使用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程肺
2025年3月28日
本文介绍了如何使用脱细胞和再细胞化方法创建生物工程小鼠肺。它还详细介绍了随后的原位肺移植。
对人体大小的器官进行生物工程需要大量的资源，这往往超出了学术实验室的能力。降低迭代协议开发的成本将加速该领域的研究进展。本研究的目的是为使用小鼠心肺阻滞的肺生物工程提供标准化方案。目前尚不清楚哪些细胞适合器官生物工程，以及如何将这些细胞整合到器官生物反应器培养物中。需要比较多种类型的细胞和条件，以建立可扩展和可重复的方案。
小鼠是小型且易于处理的实验动物。然而，尽管它们很小，但肺的基本结构在哺乳动物中是相似的。通过在这个小平台上优化协议，我们可以通过简单地根据动物的大小将优化结果相乘来扩大激光动物模型。这个小鼠大小的肺生物工程平台使研究人员能够有效地测试他们的干细胞。这些转基因细胞用于全肺工程可能非常珍贵或昂贵。此外，患者来源的细胞还可用于在体外创建疾病模型。
目前的工作涉及测试多种类型的工程干细胞和祖细胞，以找出肺生物工程所需的增殖潜力和差异能力。一旦确定出合适的细胞，这项研究将扩展到更大的动物模型，例如猪。
[旁白]首先，将安乐死的小鼠仰卧放在手术台上，并固定四肢。将70%乙醇均匀喷洒在胸部和腹部表面，进行消毒。接下来，用不锈钢剪刀沿着延伸至颈部的正中线打开腹腔，然后劈开胸骨。从胸壁切除横膈膜。切开腹侧胸壁，露出胸腔，取出胸腺。使用 4/0 丝缝合线，将下腔静脉和右上腔静脉交接。用不锈钢剪刀剪断腹主动脉引流。使用配备 27 号针头的 5 毫升无菌注射器，通过刺穿心室壁将 3 毫升无菌 PBS 注射到右心室中。使用 Dumont 镊子在主肺动脉周围缠绕 4/0 丝线。接下来，使用弹簧剪刀在肺动脉瓣下方切出一个两毫米的窗口，以进入右心室壁。将肺动脉导管通过窗口插入，并用预环的 4/0 丝线缝合线固定。使用五毫升注射器通过肺动脉导管缓慢注射两毫升PBS。用气管导管插管气管，并用 4/0 丝线将其绑扎到位。现在，使用空的五毫升注射器通过气管导管缓慢注入两毫升空气。保持空气 10 秒钟，以确保没有空气从肺部泄漏。移除心脏和肺末端阻滞。接下来，将切除的心肺阻滞转移到装有去离子水的直径10厘米的塑料培养皿中，用于肺部的脱细胞。将块在四摄氏度下孵育一小时。孵育后，使用五毫升注射器，通过气管导管注射两毫升无菌去离子水三次。每次注射后暂停，让液体在肺部后坐时排出。同样，通过肺动脉导管注入两毫升水。将两毫升 0.1% Triton X-100 溶液注射到气管和肺动脉导管中。将心肺阻滞转移到培养皿中，并在 Triton X-100 溶液中在 4 摄氏度下静态孵育过夜。第二天，要从肺部取出 Triton X-100 溶液，将两毫升去离子水注入气管导管和肺动脉导管中，并用两毫升 2% 脱氧胆酸盐溶液重复这些作。从肺部取出脱氧胆酸盐溶液后，将两毫升一摩尔氯化钠溶液注射到气管和肺动脉导管中。将心肺阻滞孵育一小时。用去离子水除去氯化钠溶液后，将两毫升DNase I工作溶液注入气管和肺动脉导管中。将心肺阻滞孵育一小时。将无菌PBS注射到气管和肺动脉导管中以去除DNase I溶液。脱细胞后，确认肺边缘呈白色透明。将 70 毫升内皮细胞生长培养基 2 或 EGM-2 培养基加入玻璃罐中，并将硅塞放在罐顶部以密封。使用三通旋塞组装硅塞、玻璃罐、带管的 GL45 螺旋盖、250 毫升可高压灭菌玻璃瓶和带诱饵配件的 L/S 14 管。将 20 号针头插入 GL45 螺旋盖的硅隔膜中。使用连接到旋塞阀 1 号和 3 号旋塞阀的 10 毫升注射器用培养基填充管 A、B 和 C。通过诱饵接头将脱细胞心肺阻滞的肺动脉导管连接到管子 C。确保导管或管道中不存在气泡。 对于内皮细胞的重力驱动注射，将含有人脐静脉内皮细胞或HUVEC的细胞储液器放在磁力搅拌器上，确保储液器位于器官室上方30厘米处。以 120 RPM 的速度打开磁力搅拌器。打开旋塞阀 1 和 2，让细胞悬液通过管 A、管 C 和肺动脉导管流入脱细胞支架。对于器官培养的灌注，将器官室放入二氧化碳培养箱中。将管子 B 连接到连接到脉动泵的泵头。关闭培养箱玻璃门。确保管道正确定位在门和橡胶密封件之间。将脱细胞支架在37摄氏度下孵育三个小时，以使内皮细胞在支架内沉降。以 6 RPM 的速率启动泵，使用 L/S 14 管每分钟灌注 2 毫升的培养基。观察脱细胞肺因培养基灌注而略微扩张。然后，关闭培养箱门。要执行介质更换，请停止泵驱动器。将 50 毫升无菌注射器连接到旋塞阀 3，然后从腔室中取出 50 毫升培养基。用 50 毫升预热培养基填充另一个 50 毫升无菌注射器。将溶液注入玻璃罐中，并通过旋塞阀三将培养基转移到腔室中，确保旋塞阀正确切换。重新启动脉动泵。在灌注器官培养两天后收获再集化的心肺阻滞。小鼠肺在脱细胞后呈白色半透明，表明细胞成分被去除，同时保留了整体肺结构。对脱细胞小鼠肺的组织学分析显示肺泡结构完整，没有残留的细胞成分。在基于灌注的生物反应器培养两天后，用三倍10的7个HUVEC的次方重细胞化小鼠肺表现出HUVEC的均匀分布。HUVEC 迁移到外周肺泡区域，形成毛细血管样网络，如在集化肺中观察到的那样。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了一种通过去细胞化和再细胞化技术生物工程化小鼠肺的标准化协议。它旨在通过优化可扩展和可重复的结果方法来促进器官生物工程学的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物工程
- 器官移植
- 干细胞研究
背景
- 生物工程化人体器官是资源密集型的。
- 学术实验室在迭代协议开发方面常常面临容量限制。
- 小鼠模型为测试生物工程协议提供了一个可管理的平台。
- 肺部结构在哺乳动物之间相似，允许可扩展的研究。
研究目的
- 建立使用小鼠心肺块进行肺生物工程的标准化协议。
- 识别用于器官生物工程的适当细胞类型。
- 比较多种细胞类型和条件，以有效整合到器官生物反应器培养中。
使用的方法
- 去细胞化小鼠肺以去除细胞成分。
- 用各种细胞类型再细胞化以评估整合情况。
- 原位肺移植以评估功能性。
- 优化协议以实现可扩展性和可重复性。
主要结果
- 成功创建了生物工程化的小鼠肺。
- 确定了肺再细胞化的最佳细胞类型。
- 展示了细胞有效整合到肺部结构中的情况。
- 建立了一个可扩展的协议以供未来研究。
结论
- 该研究为小鼠模型中的肺生物工程提供了一个框架。
- 研究结果可以加速器官移植和疾病建模研究。
- 未来的研究可以在这个协议基础上探索更大的动物模型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Bioengineered lung transplantation using decellularized mouse lungs and primary human endothelial cells addresses a critical bottleneck in organ bioengineering: scalable, cost-effective experimental platforms for early-stage protocol optimization. This approach enables rapid, resource-efficient hypothesis testing for cell integration and scaffold compatibility, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines. The platform's flexibility supports iterative discovery and portfolio triage for cell therapy and organ replacement strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of cell-scaffold compatibility and integration in a controlled, scalable system.
- Supports biological de-risking by allowing direct comparison of multiple cell types and recellularization conditions.
- Facilitates predictive confidence in cell selection and protocol reproducibility for downstream translation.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible mouse-scale platform for evaluating recellularization efficiency and tissue viability.
- Enables quantitative assessment of cell distribution and network formation using histological and molecular readouts.
- Supports assay scalability and platform reuse for iterative optimization of cell sourcing and perfusion parameters.
Translational & Preclinical Research
- Allows modeling of human cell behavior in three-dimensional, organ-scale environments relevant to disease and transplantation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling patient-derived or genetically modified cell testing.
- Provides a framework for risk-adjusted advancement decisions prior to scaling to larger animal models.
Pipeline & Workflow Integration
This mouse-scale bioengineering protocol fits at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development, enabling rapid iteration before resource-intensive scale-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for cell-matrix interactions and scaffold compatibility.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing recellularization strategies.
- Analytics: Provides histological and molecular measurements to benchmark cell integration and tissue architecture.
- Translational Research: Enables disease modeling and patient-specific cell testing in a scalable, ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-efficient platform for protocol optimization across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell selection and protocol design for organ bioengineering.
- Operational Value: Reduces resource requirements and accelerates protocol development cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation for cell therapy and organ replacement initiatives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell types and recellularization strategies for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organ dissection, decellularization, and bioreactor operation.
- Demands access to perfusion systems, histological analysis, and molecular characterization tools.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other organ systems or larger animal models may require protocol scaling and validation.
- Limitations include the need for further maturation and functional assessment of engineered tissues before clinical translation.
