Name: 在 Galaxy Bioinformatics Platform 中实施的临床宏蛋白质组学工作流程，用于分析人类疾病背后的宿主-微生物组相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解Galaxy生物信息学平台中的临床宏蛋白质组学工作流程，用于分析宿主-微生物组相互作用。该计算方法结合质谱数据与数据库缩减技术，实现微生物肽的精准鉴定与功能注释。

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我们感谢明尼苏达大学的 Amy Skubitz 博士和 Kristin Boylan 博士提供的初步数据集，以及美国西北太平洋国家实验室（PNNL）的 Paul Piehowski 博士、Tao Liu 博士和 Karin Rodland 博士在样本采集、PTF 样本处理以及本研究中所用 TMT 标记质谱数据生成方面的专业支持。本项目部分由明尼苏达卵巢癌联盟（MOCA）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助，资助编号：5R01CA262153（A.P.N.S.）、1R21CA267707（P.D.J. 和 T.J.G.），以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助编号：P30CA077598（P.D.J. 和 T.J.G.）支持。

Galaxy-Enabled Metaproteomics: Insights into Host-Microbiome Interaction

作者声明无利益冲突。

临床宏蛋白质组学研究为临床研究提供了潜在的突破，但其实施过程中仍存在诸多挑战。在大多数样本中，微生物蛋白的丰度远低于宿主蛋白，这阻碍了非宿主蛋白的检测与表征6,10。准确鉴定和定量肽段及蛋白质依赖于庞大的蛋白质序列数据库，同时在对已鉴定的肽段和蛋白质进行分类学和功能注释以实现定量和统计分析时也面临复杂性，这些均构成了技术障碍1,3。本研究在Galaxy生物信息学平台中建立的临床宏蛋白质组学工作流程，可有效应对上述多项挑战。该流程使研究人员能够分析其质谱（MS）数据，生成针对其临床样本定制的蛋白质序列数据库，并利用多种搜索算法将MS/MS数据与蛋白质序列数据库进行匹配。通过纳入对假定微生物肽段匹配结果与MS/MS谱图的验证步骤，提高了所鉴定肽段及推断蛋白质的可信度，并支持其定量、可视化以及分类学归属和功能注释的分配，进而开展统计分析。
串联质谱标签（T...

基于质谱（MS）的宏蛋白质组学可从临床样本中鉴定并定量微生物和人类蛋白质。该方法为理解微生物组对疾病反应提供了新的视角，并揭示了宿主-微生物组相互作用的潜在介质1,2。尽管临床样本的宏蛋白质组学分析能够揭示微生物组与其宿主环境之间的相互作用，但该领域仍面临诸多挑战。其中一个主要挑战是宿主（人类）蛋白质的相对丰度较高，这会阻碍对低丰度微生物蛋白质的鉴定。此外，基于质谱的宏蛋白质组学依赖于非常大的蛋白质序列数据库。这些数据库包含样本中存在的微生物蛋白组，可能导致数据库规模庞大，包含数百万条序列。在通过胰蛋白酶消化蛋白质生成串联质谱（MS/MS）谱图后，需将这些MS/MS谱图与大型蛋白质序列数据库进行比对，为每张谱图匹配相应的肽段序列（即肽段-谱图匹配，PSM）。然而，随着宏蛋白质组学所用数据库规模的增大，检测灵敏度下降，假阳性风险也随之增加3。此外，不同分类群间保守的蛋白质序列以及对编码蛋白质注释的不足，限制了对检测到的肽段和蛋白质进行分类学和功能注释的准确性4,5。本文提出了一种用于临床样本高效宏蛋白质组学分析的生物信息学工作流程，可应对上述诸多挑战，并为研究人员提供易于使用的软件资源，以探究人类疾病中宿主-微生物组动态关系的机制。
临床宏蛋白质组学已被用于研究多种样本类型，包括粪便和阴道拭子等，以解析疾病和病理状态中的致病机制6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。本文中，我们采用宏蛋白质组学生物信息学工作流程，分析来自卵巢癌（OVCA）患者和非OVCA患者的宫颈脱落细胞检测液（PTF）样本中的一部分MS/MS数据21。所使用的软件工具和工作流程可通过Galaxy平台获取，该平台可简化复杂临床宏蛋白质组学工作流程的开发与执行22,23,24,25。Galaxy是一个开源平台，专为生物信息学和计算生物学设计，提供基于网络的环境，供学术研究人员使用开源工具和工作流程进行并共享复杂的数据分析。一个活跃的全球性软件开发者、数据科学家和终端用户社区维护着Galaxy生态系统，其中包括Galaxy培训网络（GTN；https://training.galaxyproject.org/），&#160;该网络提供在线和按需培训资源22,23,24,25,26,27。我们的工作流程旨在揭示临床样本中宿主-微生物相互作用的新认知，并生成新颖且特征明确的肽段靶标，用于开发基于质谱的靶向临床检测方法，以进一步研究临床样本6,20,28。此外，本论文旨在突出展示临床宏蛋白质组学工作流程的方法学。GTN（https://training.galaxyproject.org/）提供了更详细且适合初学者的指南，作为本论文的补充资源，供需要额外解释的用户并行参考。Galaxy社区已撰写大量论文，以帮助初学者更好地使用Galaxy平台20,21,22,23,24,25,26,27。
本论文的所有补充表格（例如，工具参数）和图示（例如，示例图表）均已作为单独文件提供，并在文中相应位置引用。本论文使用的是 Galaxy 版本 2.3.0 中的当前工具版本，因此结果可能因 Galaxy 平台或工具版本的更新而略有差异。Galaxy 平台及其工具为开源软件，可用于学术研究目的。

<table><tbody><tr><td>合并数据集列表集合为单个文件（按列表顺序）</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 5.1.1</td><td>将数据集列表集合合并为一个文件（按列表顺序）</td></tr><tr><td>连接数据集</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 0.1.1</td><td>将文件首尾相连进行拼接</td></tr><tr><td>剪切</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.0.2</td><td>从文件中剪切（选择）指定的列</td></tr><tr><td>FASTA 合并文件并筛选唯一序列</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.2.0</td><td>将多个 FASTA 数据库文件合并在一起</td></tr><tr><td>FastaCLI</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 4.0.41+galaxy1</td><td>向 FASTA 文件追加诱饵序列</td></tr><tr><td>FASTA 转表格</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.1.0</td><td>将 FASTA 格式的序列转换为制表符分隔格式</td></tr><tr><td>筛选</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.1.1</td><td>使用简单表达式筛选列</td></tr><tr><td>筛选表格文件</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 3.3.0</td><td>通过行筛选条件过滤表格文件</td></tr><tr><td>Galaxy 欧洲（EU）服务器</td><td>GalaxyP</td><td></td><td>https://usegalaxy.eu/</td></tr><tr><td>分组</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 2.1.4</td><td>按特定列对文件进行分组并执行聚合函数</td></tr><tr><td>鉴定参数设置</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 4.0.41+galaxy1</td><td>为 SearchGUI/PeptideShaker 设置鉴定参数</td></tr><tr><td>学习路径：Galaxy 中的临床宏蛋白质组学工作流程</td><td>GalaxyP</td><td></td><td>https://training.galaxyproject.org/training-material/learning-pathways/clinical-metaproteomics.html</td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 2.0.3.0+galaxy0（发现模块）；Galaxy 版本 1.6.17.0+galaxy4（定量模块）</td><td>用于分析大规模质谱数据文件的定量蛋白质组学软件包</td></tr><tr><td>MetaNovo</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.9.4+galaxy4</td><td>将 MS/MS 数据与已知蛋白质的 FASTA 数据库进行比对，生成用于质谱分析的靶向数据库（匹配的蛋白质）</td></tr><tr><td>msconvert</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 3.0.20287.2</td><td>转换和/或过滤质谱文件</td></tr><tr><td>MSstatsTMT</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 2.0.0+galaxy1</td><td>基于 R 的软件包，用于在基于串联质谱标签（TMT）标记的 shotgun 质谱蛋白质组学实验中检测差异丰度蛋白</td></tr><tr><td>PepQuery2</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 2.0.2+galaxy0</td><td>以肽段为中心的搜索引擎，用于鉴定和/或验证目标已知或新肽段</td></tr><tr><td>PeptideShaker</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 2.0.33+galaxy1</td><td>解析 SearchGUI 的结果以实现蛋白质鉴定</td></tr><tr><td>蛋白质数据库下载器</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 0.3.4</td><td>将指定的蛋白质序列下载为 FASTA 文件</td></tr><tr><td>查询表格文件</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 3.3.0</td><td>将表格文件加载到&amp;nbsp;SQLite 数据库中</td></tr><tr><td>移除开头部分</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.0.0</td><td>从文件中移除指定数量的（标题）行</td></tr><tr><td>SearchGUI</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 4.0.41+galaxy1</td><td>在 MGF 峰值列表上运行搜索引擎，并将结果准备为 PeptideShaker 的输入</td></tr><tr><td>选择</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 1.0.4</td><td>选择匹配表达式的行</td></tr><tr><td>Unipept</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 4.5.1</td><td>检索胰蛋白酶肽段对应的 UniProt 条目及分类学信息</td></tr><tr><td>UniProt</td><td>GalaxyP</td><td>Galaxy 版本 2.3.0</td><td>从 UniProtKB 下载蛋白质组为 XML（UniProtXML）或 FASTA 文件</td></tr></tbody></table>

在galaxy生物信息学平台内实施的临床宏蛋白质组学工作流程用于分析人类疾病中宿主-微生物组相互作用

A Clinical Metaproteomics Workflow Implemented within Galaxy Bioinformatics Platform to Analyze Host-Microbiome Interactions Underlying Human Disease

临床宏蛋白质组学揭示了宿主-微生物组相互作用在疾病中的基础作用。然而，该方法仍面临诸多挑战。特别是，相对于宿主蛋白，丰度较低的微生物蛋白的表征十分困难。另一个重要挑战源于使用非常庞大的蛋白质序列数据库，这不仅在从质谱数据中进行肽段和蛋白质鉴定时降低了灵敏度和准确性，还影响了分类学与功能注释的获取以及统计分析的执行。为解决这些问题，我们提出了一种整合的生物信息学工作流程，用于基于质谱的宏蛋白质组学分析，该流程结合了自定义蛋白质序列数据库构建、肽谱匹配生成与验证、定量分析、分类学和功能注释以及统计分析。该工作流程同时支持人类蛋白质的表征（在优先关注微生物蛋白质的前提下），从而提供对疾病中宿主-微生物相互作用动态的深入理解。这些工具和流程部署于Galaxy生态系统中，有助于开发、优化和共享这些计算资源。我们已将该工作流程应用于多种临床样本类型的宏蛋白质组学分析，例如鼻咽拭子和支气管肺泡灌洗液。在此，我们通过分析宫颈拭子残留液体来展示其应用价值。完整的工作流程及配套培训资源均可在Galaxy培训网络获取，旨在为非专业人员和经验丰富的研究人员提供分析其数据所需的知识与工具。

本文所述的通用方案已在从部分PTF样本获得的MS/MS文件上进行了验证21。Do等21分析了来自PTF样本的四个MS/MS文件，这些样本的采集遵循Boylan等29和Afiuni-Zadel等30所描述的操作流程。该工作流程优先关注微生物蛋白，但同时具备并行分析人类蛋白与微生物蛋白的灵活性21。该工作流程及其多种变体已在其他研究中得到应用6,20。
为了整理一份相关物种的列表，Do 等人从先前一项研究宫颈-阴道微生物组的研究中选取了 118 个分类学物种30。该列表包含 117 种细菌以及酵母菌 Candida albicans（补充表 3</str...

临床宏蛋白质组学为研究人类微生物组及其在疾病中的作用提供了深入见解。我们利用 Galaxy 平台的计算能力，开发了一种模块化的生物信息学工作流程，该流程可促进基于质谱的复杂宏蛋白质组学分析，并实现对多种与疾病研究相关的临床样本类型的表征。

在Galaxy生物信息学平台内实施的临床宏蛋白质组学工作流程用于分析人类疾病中宿主-微生物组相互作用

临床宏蛋白质组学揭示了疾病背景下宿主与微生物组相互作用的机制。然而，该方法仍面临诸多挑战。特别是，……

我们的研究重点是检测和定量微生物蛋白质，并阐明其在临床疾病中的作用。这一研究领域被称为临床宏蛋白质组学。在本研究中，我们开发了一种生物信息学分析流程，可帮助研究人员理解细菌活性如何影响疾病进展。临床样本的宏蛋白质组学分析面临诸多挑战，包括处理庞大的蛋白质序列数据库，以从质谱数据中灵敏且准确地鉴定微生物肽段和蛋白质，此外还需对定量得到的肽段和蛋白质进行分类学和功能注释，从而实现对结果的生物学解读。该工作流程具有多项优势，包括利用我们的数据库缩减流程实现数据库的简化、采用多种搜索算法进行微生物肽段的检索、验证质谱数据中检测到的微生物肽段、对微生物蛋白与宿主蛋白同时进行定量，以及通过统计分析和可视化分析实现数据的生物学解读。我们已应用临床宏蛋白质组学工作流程，鉴定用于囊性纤维化疾病进展研究的微生物肽段组合，并用于研究新冠大流行期间的共感染状态。这些研究已发表在经过同行评审的学术期刊上。目前，我们正在将此工作流程应用于一项正在进行的研究，旨在开发用于卵巢癌的预测性靶向肽面板。Galaxy P 团队参与了多组学研究，我们正在开发多个用于蛋白质基因组学和宏蛋白质组学分析的高级工作流程。目前，我们还在致力于开发用于免疫肽组学的工作流程，该流程将使研究人员能够检测并表征呈递给免疫系统的肽段，其中一些在癌症进展过程中出现，被称为新抗原，此外还包括其他疾病中可能存在的微生物来源肽段。首先，获取与目标疾病或状况相关的物种列表。使用名为 Species 的物种列表文件。以表格形式作为UniProt的输入。下载FASTA格式的蛋白质组以生成蛋白质序列数据库。运行蛋白质数据库下载器，生成另外两个蛋白质序列数据库：一个仅包含已审阅条目的人源Swiss-Prot数据库，以及一个包含常见外源性蛋白质公共库（cRAP）的污染物蛋白质数据库。将三个蛋白质数据库作为输入生成FASTA合并文件，并筛选唯一序列以排除重复项。以生成的大规模数据库和质谱数据集作为输入，运行MetaNovo以生成缩减的蛋白质序列数据库，随后对该MetaNovo生成的数据库、人源Swiss-Prot数据库以及cRAP数据库执行FASTA合并文件操作并筛选唯一序列，从而构建一个包含微生物、人类及污染物蛋白质序列的缩减目标数据库，用于肽段检测。运行Search GUI以生成包含肽段谱图匹配结果（PSMs）的归档文件。使用 Search GUI 的“archive 文件作为 Peptide-Shaker 输入”来生成 PSM、肽段和蛋白质报告。运行 MaxQuant 以生成蛋白质组和肽段文件。利用文本处理工具，对 Search GUI、Peptide-Shaker 和 MaxQuant 获得的输出结果进行整理。将两个肽段列表合并为一个标记为 SGPS-MQ-Peptides.tabular 的单一数据集。对合并后的肽段列表进行分组，以消除重复的肽段序列，获得唯一的微生物肽段最终列表。用于 PepQuery2 验证时，输入不同的微生物肽段列表、质谱谱图数据集、含异构体的人类 UniProt 参考数据库以及污染物蛋白质序列数据库。使用“Run Cut”处理来自 Search GUI、Peptide-Shaker 和 MaxQuant 的肽段报告，以提取肽段序列及其相关的蛋白质条目。将两个程序输出的肽段序列和蛋白质条目合并，创建一个新的整合肽段-蛋白质数据集，然后在该整合数据集与已验证肽段之间运行“Query Tabular”，为每个已验证肽段分配其对应的蛋白质条目。按唯一已验证肽段及其对应的 UniProt ID 进行分组保留。接下来，运行“查询表格”工具以提取 UniProt ID，从已验证的肽段文件 Peptides.tabular 中生成一个标记为 Uniprot-ID 的列表。将这些 UniProt ID 上传至 UniProt，以获取相应的蛋白质序列，并将其保存为新的 UniProt FASTA 文件。对新生成的 UniProt FASTA 文件、含异构体的人类 UniProt 数据库以及 cRAP 污染物数据库，运行 FASTA 文件合并并筛选唯一序列，从而构建用于肽段定量的验证数据库。使用经过验证的蛋白质序列数据库和质谱数据集作为 MaxQuant 的输入。从 MaxQuant 的“peptides”文件中仅选择微生物肽段，并运行 Cut 工具以从该选择文件中提取出仅包含微生物肽段的序列。对 Cut 工具生成的文件进行分组，以汇总获得一份定量的微生物肽段列表。使用已定量的微生物肽列表文件作为输入，导入 Unipept 以进行分类学和功能注释。提取 Unipept 的输出结果，特别是微生物分类树和微生物酶委员会蛋白树。要查看微生物分类树和 EC 蛋白树，请选择数据集并打开选项。单击“可视化”，然后选择“Unipept 分类学查看器”。如需以表格形式查看分类学和功能注释，请单击名为 Unipept_peptinfo 的表格数据集旁边的“眼睛”图标。向下滚动，逐行查看每种肽及其对应的信息列。在使用 MSstatsTMT 进行统计分析之前，对 MaxQuant 的“protein groups”文件运行“Select”操作，以分别生成微生物和人类蛋白质的数据集。这些蛋白质包含指示其来源的分类学标签。排除任何带有 con_ 标签标记的污染蛋白质。在“Microbial_Proteins”表格中仅保留带有类似 _9laco 标签的微生物蛋白质，在“Human_Proteins”表格中仅保留带有 _human 标签的人类蛋白质。最后，使用 MSstatsTMT，结合 MaxQuant 的 evidence 文件以及筛选后的微生物或人类蛋白质进行统计分析。单击眼睛图标以查看生成的图表。共收集了 2,595,745 条蛋白质序列，构建了一个综合数据库，随后将其缩减为包含 21,289 条蛋白质序列的更特异的数据库，以实现有效的肽段鉴定。利用 Search GUI、Peptide-Shaker 和 MaxQuant，共鉴定出 196 种不同的微生物肽段。PepQuery2 验证了与 73 条蛋白质序列相关的 134 种微生物肽段，构建了一个用于定量分析的已验证数据库。MaxQuant分析提供了一个包含3,203个肽段的文件，其中155个为定量的微生物肽段。Unipept分析显示，在155个定量的微生物肽段中，乳杆菌属（Lactobacillus）为最丰富的属，II类转移酶为最丰富的酶类别。MSstatsTMT分析生成了火山图和比较图，以展示差异表达的蛋白质，结果表明，在卵巢癌病例中，三种乳杆菌蛋白的表达水平较良性病例下调。

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Research

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免疫学与感染

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