Name: 切片人皮质类器官的电穿孔用于基因功能研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习利用电穿孔技术对人皮质类器官进行急性基因操作，研究神经祖细胞分化机制与神经发育障碍。该方法为理解人类大脑发育提供了有效工具。

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我们感谢CRTD和德累斯顿概念（Dresden Concept）合作伙伴所提供的卓越支持，特别是干细胞工程设施的K. Neumann及其团队、光学显微镜设施的H. Hartmann及其团队、流式细胞术设施的A. Gompf及其团队，以及马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所（MPI-CBG）车间的Hartmut Wolf在电穿孔腔室构建方面提供的帮助。我们感谢Joshua Schmidt对本文稿提出的反馈意见。MA感谢德累斯顿工业大学再生疗法中心、德国研究基金会（DFG，Emmy Noether项目，AL 2231/1-1）以及Schram基金会提供的经费支持。

CRISPR/Cas9 Gene Knockout in Sliced Human Cortical Organoids via Electroporation

作者声明不存在利益冲突。

人脑类器官和皮质类器官已成为研究人类新皮质发育的关键模型7,16,17。在人类疾病建模中，同基因型的人诱导多能干细胞（hiPSC）系及其衍生的类器官已成为金标准68。然而，由于建立新的iPSC细胞系耗时且成本高昂，对皮质类器官模型进行急性基因功能干预的方法已被广泛应用。
大脑类器官和皮质类器官的电穿孔技术14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 易于实施，许多传统上使用动物模型进行功能研究的实验室都已配备所需的工具。用于注射 体内，通常以侧脑室为靶点34,36,37,39,40,41,42这些结构在皮质类器官中以类似脑室的结构建模，具有可注射的中央腔。皮质类器官的电穿孔主要靶向衬于脑室腔壁细胞的末端足，通常是顶端放射状胶质细胞。69靶向效率在不同实验间存在差异，但通常在电穿孔后3至7天，每个类器官可获得数百至一千个GFP阳性细胞。人类神经前体细胞的细胞周期持续时间大约是小鼠的两倍，小鼠顶端放射状胶质细胞的细胞周期为14小时，而基底前体细胞为23小时。70因此，转染3天后，主要为顶侧放射状胶质细胞和中间前体细胞呈GFP阳性，而7天后GFP阳性细胞则分布于类器官的各个区域。电穿孔数月后仍可观察到GFP信号，此时GFP阳性细胞主要为分散于整个类器官中的神经元，使我们能够分析单个细胞的形态。在明场显微镜下可识别出类似脑室区域的阶段，可实现对衬于脑室壁的神经前体细胞的有效靶向。在本实验方案中15，这在皮质类器官发育的第2周至第12周是可行的，此后脑室会缩小并不再可见。对于有经验的实验人员，一次操作可成功注射50至80个类器官。
尽管顶端放射状胶质细胞的子代在细胞分裂过程中可继承基因操作试剂，但使用标准电穿孔方法无法直接靶向成熟的细胞（如神经元和星形胶质细胞）。因此，病毒靶向技术已被应用于神经系统中的有丝后细胞33,71。其中，重组腺相关病毒（AAVs）因其易于制备且能高效转导终末分化的细胞，被广泛用于神经系统中的基因转移71。此外，AAVs 可靶向特定的神经元亚群。不同的病毒靶向方法，包括使用腺病毒、仙台病毒和慢病毒，已在脑类器官和皮层类器官中得到应用15,25,29,30,32,47,72,73,74。
脑类器官培养方案的一个局限性在于，由于氧气和营养供应受限，类器官中心容易形成坏死核心。已有多种策略被用于改善类器官中心区域的细胞存活率，包括将类器官培养于旋转式生物反应器中14,54、与内皮细胞共培养或采用生物工程手段模拟血管化75,76、将类器官移植至啮齿类动物模型18,77，以及对类器官进行切片处理15,47。在本研究中，我们采用了人源皮层类器官切片方案，该方法已被证明可显著减少类器官核心区域的缺氧状况，并支持脑室样结构和皮层板样区域的扩展15。此外，对脑类器官进行切片也有利于对位于脑室下区的基底放射状胶质细胞进行活体成像，从而构建细胞命运决定图谱72。同样，活体成像技术也被用于研究在气液界面培养的切片脑类器官，该培养方式有助于神经元存活和轴突发育47。我们发现，人源皮层类器官的切片处理还使这类模型特别适用于电穿孔操作，因为在切片后脑室样结构可被清晰识别。对皮层类器官进行电穿孔可实现DNA质粒的导入，这些质粒传统上用于基因过表达，而近期也被用于递送完整的质粒文库55，以及递送CRISPR/Cas9基因编辑工具以失活特定基因功能26。
CRISPR/Cas9 技术革新了基因功能的研究56,57,58,63,66在本方案中，我们概述了gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物的应用36 用于人脑皮层类器官中急性基因失活。gRNA效率的初步验证已进行 体外首先在体外试管中进行，其次在诱导多能干细胞（iPSCs）中进行。我们发现，这些简单的初步测试有助于筛选出有潜力的gRNA配对，尤其是在缺乏有效抗体的情况下。随着越来越多针对CRISPR/Cas9介导基因敲除的工具被充分表征，未来这些初始验证步骤或许可以省略。尽管从iPSCs中分离的目标DNA区域进行高通量测序具有更高的定量性和信息含量，但我们发现，在gRNA的预筛选阶段，Sanger测序通常能提供更快的结果。最终，在皮层类器官中验证CRISPR/Cas9编辑的高效性，并在目标细胞中确认蛋白水平的降低，是证明CRISPR/Cas9介导基因敲除成功的最确凿证据。
对切片的人类皮质类器官进行电穿孔，可实现急性基因操作，用于基因功能获得和功能缺失研究，细胞形态及神经元轴突的可视化，质粒文库的递送以进行筛选和大规模并行报告基因检测，细胞标记以用于活体成像，以及表观基因组编辑工具的递送。因此，对切片的人类皮质类器官进行电穿孔是一种强大的方法，可揭示人类皮质发育、神经发育障碍以及皮质进化过程中的机制性见解。

新皮层指的是大脑半球的外层覆盖结构，是哺乳动物所特有的结构。新皮层是高级认知功能的中枢1,2,3,4,5。在发育过程中，神经干细胞和前体细胞通过称为神经发生的过程产生神经元。对人类新皮层发育的功能性研究为阐明人类神经干细胞调控机制、神经病理学以及人类大脑进化提供了基础2,6,7。
传统上，人类大脑发育的研究依赖于使用死后组织进行描述性的组织学方法，而近年来的游离式组织培养系统使得能够利用人类胎儿组织开展功能性研究8,9。此外，研究发现人类胎儿脑组织具有自我组织形成长期扩增类器官的能力10。胎儿组织研究为理解人类发育过程提供了重要见解11,12，但受限的组织可获得性以及伦理考量限制了其在人类大脑发育机制研究中的广泛应用。在过去十年中，已开发出一系列方案，能够从人类多能干细胞（hPSC）包括人类诱导多能干细胞（hiPSC）生成三维神经类器官13,14。
脑类器官展现出发育中大脑的重要特征，例如脑室样结构的形成、顶-基底极性、皮层细胞构筑、放射状胶质细胞分裂过程中的核间期迁移以及神经元迁移。尤为重要的是，这些新的人类类器官模型重现了人类发育中大脑的某些特性，而这些特性在小鼠模型中难以准确模拟，包括进化上关键的神经前体细胞类型，特别是外侧放射状胶质细胞（或称基底放射状胶质细胞）7,14,15。早期脑类器官培养方案存在的一些局限性——如类器官异质性、内部核心营养供应不足以及区域身份不一致等问题——已在近期的方案改进中得到部分解决，未来几年内预计还将进一步优化15,16,17,18,19。人类脑类器官和皮层类器官已迅速成为研究人类皮层发育20、神经系统疾病21,22,23,24、脑进化25,26,27,28,29以及开展大规模筛选研究的重要模型30,31,32。
对于急性遗传操作，在新皮层发育的动物模型中主要采用两种方法：通过感染靶细胞进行病毒递送33 和 在子宫内 或 体外 电穿孔34,35DNA注射——以及近期发展的CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物注射36- 注入侧脑室，随后进行电穿孔，其优势在于可根据电穿孔电极的方向靶向大脑的特定区域。电穿孔通过短暂的电脉冲暂时增加细胞膜通透性，从而将DNA及其他带电分子导入细胞内。 在子宫内 电穿孔首次在小鼠中进行37，迅速成为发育神经生物学中广泛应用的方法。随后，该方法也被应用于其他物种，如大鼠38,39 和雪貂40,41,42一种用于研究新皮层扩张和皮层折叠的脑回型物种3,43,44,45.
电穿孔也已成为人脑类器官研究中的重要方法46。在大脑类器官中，电穿孔已被用于可视化细胞形态和神经元轴突14,47，递送基因敲低试剂22,48,49，以及通过过表达研究基因功能50。该方法不仅限于人类模型，也已应用于灵长类动物大脑类器官的遗传修饰50,51。此外，已有研究报道了在Spin Ω旋转式生物反应器中生成的皮质类器官的电穿孔方法52。
本方案中，我们概述了人皮质类器官切片的电穿孔技术15 用于皮层发育中基因功能的研究。脑区特异性类器官提高了可重复性和一致性，这对于定量分析（例如在疾病建模中）的成功至关重要。在人脑皮层类器官切片实验方案中15，应用强效的模式化信号以指导iPSC分化，获得同质的背侧前脑前体细胞，随后使用促进组织生长且含有较少指导性信号的培养基53,54皮质类器官切片已被证明可减少因类器官核心区域营养和氧气供应不足导致的细胞死亡15此外，切片支持形成含有大量基底放射状胶质细胞的脑室样结构，并通过持续的神经发生导致类似皮质板区域的扩张15该方案中的重复切片操作使得这些皮质类器官特别适用于电穿孔实验，因为脑室腔易于通过注射进行识别和靶向。切片皮质类器官的电穿孔技术已被应用于基因调控区域及皮质进化研究。26,55.
在电穿孔过程中，注射混合物被递送至类似脑室结构的腔内。当施加脉冲电场后，衬于脑室壁的顶端放射状胶质细胞会摄取该混合物。随着顶端放射状胶质细胞分裂并产生更为特化的细胞类型4，电穿孔的试剂将传递至基底前体细胞和神经元。电穿孔后的子代细胞在电穿孔后3天分布于脑室区（VZ）和脑室下区（SVZ），至电穿孔后7天（处于神经发生中期）时，已广泛分布于大部分皮层壁，包括类似皮层板（CP）的区域26,55。
此处，我们描述CRISPR/Cas9介导的基因敲除56 通过电穿孔法在人脑皮层类器官切片中进行26此外，电穿孔法还可用于基因过表达、通过表达荧光蛋白来观察细胞形态和细胞过程、递送质粒文库用于大规模并行报告子检测（MPRA）、递送表观基因组编辑工具，以及对细胞进行标记以实现活体成像。

<table><tbody><tr><td>15 mL PP 离心管，锥形</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-核转染核心单元</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-核转染 X 单元</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞过滤帽</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板，nunclon 处理</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td>用于 hiPSC 培养</td></tr><tr><td>6 孔板，超低吸附</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>用于类器官培养</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>前脑培养基 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗鸡 IgY（IgG）（H+L）</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>二抗，RRID: AB_2340375；稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>二抗，RRID: AB_162543；稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA，2 nmol</td><td>Integrated DNA technologies</td><td></td><td>定制设计（订购为 2 nmol）</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 V3</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>1081060</td><td>100 &amp;micro;g，来源于化脓性链球菌</td></tr><tr><td>两性霉素 B（Fungizone）</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>前脑培养基 2、3 和 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>抗-GFP 一抗（鸡，多克隆）</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798；稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>抗-PCGF4 一抗（小鼠，单克隆）</td><td>Millipore</td><td>05-637&amp;nbsp;</td><td>RRID: AB_309865；稀释比例 1:300</td></tr><tr><td>ApoTome 荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>前脑培养基 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>B27 补充剂（+ 维生素 A）</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>前脑培养基 3、4&amp;nbsp;&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>香蕉转 Micrograbber 电缆套件</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-热循环仪（PCR 仪）</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>毛细管，含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径 1.2 mm；内径 0.69 mm；长度 10 cm</td><td>Science Products</td><td>BF120-69-10</td><td>需拉制至特定厚度</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>前脑培养基 2&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>中国台湾 CMCB DD 干细胞工程设施</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>来自健康供体的单细胞适应性 hiPSC 系</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>1 mg/mL 储液，免疫荧光使用时稀释 1:1000</td></tr><tr><td>二丁酰-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>前脑培养基 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含 HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>前脑培养基 1、2 和 3&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>背侧形态发生素（Dorsomorphin）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>前脑培养基 1&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子，直头，11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 方波电穿孔系统</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>SH30070.03&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>用于微毛细管的拉制</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>软件版本 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gLACZ&lt;/em&gt;</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG；下划线核苷酸 = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>35050038</td><td>前脑培养基 1、2、3 和 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gPCGF4 &lt;/em&gt;KO1</td><td>本文</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG（对应图 3I+J 中的 KO 图像）</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gPCGF4 &lt;/em&gt;KO2</td><td>本文</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG（对应图 3I+J 中的 KO 图像）</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>实验室自制</td><td></td><td>1 M 储液</td></tr><tr><td>马血清，热灭活</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>人 GDNF 重组蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>前脑培养基 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>人/小鼠/大鼠 BDNF 重组蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>前脑培养基 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>用于配制 TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge（蜡）笔</td><td>Vector Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;I9278</td><td>前脑培养基 3&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>10828-010</td><td>前脑培养基 1&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦 980 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖，超纯</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520100</td><td>用于 hCOs 振动切片时的包埋</td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无 LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>用于类器官培养</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 认证基质，无 LDEV</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>用于 hiPSC 培养</td></tr><tr><td>MgCl2，1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器 PicoPump + 脚踏开关</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 移液器吸头 0.5 至 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>用于玻璃毛细管的加样</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>干细胞培养基</td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>前脑培养基 2 和 3&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next 高保真 2x PCR 主混合液&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 计数室</td><td>Brand</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>前脑培养基 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>前脑培养基 1、2、3 和 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>无核酸酶双链缓冲液</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 化合物</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>冷冻组织标本的包埋介质</td></tr><tr><td>P3 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒 S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 包埋模具 截短型 T12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>用于 hCOs 振动切片和冷冻切片的包埋</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>前脑培养基 1、2、3 和 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;，以及核转染后干细胞培养基</td></tr><tr><td>培养皿 60 mm x 15 mm，无通气孔，无菌</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>培养皿铂金电极室，5 mm 间隙</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>来源于灰色链霉菌；10 mg/mL 储液</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>RHO/ROCK 通路抑制剂（Y-27632）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>前脑培养基 2&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 粘附载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 配 KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>或替代体视显微镜</td></tr><tr><td>恒温振荡器</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>吐温-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>又称 Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>用于配制 TrisHCl</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x）</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>用于制备单细胞悬液的解离酶</td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>又称聚山梨酯 20</td></tr><tr><td>台氏盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机（vibratome）</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>宽口 1000 &amp;micro;L 通用滤芯吸头</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td>前脑培养基 1、3 和 4&amp;nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr></tbody></table>

电穿孔转染人脑皮层类器官切片用于基因功能研究

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

人脑皮层类器官已成为研究人类大脑发育、神经发育障碍以及人类大脑进化的重要工具。通过过表达或基因敲除来分析基因功能的研究，在动物模型中已为揭示新皮层发育调控机制提供了关键见解。本文介绍了一种通过电穿孔对切片后的人脑皮层类器官进行CRISPR/Cas9介导的急性基因敲除的详细实验方案。对皮层类器官进行切片有助于识别类似脑室结构的区域，从而便于注射及后续的电穿孔操作，因此该模型特别适用于在人类皮层发育过程中进行急性遗传操作。我们描述了向导RNA的设计方法，并在体外及皮层类器官中验证了靶向效率。in vitro（体外）和皮层类器官中的靶向效率验证均被涵盖。电穿孔操作在神经发生中期进行，可靶向发育中新皮层中的大多数主要细胞类型，包括顶端放射状胶质细胞、基底前体细胞以及神经元。综上所述，对切片后的人类皮层类器官进行电穿孔是一种强大的技术手段，可用于研究皮层发育过程中的基因功能、基因调控以及细胞形态变化。

CRISPR/Cas9介导的基因敲除需要设计gRNA。通常，针对目的基因的首个外显子之一，使用一对间隔为7-11 bp（避免3 bp的倍数）的gRNA进行靶向，效果较好（图1A）。作为初步测试，可检测gRNA对模板的识别效率 体外 使用 PCR 模板26,40,62. 在琼脂糖凝胶上可观察到模板DNA的减少以及切割后DNA产物的出现，表明高效的靶向定位和Cas9介导的切割图1B）。可进一步在用于皮质类器官生成的iPSC细胞系中进行gRNA验证。该过程需要对iPSC进行核转染，可通过成功的荧光报告基因表达进行观察图1C）。可通过Sanger测序验证对目标位点的有效靶向，结果表现为色谱图在靶向位点附近突然终止或出现重叠峰图1D），由非同源末端连接修复双链断裂所导致的一系列插入缺失突变（indels）引起66. 向导RNA效率检测 体外 在iPSC细胞中，有助于筛选用于皮层类器官基因敲除的高效gRNA配对。
在电穿孔之前，需对皮质类器官进行切片，以利于识别脑室腔并注入电穿孔混合液（图 2A-C）。注射后的类器官随后转移至电穿孔腔室（图 2D）。进行电穿孔时，应选用具有明显发育良好的类脑室结构的皮质类器官（图 2E），而缺乏可见结构的皮质类器官则应弃用（图 2F）。电穿孔混合液中含有染料，可在操作过程中可视化被注射的脑室（图 2G）。在培养 1–3 天后，成功靶向的脑室可通过荧光显微镜下观察内源性 GFP 信号而被识别（图 2H）。
为了进行深入的组织学分析，可对冷冻切片进行免疫组织化学染色。理想情况下，一个电穿孔的皮层类器官中应存在多个靶向的脑室结构（图3A，B）。最佳的电穿孔应靶向类器官外侧区域、朝向外侧的类脑室结构（图3C），因为这些通常是扩张最明显的脑室。在某些情况下，电穿孔可能导致过度的细胞死亡（图3D，E），例如当质粒浓度过高或电穿孔参数不理想时。朝向类器官内部的电穿孔（图3F）通常涉及的类脑室结构扩张程度较外侧区域小。根据我们的经验，将定量分析集中于类器官的明确定义区域有助于减少变异性。有时，电穿孔可能导致顶面结构破坏（图3G），例如当注射体积过大导致脑室破裂，或电脉冲过强引起细胞去层化。最后，当两个相邻的脑室同时被靶向时（图3H），可能难以界定皮层区域的边界以及被靶向细胞的来源。
免疫组织化学可用于在目标细胞的蛋白水平验证CRISPR/Cas9介导的基因敲除是否成功（图3I），此处以靶向Polycomb抑制复合物1（PRC1）的PCGF4蛋白为例67。可在对照组与实验组条件下，分析GFP阳性细胞中的信号强度（图3J）。或者，若无合适的一抗可用，则可通过FACS从皮层类器官60中分离靶向细胞，并进一步通过Sanger测序或高通量测序进行分析36。此外，也可通过蛋白质印迹法（Western blotting）分析蛋白水平的降低情况。
<img alt="CRISPR基因编辑；gRNA效率；凝胶电泳；GFP荧光；测序数据分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1急性CRISPR/Cas9介导基因敲除的向导RNA设计与验证 (A) 靶向目的基因外显子的两条向导RNA（gRNA）设计策略示意图。黑色箭头表示用于gRNA验证的模板制备过程中所用的PCR引物。BgRNA 效率的验证 体外PCR扩增的模板经RNP复合物消化。成功切割后，琼脂糖凝胶电泳可观察到两条不同大小的条带（左），而低效率的gRNA则模板保持未切割状态（右）。(C明场图像（左）、GFP荧光图像（中）及合并图像（右），显示人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在使用RNP复合物与GFP质粒进行核转染后3天的表达情况。比例尺： 350 µm. (D通过Sanger测序对GFP阳性细胞中扩增的DNA进行gRNA效率验证。当双链DNA成功被切割后，测序结果从gRNA靶向位点开始显示出重叠的信号峰（上图，KO1）；而在靶向未成功的情况下，DNA测序峰图与对照相比在gRNA靶向位点处无变化（下图，KO2）。 LACZ 对照 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="人脑类器官培养：切片、注射、电穿孔；实验示意图与结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：人皮质类器官切片后的电穿孔。（A）人皮质类器官（hCOs）电穿孔操作流程示意图。首先，将 hCOs 切成 500-µm 厚的切片。两天后，将含有 GFP 表达质粒和快绿（Fast Green）的核糖核蛋白（RNP）混合物注射至类器官外周区域优先形成的类脑室结构腔内。进行电穿孔时，将 hCOs 置于电穿孔室中。经过数天培养后，可在电穿孔区域检测到 GFP 信号。（B）hCOs 振动切片图像。将类器官包埋于培养基中含 3% 低熔点琼脂糖的琼脂块中（左）。将琼脂块切成 500-µm 厚的切片（中）。使用宽口移液吸头将切片后的类器官转移回培养皿中（右）。（C）将含有 RNP、pCAG-GFP 和 0.1% 快绿的混合物注射至类器官类脑室结构中的图像。类器官浸没于 Tyrode 溶液中，用细玻璃毛细管插入类脑室结构中心腔内（左）。使用镊子固定类器官（左和中）。以类器官外周的脑室为靶点（中）。注射后的类器官用宽口移液吸头转移至电穿孔室，或后续转移至培养皿中（右）。（D）电穿孔室图像，由一个玻璃培养皿和两个粘附在玻璃上的金属刀片构成。金属刀片作为电极，并带有用于连接电穿孔仪电缆的孔。通过绿色阴影可见的 hCO 注射侧应朝向阳极（正极，红色电缆）（右）。（E）具有发育良好类脑室结构的 hCOs 的代表性图像。较亮的环状区域代表类似脑室区的区域。类脑室结构中心的深色圆圈代表腔室，应作为注射靶点。（F）缺乏发育良好类脑室结构的 hCOs 的代表性图像，建议不将其用于后续实验。（G）注射电穿孔混合物后 hCOs 的代表性图像，其中可通过快绿染料观察到靶向区域（橙色箭头）。（H）电穿孔后 24 小时 hCOs 中天然 GFP 信号的代表性图像。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DAPI/GFP显微镜下的胚胎模式化阶段；细胞死亡、脑室形成分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：电穿孔处理的人类皮层类器官切片的免疫组织化学分析。（A）示意图显示一个带有绿色荧光信号的电穿孔人类皮层类器官（hCO）。（B）电穿孔后7天，经冷冻切片处理的hCO的DAPI染色（灰色）及GFP免疫荧光（绿色），可见多个电穿孔的脑室结构。（C-H）不同电穿孔结果的示例图像，经GFP（绿色）和细胞核（DAPI，灰色）染色。（C）一次理想的电穿孔结果，细胞核完整（见插图1，D），具有未受破坏的类脑室结构，且电穿孔细胞位于类器官外侧区域，该区域通常最为扩张。（E）显示电穿孔区域出现大规模细胞死亡的hCO示例（亦见插图2，D），表现为小而DAPI密集且形态扭曲的细胞核。（F）成功将电穿孔靶向类器官内部的示例，由于皮层板样区域与相邻脑室融合，通常较难解析。（G）电穿孔区域中心出现断裂的类脑室结构（橙色箭头）。（H）一个包含多个较小脑室的hCO示例，这些脑室部分融合，因此难以定量。（I）电穿孔7天后，对靶向LACZ（gLACZ KO，左侧）或PCGF4（gPCGF4 KO，右侧）的RNP复合物进行CRISPR/Cas9介导的基因敲除后，DAPI染色（灰色）、GFP免疫荧光（绿色）和PCGF4染色（洋红色）的结果。圈出的细胞显示PCGF4信号强度降低，表明基因成功敲除。在LACZ对照组（左侧）中可见均匀的信号。（J）该图显示了对照组（gLACZ KO）和PCGF4敲除组（gPCGF4 KO）GFP阳性细胞中PCGF4免疫荧光强度的定量结果，以gLACZ条件下的PCGF4中位表达水平为参照。每个点代表一个细胞。数据来自同一hiPSC细胞系的两个不同批次的3-4个类器官（灰色和黑色）。**** p &lt; 0.0001，Mann-Whitney检验。所有图像均使用激光扫描共聚焦显微镜（B，C）或荧光显微镜（E-I）采集。图像为10-15 µm厚z轴层叠的最大强度投影。白色虚线表示朝向脑室腔的顶面以及hCO的外表面。橙色虚线表示融合脑室中的VZ/SVZ边界。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体/染料</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1 mg/mL 储存液；1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：免疫荧光染色所用抗体与染料及其稀释比例。

本文介绍了通过电穿孔技术对人脑皮层类器官切片进行急性基因操作的方法。这些皮层类器官模型特别适合显微注射，因为切片后可轻易识别出类似脑室的结构，从而能够对人类皮层发育、神经发育障碍以及皮层进化进行功能研究。

人脑类器官已成为研究人类大脑发育、神经发育障碍以及人类大脑进化的重要工具。

我的研究团队致力于探究调控发育中大脑新皮层神经前体细胞基因表达的机制，尤其关注表观遗传学机制。这些机制对于神经前体细胞的增殖与分化潜能至关重要，因而也影响大脑的正常发育与功能。皮质类器官是令人兴奋的新型模型，使我们能够研究人类大脑的发育过程，同时也可用于模拟其他灵长类物种的发育。在本方案中，我们描述了对人类皮质类器官进行电穿孔以研究基因功能的方法。使用振动切片机将类器官切成薄片，使其更易于进行注射和电穿孔。对人类皮层类器官进行电穿孔是一种研究基因功能的强大技术。我们已利用该方法研究了灵长类动物特异性表达的生长因子EPIREGULIN，该因子参与了大脑发育与进化过程。我们还利用该方法研究了来自不同灵长类物种的增强子区域的活性。首先，将来源于人诱导性多能干细胞的人类皮层类器官包埋于3%低熔点琼脂糖中。随后使用振动切片机将类器官切成500微米厚的切片。切片后，将类器官继续培养于六孔超低吸附培养板中，每孔加入4毫升脑类器官培养基，并置于120 rpm的摇床上进行培养。接下来，将微毛细管拉制仪设置为指定参数，以拉制用于注射的硼硅酸盐玻璃毛细管。拉制完成后，将毛细管存放于大型培养皿中，并用胶带固定。 电穿孔当天，将台氏液预热至37摄氏度，并将CRISPR Cas9核糖核蛋白（RNP）配制为终浓度24微摩尔。将pCAG-GFP质粒和0.1%快绿溶液（溶于水）加入终末注射混合液中。选择具有发育良好、类似脑室结构的人类皮层类器官，弃去缺乏此类结构的类器官。将最多10个类器官转移至含有台氏液的6厘米培养皿中。使用微加载枪头，用玻璃微毛细管吸取10 µL注射溶液。用镊子夹断毛细管的细端，打开毛细管。通过将部分注射混合液释放到Tyrode溶液中，检查毛细管是否通畅。将毛细管插入类心室结构的中心，踩下显微注射仪的脚踏开关，注入0.2–0.5 µL的混合液。使用精细镊子轻推类器官以限制其移动，但不要夹住它。注射后，使用宽口径移液器吸头将一至两个已注射的类器官转移至含有台氏液的电穿孔室中。将类器官的注射侧朝向电极，并确保其顶端正中放射状胶质细胞及类似脑室的区域朝外。将电穿孔室的导线连接好，使类器官的注射侧面向正极。按下电穿孔仪上的脉冲按钮，以38伏特电压、每次50毫秒，间隔1秒，共施加五次脉冲。电穿孔后，将人脑皮层类器官放回四种脑介质3中，在不摇动的条件下培养24小时。对电穿孔后的人脑皮层类器官进行固定和冷冻切片处理，随后在70摄氏度的水浴中用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，持续1小时，以用于免疫组织化学分析。用 PBS 清洗切片一次，持续五分钟。然后将载玻片短暂干燥，并用蜡笔圈住切片区域。在室温下用 PBS 中的 0.1 摩尔甘氨酸封闭切片 30 分钟。然后用 PBS 洗涤切片两次，每次五分钟。在切片上加入封闭缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。随后将切片在 4 摄氏度下与一抗孵育过夜。第二天，用 PBS 清洗切片三次，每次五分钟。在室温下，将切片与二抗及 DAPI 在封闭缓冲液中孵育一小时。用 PBS 清洗切片后，使用封片剂封片，并用荧光显微镜观察切片。电穿孔类器官的免疫组织化学结果显示，在一个经过电穿孔处理的皮质类器官中存在多个被靶向的室腔结构，最佳电穿孔条件可靶向位于类器官外周区域的类似室腔的结构。若观察到大量细胞死亡，则需要进行故障排除。这可能是由于质粒浓度过高或电穿孔参数设置不当所致。由于类器官内部的皮质板样区域与相邻脑室融合，朝向类器官内部的电穿孔往往更难以解释。当注射体积过大或施加过强的电脉冲时，可能会破坏顶膜表面，导致脑室破裂和细胞分层脱落。通过免疫组织化学染色证实了多梳抑制复合物1蛋白PCGF4的敲除，结果显示GFP阳性细胞中的信号强度降低。GFP阳性细胞的信号强度分析显示，与对照组相比，敲除样本中PCGF4蛋白水平显著降低。

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