评估缺血性脑卒中大鼠模型中细胞死亡信号通路的免疫荧光方法

缺血性卒中是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因。我们的研究聚焦于卒中的药物靶点，尤其关注一些新兴靶点，例如 RUNX1 和组织蛋白酶（cathepsins）。为了评估这些靶点的作用，我们通过阻塞大脑中动脉建立了大鼠缺血性卒中模型。

我们通过插入尼龙丝阻塞大脑中动脉，建立大鼠缺血性脑卒中模型。大脑中动脉阻塞模型是目前临床前脑卒中研究中最常用的啮齿类动物模型，常与其他技术结合使用，例如TTC染色、免疫荧光和TUNEL染色。我们可以通过整合性方法探索脑卒中的病理生理机制。在免疫荧光实验中存在一些技术挑战，例如抗体的特异性、降低荧光背景信号，以及通过优化荧光标记物和特异性抗体的特性来提高信噪比。免疫荧光技术使我们能够深入理解细胞结构的复杂格局，以及在大脑中动脉阻塞模型中发生的分子相互作用。

在卒中的适当时间窗内，部分脑组织可能得以挽救。我们的结果表明，在大脑中动脉闭塞后的大鼠脑组织中，组织蛋白酶B的表达被激活，同时伴随细胞凋亡增加。对细胞死亡信号机制的进一步研究可能为药物开发提供新的靶点。

在未来的研究中，我们将继续探索炎症通路和细胞死亡信号转导中的潜在分子靶点。我们希望实验研究发现的这些靶点能够转化为临床治疗手段，从而提高脑卒中患者的生存率和生活质量。

[旁白] 首先，将麻醉后的大鼠置于仰卧位，并使用控温加热垫和直肠温度监测探头将其体温维持在 36.5 °C。剃除颈部皮肤的毛发，并使用碘伏消毒液进行消毒。接着，在颈部做一条 2 cm 的正中切口，牵开软组织以暴露颈动脉血管。使用镊子分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。使用缝线结扎右侧近端 CCA。然后用微型夹在起始处夹闭右侧 ICA 和 ECA。通过 CCA 上的一个小切口，将一端带有圆形硅胶头的尼龙单丝线插入 CCA 管腔，并在 CCA 上打结以防止出血和单丝线脱落。打开右侧 ICA 的微型夹，将单丝线经 ICA 残端插入右侧大脑中动脉（MCA），直至硅胶头阻塞 MCA 起始部。剪除暴露在外的尼龙单丝线部分，并缝合颈部正中切口。在 MCA 阻塞两小时后，打开颈部切口，解开 CCA 上的结扎线，然后撤出尼龙单丝线以实现 MCA 再灌注。术后，将大鼠置于配备控温加热垫的加热笼中，观察其从麻醉中恢复的情况。使用 Zaya Long 行为评分量表，在大脑中动脉阻塞（MCAO）后 2 小时及再灌注后 22 小时评估神经功能。从 MCAO 模型大鼠中取出全脑，于 -20 °C 冷冻 20 分钟。将冷冻脑组织切成六片冠状切片，每片间隔 2 mm。在避光条件下，于 37 °C 使用 2% TTC 染色 15 分钟。然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定脑切片 24 小时。使用设置为近距离物体自动模式的数码相机拍摄染色后的切片图像。将图像传输至计算机，并使用 ImageJ 软件测量梗死面积。梗死面积计算为六片切片中梗死区总面积与相同切片中全脑总面积之比。与假手术组无梗死相比，MCAO 组观察到显著的梗死区域。对于免疫荧光分析，将 MCAO 模型大鼠的完整脑组织用 4% 多聚甲醛在室温下固定 24 小时。随后将脑组织依次置于 10%、15% 和 30% 蔗糖溶液梯度中脱水，直至组织沉底。将脱水后的脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并去除任何气泡。将脑组织在液氮中速冻。在冷冻切片机上以 5 µm 厚度切片。将冷冻脑切片在室温下平衡后，用无菌 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。使用免疫组化笔勾画组织轮廓，然后在室温下用含 20 µg/mL 蛋白酶 K 和 0.3% Triton X-100 的溶液孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤切片后，向轮廓区域加入 3% BSA，在室温下封闭孵育 1 小时。弃去封闭液，加入适当的一抗，于 4 °C 避光孵育过夜。次日，用含 0.1% Tween-20 的无菌 PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。加入与所需荧光染料偶联的适当二抗，在湿盒中避光孵育 1 小时。用含 Tween-20 的 PBS 洗涤后，用含 DAPPI 的封片剂封片。在荧光显微镜下，设定激发波长为 488 nm，发射波长为 520 nm，曝光时间为 500 ms，以获取染色脑切片图像。与假手术组相比，MCAO 组缺血核心区的组织蛋白酶 B 免疫反应性显著升高。与假手术组相比，MCAO 组半暗带皮层的组织蛋白酶 B 免疫反应性也显著升高。缺血核心区与半暗带皮层之间的组织蛋白酶 B 免疫反应性无显著差异。首先，将 MCAO 模型大鼠经多聚甲醛固定的脑切片依次置于浓度递增的乙醇中脱水，每次 35 至 50 分钟。然后用透明生物试剂 1（松油油型）处理脑切片 35 至 50 分钟，再用透明剂 2 处理 35 至 50 分钟，直至组织完全透明。随后将脑切片依次浸入包埋介质 1、2、3 和 4 中，每种介质各 60 分钟。将脑切片放入包埋盒中，密封后置于冷藏环境中使其凝固。使用切片机先以 10 µm 厚度修片，再以 5 µm 厚度切片。将组织切片在 45 °C 水浴中漂浮 30 秒，然后转移至载玻片上。干燥后，用透明剂对脑切片进行两次脱蜡处理，每次 10 分钟。然后用浓度递减的乙醇溶液对脑切片进行再水化。接着用 PBS 漂洗切片三次，每次 5 分钟。去除多余水分后，向每张切片加入 100 μL 蛋白酶 K，在 37 °C 孵育 20 分钟。PBS 洗涤后，向每个样本加入 100 μL 末端脱氧核苷酸转移酶平衡缓冲液，在湿盒中 37 °C 孵育 10 至 30 分钟。用吸水纸吸去缓冲液，加入 50 μL TUNEL 检测试剂盒中的标记工作液。接着向切片加入 DAPPI 工作液，在避光条件下孵育 5 分钟以复染细胞核。用 PBS 漂洗样本四次，每次 5 分钟。去除多余液体后，用抗荧光淬灭封片剂封片。使用 Vectra Polaris 多光谱成像系统扫描染色载玻片。TUNEL 染色显示，MCAO 组半暗带皮层中 TUNEL 阳性细胞数量较假手术组显著增多，表明细胞凋亡显著增加。