将组织块在4°C下孵育1小时。孵育结束后，使用5毫升注射器通过气管插管注入2毫升无菌去离子水，重复三次。每次注射后暂停片刻，使液体随肺组织回缩而排出。同样地，通过肺动脉导管注入2毫升水。向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升0.1% Triton X-100溶液。将心肺组织块转移至培养皿中，并在4°C下静置孵育Triton X-100溶液过夜。次日，为去除肺内残留的Triton X-100溶液，向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升去离子水，随后重复注入2毫升2%脱氧胆酸钠溶液。去除脱氧胆酸钠溶液后，向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升1摩尔氯化钠溶液。将心肺组织块孵育1小时。用去离子水去除氯化钠溶液后，向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升DNase I工作液。将心肺组织块继续孵育1小时。使用无菌PBS冲洗气管插管和肺动脉导管，以去除DNase I溶液。脱细胞完成后，确认肺组织边缘呈白色且透明。向玻璃容器中加入70毫升内皮细胞生长培养基2（EGM-2），然后盖上硅胶塞密封容器。将硅胶塞、玻璃容器、带管路的GL45螺口盖、250毫升可高压灭菌的玻璃瓶以及带鲁尔接头的L/S 14管路通过三通旋塞组装连接。将20号针头插入GL45螺口盖的硅胶隔膜中。使用连接在旋塞1和旋塞3上的10毫升注射器，向管路A、B和C中充满培养基。通过鲁尔接头将脱细胞后心肺组织块的肺动脉导管连接至管路C。确保导管和管路中无气泡存在。为实现内皮细胞的重力驱动灌注，将含有脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞储液罐置于磁力搅拌器上，并确保储液罐高于器官腔室30厘米。将磁力搅拌器调至120转/分钟并开启。打开旋塞1和旋塞2，使细胞悬液经由管路A、管路C和肺动脉导管流入脱细胞支架中。进行器官培养灌注时，将器官腔室放入二氧化碳培养箱中。将管路B连接至脉动泵的泵头。关闭培养箱玻璃门，确保管路正确地位于门与橡胶密封圈之间。将脱细胞支架在37°C下孵育3小时，使内皮细胞在支架内充分沉降。启动泵，设定转速为6转/分钟，通过L/S 14管路实现每分钟2毫升的培养基灌注。观察脱细胞肺组织因培养基灌注而轻微扩张。随后关闭培养箱门。进行换液操作时，先停止泵的运行。将一个50毫升无菌注射器连接至旋塞3，从腔室中抽出50毫升培养基。另取一个50毫升无菌注射器，装入50毫升预温的培养基。将该溶液注入玻璃容器中，并通过旋塞3将培养基转移至腔室，注意正确切换旋塞方向。重新启动脉动泵。在灌注培养两天后，收获再细胞化的心肺组织块。脱细胞后的小鼠肺组织呈现白色半透明状态，表明细胞成分已被清除，同时保留了整体肺结构。组织学分析显示，脱细胞小鼠肺组织中肺泡结构完整，无残留细胞成分。在灌注式生物反应器培养两天后，接种三次10的7次方个HUVECs的再细胞化小鼠肺组织中，HUVECs分布均匀。HUVECs迁移至外周肺泡区域，形成类似毛细血管的网络结构，这在再细胞化肺组织中可被观察到。

transplantation-bioengineered-lung-using-decellularized-mouse-lungs

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程肺

我们开发了一种去细胞化肺细胞外基质以及新型仿生生物反应器，可用于生成具有功能的肺组织。通过将细胞接种至基质中并在生物反应器中进行培养，所生成的组织在体内移植后短期内即表现出有效的气体交换功能。...

肺组织工程操作步骤

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。...

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

为了理解组织工程心脏瓣膜中新生组织形成和狭窄发展的细胞与分子机制，研究人员建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。采用异位心脏移植技术，将肺动脉瓣移植至受体动物体内。...

异位心脏移植小鼠模型中肺动脉瓣移植

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。...

在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

本文介绍一种制备功能性组织工程血管移植物的方案，该移植物可用于小鼠体内移植。该方法通过在脱细胞血管支架生物反应器上共接种部分诱导多能干细胞（PiPSC）来源的平滑肌细胞和PiPSC来源的内皮细胞来实现。...

在小鼠模型中组织工程血管的构建与移植

该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。...

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

本方案描述了一种通过使用肺泡上皮II型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新接种脱细胞化精密切割肺组织切片，以生成可重复且小规模工程化肺组织的方法。...

由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

本文中，从新生小鼠分离并培养了原代肺内皮细胞。...

原代小鼠肺内皮细胞的分离

本文介绍了一种分离区域性脱细胞肺组织的实验方案。该方案为研究细胞外基质的复杂性以及细胞与基质间的相互作用提供了有力的工具。...

区域特异性脱细胞肺组织的解剖与分离

本文介绍了一种利用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体成像的实验方案。该方法为实时研究小鼠肺移植后细胞动态变化及细胞间相互作用提供了有力工具。...

活体小鼠肺移植的双光子显微成像

了解使用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞进行肺生物工程的标准化方案。该方法通过去细胞化和再细胞化技术优化器官移植研究，为可扩展和可重复的器官生物工程提供实验框架。

利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

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