衰老过程中 秀丽隐杆线 虫线粒体形态的成像和定量
January 17th, 2025
该协议提供了一种标准化方法，用于对 秀丽隐杆线虫 衰老过程中多个组织中的线粒体形态进行成像。
该协议提供了一种标准化的方法来成像和量化多个组织中线粒体形态的变化。在 C 优雅中，线粒体形态通常与其功能有关。在各种疾病条件下和随着衰老的进展，可以观察到线粒体形态的变化，这通常与线粒体功能的失调、不同的组织有关，并看到优雅。
表现出独特的线粒体结构，需要不同的成像策略。因此，选择合适的显微镜和优化样品制备对于线粒体和 C Elegance 的成功组织特异性成像至关重要。在这里，我们选择使用表达线粒体定位 GFP 的转基因囊出菌株，而不是传统的线粒体染料。
这使我们能够避免脱靶效应、onal bi 外显率以及使用染料可视化不同组织中线粒体所需的复杂样品制备步骤。我们实验室的主要重点是研究压力和衰老过程中的线粒体稳态。标准化线粒体成像方案对于最大限度地减少精神外误差并产生有关各种生物条件下线粒体形态变化的可重复结果至关重要。
首先，获得干净的载玻片。对于样品制备，在载玻片上加入 10 至 20 μL M Nine 溶液，并在溶液中放入所需数量的特定年龄的成虫。在载玻片上，用盖玻片覆盖 M nine 溶液中的蠕虫以对肌肉进行成像。
线粒体，轻推盖玻片以滚动蠕虫。然后用指甲油密封盖玻片的侧面，以防止 M 9 溶液蒸发。使用标准的宽视场显微镜对表达荧光标签的肌肉和表皮线粒体进行成像。
使用共聚焦显微镜对肠道线粒体进行成像，并优化成像设置以适应特定的实验设置。要开始分析，请在安装后打开 Fiji 应用程序以下载并安装 mito 映射器宏。首先，下载源码 1。
复制 A IJM code for MIT mapper 1.0 下列出的代码。打开 Fiji，然后转到 plugins，然后按 new 和 macro 将复制的代码粘贴到宏窗口中。然后通过 file 保存宏以备将来使用并另存为。
导航到文件，然后打开以打开带有 Zs.In Fiji 的 3D 显微图像，在图像下创建最大投影，然后是堆栈和 Z 项目。选择聚焦图像中的切片范围以进行最大投影，然后选择最大强度作为投影类型以保存最大投影图像。作为 tiff，转到 file 并单击 Save as （另存为 ），然后单击 tiff。
使用矩形工具从完整图像中裁剪感兴趣的区域，然后导航到图像并裁剪。转到文件，然后另存为 和 tiff 以 Tiff 格式保存裁剪图像。将之前保存的 mito 映射或宏文件拖放到 Fiji 工具栏上。
单击 run（运行）。出现提示时，选择包含上一步中保存的 TIFF 文件的文件夹。当系统提示选择区域时，使用矩形工具在图像中创建一个矩形，然后按 确定 确认。
最后，转到文件并将包含与线粒体形态相关的所有值的数据保存为点 CSV 文件。线粒体形态是组织特异性的，管状线粒体与肌肉中的肌肉纤维对齐，在肠道中相互连接的网状结构，并且更圆或椭圆形。与复合显微镜相比，使用共聚焦显微镜进行皮下成像中的线粒体通过减少离焦光改善了肠道线粒体的可视化。
在玻片上，线粒体在 M 9 缓冲液中 30 分钟后显示碎裂，表皮线粒体显示最明显的碎裂。衰老导致所有组织中的线粒体碎裂，表现为截短和球形结构。MIT mapper 定量表明肌肉中的物体长度发生了变化，皮下组织的连接点发生了变化。
概述
本协议建立了一种标准化方法，用于在衰老过程中对秀丽隐杆线虫的多种组织中的线粒体形态进行成像和定量分析。该研究强调了线粒体结构与功能之间的关系，展示了形态变化如何响应衰老和疾病。
关键研究组成部分
研究领域
- 线粒体形态
- 衰老
- 秀丽隐杆线虫作为模式生物
背景
- 线粒体形态对其功能至关重要。
- 形态的改变可能表明疾病状态和衰老进程。
- 秀丽隐杆线虫的不同组织对成像有独特的要求。
使用的方法
- 使用表达线粒体定位GFP的转基因秀丽隐杆线虫进行荧光成像。
- 秀丽隐杆线虫
- 广场和共聚焦显微镜用于组织特异性成像。
主要结果
- 记录了组织特异性的线粒体形态。
- 衰老导致所有组织中可观察到的碎片化。
- 定量分析揭示了线粒体结构的显著变化。
结论
- 该研究展示了一种评估秀丽隐杆线虫线粒体变化的可靠方法。
- 理解这些动态过程可以推进对衰老和线粒体功能障碍的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of mitochondrial morphology in C. elegans enables high-confidence assessment of organelle dynamics during aging, supporting early discovery and mechanistic de-risking in metabolic and age-related disease research. Standardized protocols and robust quantification reduce variability, enhancing predictive confidence for target validation and translational continuity. This approach strengthens portfolio decisions by providing reproducible, tissue-specific mitochondrial phenotyping across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial structural changes linked to functional decline during aging.
- Supports biological de-risking by distinguishing tissue-specific mitochondrial phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for metabolic and aging-related pathways.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging protocols for downstream phenotypic screening.
- Standardizes quantification of mitochondrial morphology using single-copy GFP constructs and mitoMAPR analysis.
- Enables reliable comparison of compound or genetic perturbations on mitochondrial structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial phenotypes in C. elegans with disease-relevant cellular changes observed in higher organisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-tissue and cross-age comparisons.
- Reduces translational risk by providing quantitative, tissue-specific readouts of mitochondrial health.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, supporting robust mitochondrial phenotyping at each stage.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven assessment of mitochondrial dynamics and pathway clarification during aging.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Provides objective morphological measurements and CSV data for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of mitochondrial biomarkers between C. elegans and mammalian systems when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse tissues and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust mitochondrial phenotyping.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, transgenic C. elegans handling, and image analysis.
- Needs access to wide field and confocal microscopes, as well as Fiji software with mitoMAPR macro.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and sample preparation.
- Adaptable to multiple tissues but may require optimization for specific experimental setups.
- Potential limitations include tissue-specific imaging challenges and time-dependent morphological changes ex vivo.
