Name: 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌异质表型的延时落射荧光显微镜成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解延时落射荧光显微镜技术用于观察铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的持留细胞异质表型。该方法可揭示细菌在抗生素治疗中的存活策略，为改进临床感染治疗提供基础。

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感谢康涅狄格大学健康中心细胞分析与建模显微镜设施的 Susan Staurovsky 女士在显微镜实验方面提供的帮助。感谢 Mona Wu Orr 博士以及葡萄球菌遗传学与代谢基础研讨会提供关于在 P. aeruginosa 和 S. aureus 中进行克隆的实验方案与建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH；资助号：DP2GM146456-01 和 1R01AI167886-01A1，授予 W.W.K.M.；1F30DE032598-01A1，授予 P.J.H.；1F31DK136259-01A1，授予 T.J.L.）的经费支持。资助方未参与本实验的设计或本稿件的撰写。

Visualizing Antibiotic Persistence in Bacterial Pathogens

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作者声明无利益冲突。

我们发现，延时显微成像实验的成功取决于琼脂糖垫的质量及其在整个成像过程中的稳定性。由不锈钢腔室封装的琼脂糖垫制备相对简便，可获得始终平整的样品，能够在数十小时内稳定成像。这使得单次实验可对数万个细胞进行成像，提高了在细胞群体中检测到罕见表型变异体（如持留细胞）的可能性。
这种琼脂糖垫制备方法为此前发表的方法提供了一种易于实施的替代方案。本方案无需微流控装置制备所需的技术精度，也无需熟练操作琼脂糖&#34;三明治&#34;法，因而更易于实现批次间一致的样品制备14,16,36。此外，该系统具有成本效益。不锈钢培养室可高温灭菌并重复使用（不同于一次性塑料培养室），且整个装置无需特殊设备16,37。通过使用市售的载物台插入件，该培养室可轻松适配不同的显微镜系统。另外，由于细菌被固定在琼脂糖与盖玻片的界面处，我们已成功实现了对高度运动性细菌（如P. aeruginosa）的追踪，同时仍能观察其形态变化（图&#160;4，补充视频 4）。其他单细胞成像技术，例如&#34;母系机器&#34;，将细胞限制在微通道内，因而无法观察除丝状化以外的其他形态变化36。
要成功实施本方案，需注意一些关键步骤和参数。在制备琼脂糖垫时，必须充分加热并完全融化琼脂糖，因为残留的琼脂糖晶体将引起光散射，影响成像质量。同样，在将琼脂糖移入成像腔室时，必须小心操作，避免引入气泡。为确保琼脂糖垫厚度一致并减少样品漂移，应在开始成像前，将琼脂糖垫置于加湿且温度可控的环境中平衡，通常为15分钟。另一个可能影响成像质量的因素是湿度控制：湿度过低会导致琼脂糖垫脱水收缩，而湿度过高（或腔室内样品加热不当）则可能导致暖空气在样品表面冷凝，从而干扰成像。因冷凝导致成像质量不佳的时间序列成像示例见&#160;补充视频8。
当前设置的一个局限性在于无法更换培养基，这阻碍了在抗生素处理前、处理期间和处理后对单个细菌进行连续追踪。我们预计，将琼脂糖垫与允许培养基交换的流动池或微流控装置相结合，可实现对种群在营养或环境变化过程中的追踪。当前设计中另一个可改进的参数是样品的通气性。可更换盖玻片培养皿的O形圈密封、螺旋盖设计，相较于需要使用石蜡或油脂类密封剂来密封琼脂糖垫的装置，能够提供更好的样品通气性16。然而，密封腔室内的通气性可能仍然有限，或许无法支持专性需氧菌的生长，尽管这一点仍有待验证。
本文介绍的延时成像样品制备方案可实现对数千个细菌在应对或恢复抗生素处理过程中的动态追踪。该方法具有高度通用性，其应用范围远不止于持留菌生物学研究。例如，琼脂糖垫与分隔装置的设计允许接种空间上分离的细胞样品，同时通过琼脂糖垫的扩散作用实现细胞间的通讯。我们目前正在探索该装置在研究多种微生物群落中分泌产物交换如何影响细胞生长方面的潜力。我们预期，该方案将为新进研究人员开展延时显微镜研究提供较低的技术门槛，同时也为经验丰富的微生物学家提供无限的实验变体探索空间。

细菌病原体可通过两种主要机制逃避抗生素的作用：一种是涉及遗传改变的抗生素耐药性，另一种是涉及非遗传改变的表型耐受性。抗生素耐药性是一种由基因编码的现象，赋予特定细菌细胞在抗生素存在条件下不仅存活而且进行复制的能力1。表型耐受性包括对抗生素耐受或持留的细菌，其发生在细胞能够经受杀菌性抗生素处理，但并未获得在抑制浓度抗生素存在下复制的能力时1,2。耐受性与持留性的区别在于，耐受性指的是整个菌群具有在治疗中存活的能力，而持留性则指在一个基因型相同但表型异质的菌群中，有一小部分亚群能够在抗生素治疗中存活。当对克隆培养物使用杀菌性抗生素，并将培养物中存活下来的细菌数量随时间以对数-线性标度作图时，若存在持留菌，通常会观察到双相曲线。在这些曲线上，第一阶段显示大部分菌群被相对较快地杀死，第二阶段则表明抗生素持留亚群被杀死的速度更慢，甚至完全不被杀死1,2。
抗生素耐受性对全球医疗系统构成了重大负担。例如，本文重点关注的Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa耐受菌，被认为可导致对抗生素治疗不敏感的感染，包括囊性纤维化患者中反复发作的呼吸道感染以及慢性伤口感染3,4。因此，进一步阐明耐受细胞的生物学特性及其表型调控程序至关重要。尽管在理解耐受菌的形成与复苏机制方面已取得进展，但关于单个细胞中代谢重编程与分子事件协调运作以维持耐受性的关键知识仍存在空白5,6,7,8。
有效研究持留现象已被证明是一项技术上的挑战。由于持留现象仅在细菌群体的一小部分亚群中可被观察到，因此那些针对整体细菌群体进行取样的技术往往无法捕获相关的生物学信息1,2,8,9,10。此外，由于导致持留的表型变化是短暂的且不可遗传，追踪持留细胞命运的过程可能十分复杂1,8,9,10,11。一旦细菌持留细胞恢复生长，它们可以分裂并产生持留和非持留两种子代细胞，这使得通过培养手段无法富集得到纯的持留细胞群体。这些挑战凸显了对满足以下两个条件的技术需求：1）能够获取活体单个细胞的生物学信息；2）能够与荧光染料、探针、传感器和报告系统联合使用，以便随时间推移对异质群体中单个细胞的表型进行检测。
单细胞技术的最新进展为有效研究细菌异质性以及克服持久性研究中的这些障碍提供了途径12,13。其中一些技术包括荧光显微镜、流式细胞术/荧光激活细胞分选、微流控技术以及单细胞RNA测序12,13。本文描述了利用转录或翻译报告菌株进行落射荧光延时显微镜观察，以阐明单细胞持久性生理特性的实验方案。荧光显微镜是一种强大的技术，能够满足研究持久性表型的关键标准，即识别在大量细胞群体中，哪些单个细胞在抗生素去除后能够继续增殖，从而被定义为持久性细胞。随着自动成像技术和恒温培养腔的引入，活体细菌细胞的动态观察已在微生物学领域广泛普及。尤为重要的是，延时显微镜能够在数小时甚至数天的时间内实时观察单个细胞，从而实现对抗生素处理前、处理中和处理后细菌行为的连续追踪14,15,16。利用延时显微镜开展的这些研究有望深入揭示持久性生物学的复杂机制。

<table><tbody><tr><td>BaSiC</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>认证分子生物学琼脂糖</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>可更换盖玻片培养皿</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>用于制备琼脂糖垫的35 mm ICD；配有30 mm（#1.5）盖玻片</td></tr><tr><td>Lumencor Spectra 7 LED光源系统</td><td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7 LED光源系统</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>分子设备公司</td><td>Premier version 7.10.5</td><td></td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 bi sCMOS相机</td><td>Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>sCMOS相机</td></tr><tr><td>PeCon活细胞培养室</td><td>peCon</td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Scientific圆形盖玻片，#1.5厚度，25 mm，每包100片</td><td>费希尔科技</td><td>NC1272770</td><td>25 mm（#1.5）盖玻片</td></tr><tr><td>蔡司Axiovert 200M显微镜</td><td>蔡司</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>倒置显微镜，配备Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27物镜、Lumencor Spectra 7 LED光源系统和pco.edge 4.2 bi sCMOS相机（像素尺寸6.5 mm）</td></tr></tbody></table>

延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 staphylococcus aureus 异质性表型

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

抗生素耐受性是指在遗传上易感的细菌群体中，有少数细菌细胞能够在杀死其他遗传相同细胞的抗生素处理下存活的现象。一旦抗生素治疗结束，这些耐受性细菌可以恢复复制，通常被认为与临床治疗失败有关。&#160;&#160;近年来，研究人员利用延时荧光显微镜技术取得了进展，该技术通过使用荧光转录报告基因、翻译报告基因和/或针对多种细胞特征的染料对细菌进行标记，使我们对大肠杆菌（Escherichia coli）耐受菌的理解超越了仅通过群体水平抗生素存活实验所能获得的信息。相较于整体群体检测，此类单细胞研究方法对于阐明耐受菌形成机制、损伤应答及存活过程至关重要。然而，在其他重要致病菌物种中，仍缺乏在如此精细水平上研究耐受菌的有效方法。
本研究提供了一种可调节的方法，用于在抗生素处理及恢复期间对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，一种革兰氏阴性杆菌）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，一种革兰氏阳性球菌）进行延时成像。&#160;我们讨论了将荧光报告基因引入这些细菌的分子遗传学方法。利用这些报告基因以及染料，我们能够追踪单个细胞在抗生素处理下的表型变化、形态特征及其命运。此外，我们还能观察到持留菌个体在治疗后复苏过程中的表型。总体而言，本研究为关注临床重要病原体中单个抗生素处理细胞（包括持留菌）在治疗期间及治疗后存活情况和基因表达动态的研究者提供了有价值的参考资源。

将报告质粒成功导入铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的标志是在相应的选择性抗生素培养基上生长，可通过菌落PCR和/或测序进一步确认。应通过使修饰后的菌株处于已知可诱导目标基因表达的条件下，验证其作为表型报告菌株的特性，并通过流式细胞术、分光光度法或落射荧光显微镜检测其产生的荧光信号（图1）。
为便于选择后续实验所用的抗生素剂量，需进行浓度依赖性抗生素持留菌检测 P. aeruginosa 或 S. aureus 感兴趣的菌株。浓度依赖性实验通常会产生双相曲线，在较低抗生素浓度下呈现陡峭的初始斜率，而在较高浓度下则趋于平缓或斜率减小。然而，对于某些抗生素-物种组合，可能不会出现明显的双相曲线。例如，以下曲线 S. aureus d依拉法洛沙星曲线明显呈双相图3A），但 P. aeruginosa 左氧氟沙星曲线不是（图3B)15在此情况下，我们应选择至少为 MIC 的 10 倍浓度（例如， 5 µg/mL，约为 MIC 的 15 倍 P. aeruginosa)15然而，由于15倍左氧氟沙星MIC仅导致约0.001% P. aeruginosa 幸存者，我们使用 1 µg/mL 左氧氟沙星处理，以便在对细胞于无抗生素琼脂糖垫上恢复时进行成像观察持留菌补充视频 6）；否则，成像多个持留细胞所需的视野数量将变得过多而不切实际。
成像开始时，理想的样品和琼脂糖垫制备应在整个视野中保持平整，无大块碎屑、褶皱或气泡，并且单细胞分布均匀。获得分布良好的单细胞可能需要优化样品稀释倍数或重悬条件。对于 S. aureus细胞倾向于形成小团簇，因此在接种至琼脂糖垫前需充分涡旋混匀。图4 和 图5）。对于 P. aeruginosa细胞可能在悬浮液中形成被黏性细胞外基质包裹的聚集体；成像单个细胞前，必须充分吹打样品以彻底分散这些聚集体。 
成像实验结束后，成功的时间序列图像应保持清晰对焦、照明稳定，并在整个实验过程中于x-y平面内漂移极小。补充视频7展示了一次理想的图像采集过程：t为补充视频4中在进行阴影或漂移校正前的相差通道图像。如果因湿度过高或样品预热不足导致冷凝，使水滴在顶部25 mm的盖玻片上形成，从而改变光线路径并使焦平面超出自动对焦算法的最大搜索范围，则可能发生失焦（见补充视频8）。照明不均通常表明成像时浸油不足。若载物台移动过快，物镜上的浸油可能滞后，在图像采集时仍未完全到位。可通过调整采集参数以降低移动速度，或在移动至下一位置后与图像采集之间增加暂停时间来缓解此问题。显著的样品漂移表现为视野中许多细胞呈条带状移动，而部分细胞保持原位（见补充视频9）。此类情况通常在实验后期出现，原因是琼脂糖垫因湿度控制不足而脱水。本文所介绍的琼脂糖垫制备方法旨在提高样品稳定性，但要实现最佳图像采集，仍需对样品及其周围环境进行充分的预热和加湿。
<img alt="持留细胞显微镜观察；基因表达水平随时间变化的荧光焦点；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：荧光报告菌株用于显示目的基因的表达情况。（A）根据方案1，将S. aureus转导携带目的基因的GFP转录报告系统。报告菌株经抗生素处理24小时后，用PBS洗涤，随后接种于由CA-MHB琼脂糖垫（含碘化丙啶1.6 µM和氯霉素10 µg/mL，用于维持报告质粒）制成的载玻片上，用于恢复期间的成像观察（补充视频1）。（B）将携带与mScarlet连接的目的蛋白翻译报告系统的质粒转化至P. aeruginosa中26。报告菌株经抗生素处理5小时后，用PBS洗涤，随后接种于由BSM琼脂糖垫（含四环素Tet 75 µg/mL，用于维持报告质粒）制成的载玻片上，用于恢复期间的成像观察（补充视频2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="琼脂平板上的细菌生长、稀释系列、菌落观察、微生物实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：噬菌体的扩增与收集。 （A）这六个平板显示了在金黄色葡萄球菌（S. aureus）RN4220 菌苔上接种的六种不同稀释浓度的噬菌体原液。红色轮廓标出了将被收集的三个平板，从溶菌斑最明显的平板（粗红轮廓；1×109 PFU/mL）开始，依次为接下来的两个稀释度（1×108 和 1×107 PFU/mL）。黑色箭头指向单个噬菌斑。（B）为从平板中收集噬菌体，需刮取软琼脂层（左），将悬液转移至下一个稀释度的平板（中），待将三个平板的软琼脂混合后，合并至锥形管中进行离心（右）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="存活率与抗生素浓度关系图，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，药物疗效分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3代表性浓度依赖性持留菌检测实验。 浓度依赖性氟喹诺酮类药物在静止期的持续作用被评估（A) S. aureus （针对德拉沙星）和（B) P. aeruginosa （针对左氧氟沙星）。后续实验采用 5 µg/mL 德拉沙星（红色圆圈）因为 S. aureus 杀伤效应在此浓度下已达到平台期。剂量为 至少 1 µg/mL 左氧氟沙星（红色圆圈）将用于后续实验 P. aeruginosa请注意，细菌杀灭作用并未达到平台期 P. aeruginosa，但仍存在较平缓的双相曲线“第二相”，表明有持续存在的亚群。图3B经Hare等人许可改编。15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="S. aureus 和 P. aeruginosa 的延时显微镜图像，显示随时间变化的PI+细胞情况。包含示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：抗生素处理期间细菌表型的成像。将静止期的（A）S. aureus 和（B）P. aeruginosa 细胞接种到含有氟喹诺酮类抗生素的琼脂糖垫上，并在治疗过程中进行监测：S. aureus 使用5 µg/mL的德拉沙星（补充视频3），P. aeruginosa 使用5 µg/mL的左氧氟沙星（补充视频4）15。在琼脂糖垫中加入碘化丙啶（PI；P. aeruginosa 为16 µM，S. aureus 为1.6 µM）以标记死亡或即将死亡的细胞。S. aureus 细胞在氟喹诺酮存在下基本保持完整且存活，而大多数P. aeruginosa 细胞则经历显著的形态学变化，包括形成圆形的球状体，随后裂解并死亡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长延时显微镜图像，细菌增殖。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：恢复期间持留菌的追踪。 （A）S. aureus 和（B）P. aeruginosa 菌群在经氟喹诺酮类药物处理后（S. aureus 使用 5 µg/mL 德拉沙星，P. aeruginosa 使用 1 µg/mL 左氧氟沙星），接种于含新鲜培养基的琼脂糖垫上，并在治疗后恢复期间进行监测（补充视频 5 和 补充视频 6）。各图中前两帧所示的持留菌以绿色箭头标出，这些细胞在抗生素处理期间保持完整且具有活性。经过一段初始滞后期后，持留菌开始分裂并产生新的子代（以绿色圆圈标示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="盖玻片制备和细胞接种过程、显微镜研究的装置示意图及组件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：显微镜样品制备。（A）使用可更换盖玻片培养皿（“腔室”）的样品制备流程示意图。 （B）拆解状态下的腔室及其各个组件的照片。（C）完全组装好的腔室照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充视频 1：S. aureus持留菌。 该视频文件包含图 1A中的图像。简言之，携带目的基因GFP转录报告系统的S. aureus经抗生素处理24小时后，用PBS洗涤，随后接种至含有CA-MHB、碘化丙啶（1.6 µM）和氯霉素（10 µg/mL）的琼脂糖垫上，用于恢复期间的成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2：P. aeruginosa 持留菌。 该视频文件包含图 1B中的图像。简言之，携带与 mScarlet 融合的感兴趣蛋白翻译报告系统的 P. aeruginosa 经抗生素处理 5 小时，用 PBS 洗涤后，接种于含有 BSM 及 Tet（75 µg/mL）的琼脂糖垫上，用于恢复期间的成像26。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 3： S. aureus 在抗生素治疗期间。 对数期培养物 S. aureus 在富含化学成分明确的培养基中培养的细胞被接种到由该培养物的无细胞条件培养基制成的琼脂糖垫上，并加入碘化丙啶（propidium iodide）1.6 μM）和德洛沙星（delafloxacin）5 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 4：P. aeruginosa在抗生素处理期间的图像。 将在 BSM 中培养至稳定期的 P. aeruginosa 接种到琼脂糖垫上，该琼脂糖垫由平行培养的 P. aeruginosa 在 BSM 中产生的无细胞条件培养基制备而成；琼脂糖垫中还含有碘化丙啶（16 µM）和左氧氟沙星（5 µg/mL）。本视频经 Hare 等人15许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 5：S. aureus在抗生素处理后的恢复过程。S. aureus 在富含营养的化学成分明确培养基中培养至稳定期。将稳定期的菌液在试管中用 5 µg/mL 的德拉沙星处理 24 小时，随后用 PBS 洗涤，并接种到含有碘化丙啶（1.6 µM）且不含抗生素的 CA-MHB 琼脂糖凝胶垫上进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 6：P. aeruginosa在抗生素处理后的恢复过程。 将在 BSM 中培养至稳定期的 P. aeruginosa 菌液用 1 µg/mL 左氧氟沙星在试管中处理 7 小时，随后用 PBS 洗涤，并接种到含有碘化丙啶（16 µM）且不含抗生素的 BSM 琼脂糖凝胶垫上进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 7：最佳图像采集示例。 本视频为补充视频 4在图像处理前的相差通道，用以展示一次理想的延时成像采集过程。请注意实验全程中漂移极小、照明稳定，并始终保持良好的聚焦状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 8：由于冷凝导致图像采集不佳的示例。 本视频展示了一次实验的部分过程，其中图像采集受到焦点不良的影响，原因可能是样品加热不当和/或成像环境湿度过高，导致成像腔室内出现冷凝现象。所成像的样品为在BSM琼脂糖垫上进行抗生素后恢复期间的左氧氟沙星处理的P. aeruginosa。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频9：因漂移导致图像采集不理想的示例。 本视频展示了一次实验的部分过程，其中图像采集受到样本漂移的影响，原因可能是样本脱水以及琼脂糖垫从盖玻片上收缩或翘起。正在成像的样本为含有左氧氟沙星和碘化丙啶的琼脂糖垫上的P. aeruginosa。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件 1：25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

在本论文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于评估铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素存活能力，通过将质粒转化至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）中构建报告菌株，并利用延时落射荧光&#160;显微镜观察&#160;表型变异体（如持留菌）。

延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

抗生素持留现象是指在遗传学上易感的细菌群体中，有少量细菌细胞能够在抗生素治疗下存活……

我们实验室的研究重点是探究抗生素为何会失效。具体而言，我们关注细菌群体中少数被称为持留菌的细胞，这些细胞本应被抗生素杀死，但却能够在抗生素治疗中存活下来。目前认为，这些持留菌会导致感染在抗生素治疗结束后复发。因此，我们希望研究这些持留菌的基因表达和代谢情况，以更深入地理解其生存策略。目前持留菌研究领域面临的一个挑战是如何在通量与单细胞灵敏度之间取得平衡。我们需要将单个细胞在处理后仍具有分裂能力（这一特性可将其定义为持留菌）与其某种可测量的表型相对应，从而帮助我们揭示细胞内部的运作机制。为了捕获单个持留细胞，我们可能需要对数千个细胞进行这样的操作。与不精确的琼脂三明治方法或微流控装置的制备相比，我们的方案更易于实施，而后者在技术上具有较大挑战性。我们发现，该方案在随时间推移的成像过程中具有良好的可重复性和稳定性，且所需材料极少，这意味着它在高质量数据采集方面既经济又几乎不产生浪费。我们的未来研究将结合组学与单细胞技术，以研究病原体如何响应并从不同类别的抗生素治疗中恢复。我们的最终目标是利用这些理解，开发出改进临床感染治疗的新策略。首先，将一个无菌的30毫米盖玻片放入可更换盖玻片培养皿的不锈钢底座底部。将聚碳酸酯插入件轻轻插入底部，确保盖玻片构成腔室的基底，并通过压缩附带的硅胶O形圈将其密封固定。将定制的3D打印分隔器紧贴30毫米盖玻片放置，以防止模式细胞之间交叉污染。在50毫升锥形管中用所选培养基制备1.5%琼脂糖，轻轻涡旋混匀。松开锥形管的管盖，将其放入玻璃烧杯或微波炉适用的容器中。将琼脂糖混合物在高火下微波加热，每隔三到四秒暂停一次，轻轻旋转并混匀，以防止液体溢出。加热一分钟后，检查混合物中是否仍有未完全融化的琼脂糖。若琼脂糖溶液完全澄清，将其短暂冷却至约60摄氏度。加入相应的抗生素或染料，轻轻旋转混匀，避免产生气泡。用移液器将2毫升琼脂糖溶液加入含有30毫米盖玻片的腔室中。在上层腔室开口的琼脂糖上轻轻放置一个无菌的25毫米盖玻片。让凝胶垫固化1至2小时。当凝胶垫完全固化后，使用细头永久性记号笔在25毫米盖玻片上标记每个样品的位置和身份。将培养室倒置，使不锈钢底环朝上，同时在旋开底座时小心地托住下方的聚碳酸酯插入件。将不锈钢底座放置一旁。将30毫米的盖玻片从琼脂糖垫上滑下并丢弃。将铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌的细胞培养物用 PBS 稀释至适合观察单个细胞的低密度。剧烈吹打混匀，使细胞均匀分布。取 5 µL 稀释后的细胞悬液，滴加在琼脂糖垫上标记的位置。待菌斑干燥后，将一片新的无菌30毫米盖玻片覆盖在垫片上。然后用一只手握住聚碳酸酯插入件，另一只手缓慢地将不锈钢底座重新旋至盖玻片上方。一旦培养室密封，检查琼脂糖是否与30毫米盖玻片表面接触。使用镊子的钝端轻轻按压25毫米盖玻片，直至琼脂糖均匀接触30毫米盖玻片的整个表面。首先，通过将载物台顶部培养箱和大培养箱的温度设置为37°C，准备显微镜和成像室环境控制系统。接着，打开培养室加湿器。将一个琼脂糖垫样品放入载物台顶部培养箱中，并关闭腔室以使其平衡。通过设置内置的自动对焦算法在多维采集过程中使用相差通道，来准备MetaMorph软件进行图像采集。在“载物台”选项卡中，为每个样品设置多个载物台位置，选择细胞密度分布均匀的视野区域。然后在时间序列选项卡中，设置图像采集的持续时间和频率。在波长选项卡中，设定所需的采集通道，并根据样本信号强度调整曝光时间。当琼脂糖垫在培养室内升温后，将保湿盖置于载台顶部培养箱上。接下来，在显微镜上从相差模式切换至微分干涉差（DIC）模式。调节聚光镜和孔径光阑，以实现正确的科勒照明。完成调节后，切换回相差模式。依次移动至每个视野位置，调节焦距并将载物台位置重置到新的焦平面。点击“采集”按钮以开始多维图像采集。采集完成后，为整合图像，请打开MetaMorph软件，使用“Review Multidimensional Data”应用程序选择所需通道或波长，并包含每个视野位置的所有时间点。单击“加载图像”，并将每个通道的图像以其对应的通道名称保存为 TIFF 文件。在抗生素处理过程中，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞进行延时成像，显示碘化丙啶染色随处理时间推移而增强，表明细胞膜受损。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在抗生素处理期间的成像结果显示，细胞出现球形体形成、丝状化及细胞质浓缩现象，并伴有碘化丙啶染色。成功的琼脂糖垫制备和成像条件使得能够观察到单个细胞恢复抗生素处理后的金黄色葡萄球菌以及恢复抗生素处理后的铜绿假单胞菌，形成大的细胞簇。

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科研

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Biology

生物学

铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌异质表型的延时落射荧光显微镜成像

用于在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下培养和分析微生物生物膜的流动池系统应用方案。...

Pseudomonas aeruginosa 和 Saccharomyces cerevisiae 在流动池中的生物膜

本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。...

活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志.

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来源：Jackson, L.，等．囊性纤维化患者痰液中Pseudomonas aeruginosa的可视化观察．J. Vis. Exp．（2020）本视频展示了利用荧光标记和共聚焦显微镜技术，对经化学透明化处理的囊性纤维化痰液样本中 Pseudomonas aeruginosa...

在囊性纤维化患者痰液样本中可视化Pseudomonas aeruginosa

本视频演示了一种 体外 研究抗菌治疗影响的技术 铜绿假单胞菌 （Pa）聚集体。用荧光标记的Pa细胞培养成聚集体，以模拟其在感染过程中的生长模式。当用亚致死浓度的抗生素多粘菌素挑战这些聚集体时，可实时评估细菌与抗生素之间的相互作用。 通过...

一种用于研究抗菌治疗对细菌聚集体作用的体外技术

我们介绍了利用流式细胞术和荧光显微镜研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

研究相互作用 金黄色葡萄球菌 通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

我们介绍了微生物菌落生物膜的固定、石蜡包埋和切片技术。在制备好的样品中，可通过显微镜观察生物膜的亚结构及报告基因表达模式。...

微生物菌落生物膜的石蜡包埋与显微切片技术用于显微分析

该活细菌细胞成像方案可实现随时间推移在单细胞水平上可视化多种细菌物种之间的相互作用。通过延时成像，可观察每种细菌在单培养或共培养条件下的行为，从而研究多物种细菌群落中的种间相互作用，包括单个细胞的运动性和存活能力。...

单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化

合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）可与共聚焦激光扫描显微镜及荧光激活细胞分选技术联用，以高分辨率观察细菌聚集体。本文详细描述了在抗菌治疗过程中评估聚集体群体的方法，为未来研究提供了一个技术平台。...

用于实时评估的工具 铜绿假单胞菌 感染模型

抗生素持留现象描述了敏感同基因群体中的少数亚群在短时间内耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。本实验方案结合多种方法，在将大肠杆菌（Escherichia...

Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

了解延时落射荧光显微镜技术用于观察铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的持留细胞异质表型。该方法可揭示细菌在抗生素治疗中的存活策略，为改进临床感染治疗提供基础。

延时落射荧光显微成像铜绿假单胞菌和 Staphylococcus aureus 异质性表型

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