用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

我们正在开发用于快速、高灵敏度多重免疫荧光检测的试剂盒。其目标是帮助研究人员分析福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中出现的不同细胞类型

免疫荧光通常使用染料标记或过氧化物酶标记的二抗进行。免疫组织化学检测通常通量较低。染料标记的二抗信号较弱。酪胺信号放大实验优化繁琐，且运行时间需数小时至数天不等。

该检测的标志物已预先优化，速度显著快于其他技术。建立四个标志物约需不到八小时，每增加四个生物标志物约需额外三小时。

更快地进行多重免疫荧光检测的能力将有助于更广泛地应用空间蛋白质组学，并降低理解组织空间结构的门槛。

[旁白] 首先，将所有试剂盒试剂在室温下解冻。抗体偶联物、扩增酶、交换引发剂和交换中和剂在使用前应保存于-20摄氏度。将解冻后的抗体稀释液涡旋混匀，用移液器将抗体稀释液转移至容器中。短暂离心后，将所有抗体加入抗体染色溶液1容器中。按1:100的比例加入提供的抗体稀释液。然后用移液器轻轻混匀溶液，避免涡旋。解冻后涡旋预扩增混合液以充分混匀，随后将其加入相应的混合容器中。涡旋扩增缓冲液，并用移液器混匀扩增酶。按1:10的比例将扩增酶稀释于扩增缓冲液中以制备扩增缓冲液。通过移液轻轻混匀，避免涡旋。随后涡旋并离心提供的核复染溶液，并用超纯水按1:100稀释。接下来，将荧光探针1溶液按1:20的比例稀释于探针缓冲液中。将完整的试剂棒插入仪器中，以便测量试剂体积。当所有试剂准备就绪后，在自动染色机软件顶部导航至“载玻片设置”选项卡。点击“添加研究”按钮，并根据需要输入研究ID、研究名称及任何研究备注。在“加样体积”下选择150微升，并选择*Dewax 4 Steps作为制备方法。如果下拉菜单中没有该选项，请打开“程序设置”菜单，勾选其对应的首选复选框，然后点击“确定”。研究创建完成后，点击“载玻片设置”界面右侧的“添加载玻片”按钮。在“载玻片备注”下为载玻片输入唯一名称。在相应字段中将“组织类型”设置为测试组织。然后为“加样体积”选择150微升，将“染色模式”左侧下拉菜单设为“单次”，右侧设为“常规”。在“流程”下选择IHC，并将“标记物”设为抗体染色溶液。在“添加载玻片”窗口的“程序”部分，为“染色”选择Staining Assay 1，为“制备”选择*Dewax 4 Steps，为HIER选择*HIER 20分钟加ER2。将“酶处理程序”保留为星号-短划线（* -），所有字段填写完毕后点击“添加载玻片”。添加所有载玻片后，关闭“添加载玻片”窗口，打印载玻片标签并将其贴至对应的组织切片上。将每张标记好的载玻片加载到载玻片托盘上，并在每张组织切片上放置盖片。将载玻片托盘插入仪器中，并在软件屏幕右侧选择相应的自动染色机。确认三个载玻片托盘以及所有试剂信息（包括散装试剂和已配制试剂）均可见。检查散装试剂容器是否已充分填充，废液容器是否有足够容量完成运行。然后按下播放按钮开始染色程序，并在程序完成后及时从自动染色机中取出载玻片。将染色后的载玻片置于PBS缓冲液中，并使用封片介质加盖盖玻片。使用与检测染料兼容滤光片的荧光显微镜或全片扫描仪对载玻片进行成像。对于交换检测，将交换缓冲液在室温下解冻。交换中和剂和交换引发剂在使用前应保存于-20摄氏度。准备两个试剂滴定容器，并取出检测试剂盒用于交换程序。涡旋交换缓冲液，并用移液器混匀交换引发剂。在指定容器中通过混合所需体积的交换引发剂和交换缓冲液来配制交换溶液。仅通过移液混匀内容物。现在将荧光探针2溶液与稀释后的交换缓冲液在相应容器中混合。仅涡旋探针缓冲液和荧光探针混合液，并用移液器混匀最终溶液。将装有所有已配制试剂的完整试剂棒放置在自动染色机上。让仪器对所有试剂执行浸入测试。添加载玻片后，将标记物设为*Negative。对于“制备”、“HIER”和“酶处理”，选择星号-短划线（* -）选项，因为交换程序无需脱蜡或抗原修复。完成后点击“添加载玻片”。所有载玻片添加完毕后，关闭“添加载玻片”窗口，打印载玻片标签并贴至每张对应的组织切片上。将每张载玻片加载到托盘上，在将托盘放入自动染色机前，在每张组织切片上放置盖片。然后按下播放按钮启动运行。使用八重免疫荧光程序对组织微阵列核心进行两轮染色成像，结果显示每轮中不同的免疫标记物清晰可辨，成功实现图像共定位，将两轮结果整合为统一的复合图像。对结直肠癌组织进行全片成像，能够基于标记物的共定位识别免疫表型，包括调节性T细胞、耗竭T细胞和免疫抑制型巨噬细胞。免疫荧光染色显示调节性T细胞中共表达CD3、CD4和FoxP3；肿瘤和基质细胞中表达PD1和PDL1；耗竭的细胞毒性T细胞中表达CD3、CD8和PD1；免疫抑制型巨噬细胞中表达CD68和PDL1。单标记免疫组织化学与单重或多重免疫荧光的比较证实，所有标记物的染色模式具有一致的定性吻合性。不同组织类型的连续切片染色显示，代表性组织核心中的免疫标记物表达模式一致，染色成功且变异性极小。扁桃体组织连续六张切片的CD8染色显示出高度可重复性，所有图像中的信号分布几乎完全相同。跨组织类型中阳性标记细胞密度的定量分析显示，扁桃体和淋巴结中的密度最高，黑色素瘤和结肠组织中的密度最低。