延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

我们实验室的研究重点是探究抗生素为何会失效。具体而言，我们关注细菌群体中少数被称为持留菌的细胞，这些细胞本应被抗生素杀死，但却能够在抗生素治疗中存活下来。目前认为，这些持留菌会导致感染在抗生素治疗结束后复发。

因此，我们希望研究这些持留菌的基因表达和代谢情况，以更深入地理解其生存策略。目前持留菌研究领域面临的一个挑战是如何在通量与单细胞灵敏度之间取得平衡。我们需要将单个细胞在处理后仍具有分裂能力（这一特性可将其定义为持留菌）与其某种可测量的表型相对应，从而帮助我们揭示细胞内部的运作机制。

为了捕获单个持留细胞，我们可能需要对数千个细胞进行这样的操作。与不精确的琼脂三明治方法或微流控装置的制备相比，我们的方案更易于实施，而后者在技术上具有较大挑战性。我们发现，该方案在随时间推移的成像过程中具有良好的可重复性和稳定性，且所需材料极少，这意味着它在高质量数据采集方面既经济又几乎不产生浪费。

我们的未来研究将结合组学与单细胞技术，以研究病原体如何响应并从不同类别的抗生素治疗中恢复。我们的最终目标是利用这些理解，开发出改进临床感染治疗的新策略。首先，将一个无菌的30毫米盖玻片放入可更换盖玻片培养皿的不锈钢底座底部。

将聚碳酸酯插入件轻轻插入底部，确保盖玻片构成腔室的基底，并通过压缩附带的硅胶O形圈将其密封固定。将定制的3D打印分隔器紧贴30毫米盖玻片放置，以防止模式细胞之间交叉污染。在50毫升锥形管中用所选培养基制备1.5%琼脂糖，轻轻涡旋混匀。

松开锥形管的管盖，将其放入玻璃烧杯或微波炉适用的容器中。将琼脂糖混合物在高火下微波加热，每隔三到四秒暂停一次，轻轻旋转并混匀，以防止液体溢出。加热一分钟后，检查混合物中是否仍有未完全融化的琼脂糖。

若琼脂糖溶液完全澄清，将其短暂冷却至约60摄氏度。加入相应的抗生素或染料，轻轻旋转混匀，避免产生气泡。用移液器将2毫升琼脂糖溶液加入含有30毫米盖玻片的腔室中。

在上层腔室开口的琼脂糖上轻轻放置一个无菌的25毫米盖玻片。让凝胶垫固化1至2小时。当凝胶垫完全固化后，使用细头永久性记号笔在25毫米盖玻片上标记每个样品的位置和身份。

将培养室倒置，使不锈钢底环朝上，同时在旋开底座时小心地托住下方的聚碳酸酯插入件。将不锈钢底座放置一旁。将30毫米的盖玻片从琼脂糖垫上滑下并丢弃。

将铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌的细胞培养物用 PBS 稀释至适合观察单个细胞的低密度。剧烈吹打混匀，使细胞均匀分布。取 5 µL 稀释后的细胞悬液，滴加在琼脂糖垫上标记的位置。

待菌斑干燥后，将一片新的无菌30毫米盖玻片覆盖在垫片上。然后用一只手握住聚碳酸酯插入件，另一只手缓慢地将不锈钢底座重新旋至盖玻片上方。一旦培养室密封，检查琼脂糖是否与30毫米盖玻片表面接触。

使用镊子的钝端轻轻按压25毫米盖玻片，直至琼脂糖均匀接触30毫米盖玻片的整个表面。首先，通过将载物台顶部培养箱和大培养箱的温度设置为37°C，准备显微镜和成像室环境控制系统。接着，打开培养室加湿器。

将一个琼脂糖垫样品放入载物台顶部培养箱中，并关闭腔室以使其平衡。通过设置内置的自动对焦算法在多维采集过程中使用相差通道，来准备MetaMorph软件进行图像采集。在“载物台”选项卡中，为每个样品设置多个载物台位置，选择细胞密度分布均匀的视野区域。

然后在时间序列选项卡中，设置图像采集的持续时间和频率。在波长选项卡中，设定所需的采集通道，并根据样本信号强度调整曝光时间。当琼脂糖垫在培养室内升温后，将保湿盖置于载台顶部培养箱上。

接下来，在显微镜上从相差模式切换至微分干涉差（DIC）模式。调节聚光镜和孔径光阑，以实现正确的科勒照明。完成调节后，切换回相差模式。

依次移动至每个视野位置，调节焦距并将载物台位置重置到新的焦平面。点击“采集”按钮以开始多维图像采集。采集完成后，为整合图像，请打开MetaMorph软件，使用“Review Multidimensional Data”应用程序选择所需通道或波长，并包含每个视野位置的所有时间点。

单击“加载图像”，并将每个通道的图像以其对应的通道名称保存为 TIFF 文件。在抗生素处理过程中，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞进行延时成像，显示碘化丙啶染色随处理时间推移而增强，表明细胞膜受损。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在抗生素处理期间的成像结果显示，细胞出现球形体形成、丝状化及细胞质浓缩现象，并伴有碘化丙啶染色。

成功的琼脂糖垫制备和成像条件使得能够观察到单个细胞恢复抗生素处理后的金黄色葡萄球菌以及恢复抗生素处理后的铜绿假单胞菌，形成大的细胞簇。