Name: 量化颗粒水凝胶生物材料内部和颗粒状水凝胶生物材料中的三维细胞迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解颗粒水凝胶中三维细胞迁移的定量评估方法。该方案利用共聚焦显微镜和Imaris软件追踪细胞在组织再生中的行为，为伤口愈合研究提供重要工具。

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本工作的部分资助来自美国国立卫生研究院高优先级短期项目奖（1R56DK126020-01）以及Kurtin信托基金的慈善捐赠。J.T. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金的资助。&#160;图示示意图使用BioRender.com创建。

研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 颗粒水凝胶的制备
注意：本方案中使用的 MAP 颗粒为 3.2 wt% w/v 凝胶，含有 45.88 mg/mL PEG-MAL（10 kDa）、0.82 mg/mL RGD、8.06 mg/mL MethMal19 和 5.62 mg/mL MMP-2 可降解交联剂。该凝胶的机械刚度为 15–20 kPa，以匹配真皮组织的刚度17。
<ol>
	<li>生成颗粒状水凝胶微粒，并按常规方法进行细胞培养前处理。 
	注意：本方案描述了微孔退火颗粒凝胶的无菌制备方法，其制备过程详见Roosa等人的研究。18.</li>
	<li>制备颗粒状水凝胶颗粒 体外 使用70%异丙醇洗涤三次，再用无菌1x PBS洗涤三次，进行灭菌处理。</li>
	<li>在超纯水中溶解LAP粉末，通过0.22 µm无菌滤器过滤，制备无菌的0.2 mM苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（LAP）培养基溶液。将该溶液与实验所需凝胶体积按1:1（v/v）比例混合。</li>
	<li>将0.2 mM LAP、凝胶和培养基溶液置于37 °C下，在20 rpm的试管旋转仪中孵育至少30分钟，以使LAP充分扩散至微粒内部，然后再进行后续操作。</li>
	<li>30 分钟后，以 18,000 x g 离心颗粒悬浮液 g 在25 °C下孵育5分钟。吸除上清液。 
	注意：由于化学成分、亲水性及粒径的差异，MAP 颗粒的整体干燥程度可能有所不同。为保持一致性，最佳操作是按照所述方法离心颗粒悬液，使用正向置换移液器在离心管中混匀颗粒，然后重复离心步骤。</li>
</ol>
2. 基于单层细胞的上行迁移实验（MAMA）方法：细胞培养与成像
注意：细胞使用 FITC 通道（488 nm）进行成像。用于细胞的染料激发波长为 492 nm，发射波长为 517 nm。10 倍放大比 4 倍放大提供更丰富的细节，但两者均可使用。
<ol>
	<li>根据制造商的说明书解冻人皮肤成纤维细胞（HDFs）。根据需要进行传代，直至达到所需代次；通常情况下，原代细胞在传至第5代（P5）之前可维持其遗传和表型特征。</li>
	<li>接种120,000个细胞/cm²2 至少在 96 孔板或所需规格的培养板中进行，每孔加入推荐体积的培养基用于悬浮细胞，并在每次添加前轻轻吸除。让细胞过夜贴壁，如图所示 图1A，第二天细胞融合度将约为80%。 
	注意：通常，选择中心列和中心行的孔有利于凝胶的均匀扩散。作者在96孔板中最多使用24个孔（B-G行，5-8列）。</li>
	<li>按照上述说明制备凝胶条件，在 LAP 孵育期间，使用移液器或抽吸装置从细胞培养孔板中移除培养基。注意不要扰动孔板底部。</li>
	<li>根据制造商说明将细胞示踪染料加入孔中，如图所示 图1B确保在从孔中吸取细胞示踪染料前，凝胶已按照步骤1所述完全制备好。</li>
	<li>使用正向置换移液器将每种凝胶条件的20 µL加入到各孔中，注意不要触碰到板底。 
	注意：当将凝胶直接移液至孔的中心时，可获得最佳的检测条件。</li>
	<li>使用平板旋转转子离心机附件，在 25 °C 下以 100 x g 离心 g 以8的加速度和减速度旋转15秒以压平凝胶。将平板翻转180°，再次以100 × g离心 g 15秒，以确保凝胶均匀分布在孔底，如图所示 图1C.</li>
	<li>无菌条件下从顶部对凝胶进行光交联（图1D）通过聚焦光照（365 nm，34.4 mW/cm²）2将样品退火30秒，所有支架形成后，向每孔细胞中加入200 µL培养基。将细胞在37 °C孵育30分钟，使其在成像前贴附于颗粒状支架上。</li>
	<li>为捕捉迁移行为的总结信息 图1E使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。在细胞融合度至少为80%的区域找到焦平面的最低点，并将其设为z轴堆栈的下边界。
	<ol>
		<li>找到细胞荧光信号的最高点，并将其设为z轴堆栈的上边界。为获得最佳分辨率，使用5 µm或更小的步长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对至少三个孔成像，以代表细胞单层和非迁移细胞的高度。t = 0 时间点的图像同时展示自顶视图和侧视图。 图2A成像完成后，于4℃孵育过夜。 
	注意：这些细胞使用 4x 物镜成像，且所有孔的曝光时间保持一致。</li>
	<li>在 t = 24 h 时，细胞将开始穿过颗粒支架，如图所示 图2B 从顶部和侧面视图进行成像。使用与 t = 0 h 相同的参数重复成像步骤。以前一次的载物台高度作为参考，或寻找尚未发生迁移的细胞，并将其设定为 z-stack 的下边界。</li>
	<li>重复上述步骤，处理所有孔，确保每个孔均保存为单独的图像，以便于分析。 
	注意：根据实验限制条件和细胞追踪荧光的方法，成像的时间点可相应延长。</li>
	<li>支架可进行固定和染色以获取更多检测指标。在预定实验终点，用移液器吸除孔中的培养基并弃去。每孔加入 200 µL 无菌 PBS，轻轻洗涤两次，每次 5 分钟。加入 200 µL 4% 多聚甲醛（PFA），固定 20 分钟后吸除并弃去。孔板可立即进行染色，或在 1x PBS 中于 4 °C 保存最多一周。</li>
</ol>
3. 基于单层的上行迁移实验（MAMA）方法：三维图像分析
<ol>
	<li>对于批量转换，打开 IMARIS 图像转换软件。将显微镜图像拖放到转换软件中，并在软件 Arena 内选择一个文件夹进行导入。点击 Start All。转换后的图像将以 .ims 文件形式出现在 Arena 中。 
	注意：如果图像元数据中未包含体素尺寸，请参考各自的共聚焦成像规格以查找该数值。或者，体素尺寸可近似为成像过程中使用的步进尺寸。</li>
	<li>通过双击桌面的 IMARIS Arena 图标 来启动软件，并从 Arena 中选择一幅图像。</li>
	<li>图像将自动加载到顶部工具栏图标面板中显示的“3D 视图”分析选项卡中。点击主工具栏中的 Image Proc 选项卡。</li>
	<li>在侧边栏左上角，点击通道 1 的 下拉菜单，选择 背景扣除。在面板底部点击 确定 返回“3D 视图”。t = 0 h 和 t = 24 h 的代表性图像分别见 图 2A、B。</li>
	<li>在侧边栏菜单上方的小工具栏中，点击带有圆形蓝色图标的 添加新表面，以创建一个名为“Surfaces 1”的可编辑对象选项卡。</li>
	<li>创建参数算法设置的界面将在菜单面板底部打开。通过点击界面底部的 蓝色箭头按钮 手动生成所有重复样本所用的参数。确保已选择正确的源通道，并勾选“平滑”选项。
	<ol>
		<li>将表面细节设置为 0.7 µm，并选择 背景扣除（局部对比度）。将平均细胞长度输入“可完全嵌入对象的最大球体直径”框中。完成后点击底部相同的 蓝色箭头。 
		注意：该值可通过工具栏中的“切片”选项卡并测量典型细胞的宽度来估算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于阈值分割，确定仅对最亮细胞进行分割的强度直方图。使用切片器在图像堆栈中上下移动，以确保分割尽可能准确。
	<ol>
		<li>启用“分割接触对象（区域生长）”的 启用 选项，并将种子点直径设置为与之前相同的数值。确保选择“基于强度”的阈值方法，然后点击 蓝色右箭头按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来的两个步骤——滤除种子点和滤除表面——可通过多种测量方式进行调整，以确保生成的表面准确；但基础分析无需额外过滤。若无需更改，点击 蓝色箭头 按钮即可。 
	注意：最后一步可根据所需输出对表面进行进一步分类。完成所有编辑后，点击 绿色箭头按钮 以完成表面创建。</li>
	<li>若要保存用于批量分析的创建参数，点击魔棒图标 Creation。点击 为批量分析存储参数 并命名，然后点击 确定。t = 0 h 和 t = 24 h 的代表性处理后图像分别见 图 2C、D。 
	注意：选中的“表面”内所有对象可根据图像转换软件提供的各种属性（如表面积、体积、强度以及与其他已创建表面的距离）进行分类。</li>
	<li>通过选择 统计 选项卡可查看表面属性。为获取所有细胞高度，点击 详细 选项卡，然后依次从下拉菜单中选择 特定值 和 位置 Z。点击唯一的 保存 图标，将所有 z 坐标及任何分类结果保存为 .xls 文件。对所有图像重复此操作。</li>
	<li>从代表性图像中找出非迁移细胞的中位 z 坐标，并从每个测试条件孔中低于该数值的所有 z 坐标中减去该值。 
	注意：迁移值以各技术重复条件下高于非迁移细胞高度的中位数均值表示。可报告为中位高度（见 图 3A），或报告为相对于 t = 0 时目标时间点的迁移高度倍数变化（见 图 3B）。</li>
</ol>
4. 平行层状外向类球体迁移实验（PLOSMA）方法：用于三维类球体的细胞培养与悬滴培养
注意：本方案描述了细胞培养和悬滴培养，改编自 Nandi 等人撰写的方案14。
<ol>
	<li>根据制造商的说明书解冻人真皮成纤维细胞（HDFs）。根据需要传代，直至达到所需的代数。</li>
	<li>在无菌细胞培养操作台中，向培养皿底部加入 10 mL PBS，并将皿盖翻转放置，使其外表面朝上，置于细胞培养操作台内。</li>
	<li>将适当体积的细胞（根据细胞计数确定）加入微量离心管中。加入用培养基稀释的细胞示踪染料，再用预温的培养基补足至 1 mL 总体积。 
	注意：每个球体约含 8000 个细胞，但可根据细胞类型进行调整。</li>
	<li>将细胞悬液在 37 °C 下孵育 45 分钟。按照制造商推荐的转速离心细胞，并吸除上清液。</li>
	<li>用含 1:100 甲基纤维素的培养基重悬细胞。</li>
	<li>将 20 µL 细胞/培养基混合液滴加至培养皿皿盖内表面。</li>
	<li>迅速、果断且小心地将皿盖翻转，盖在含有 PBS 的培养皿底部上。</li>
	<li>将液滴孵育至少 24 小时。 
	注意：可通过明场显微镜观察球体形成情况。</li>
</ol>
5. 平行层状外向类球体迁移实验（PLOSMA）方法：将细胞类球体接种至颗粒水凝胶上
注意：以下流程总结于图4A中。
<ol>
	<li>按照图4A中所述的PLOSMA方法，使用正向置换移液器将15 µL凝胶无菌加入透明96孔板的各孔中。</li>
	<li>使用平板旋转转子离心机附件，在1000 × g 条件下离心10秒以压平凝胶。将板翻转180°，再次在1000 × g 条件下离心10秒，以确保凝胶在孔底均匀分布。</li>
	<li>当凝胶达到均匀平整状态后，从上方无菌进行光交联：对样品施加聚焦光照（365 nm，33.4 mW/cm2）30秒，以使支架退火固化。</li>
	<li>将悬挂液滴的培养皿无菌转移至无菌组织培养罩内，并将皿盖倒置。</li>
	<li>使用20 µL移液器缓慢吸取一个液滴，直至类球体进入移液器吸头，然后将液滴排至孔中支架的中央位置。</li>
	<li>对所有孔重复上述步骤。通过明场或荧光显微镜观察，确认每个孔中均含有一个类球体。</li>
	<li>将96孔板置于37 °C培养箱中孵育2小时，使类球体附着于支架上。</li>
	<li>在每个类球体上方再添加15 µL凝胶。为确保凝胶均匀分布，以300 × g 离心15秒，每个方向各一次。</li>
	<li>使用紫外光（365 nm，33.4 mW/cm2）照射30秒，使顶层凝胶退火固化。随后在每个支架上方加入培养基，使每孔总体积达到200 µL。 
	注意：此时支架会非常干燥，因此应沿孔壁逐滴加入培养基，避免类球体脱落。</li>
</ol>
6. 平行分层外向类球体迁移实验（PLOSMA）方法：类球体的共聚焦成像
注意：成像的难易程度取决于成像系统。在较低曝光时间下定位孔内的类球体。细胞使用 FITC 通道（488 nm）进行成像。所用细胞染料的激发波长为 492 nm，发射波长为 517 nm。相较于 4 倍放大，10 倍放大可提供更详细的图像。
<ol>
	<li>找到细胞仍保持清晰对焦的最低载物台位置（z轴高度），并将此设为z轴扫描范围的下限。</li>
	<li>找到细胞仍保持清晰对焦的最高载物台位置（z轴高度），并将此设为z轴扫描范围的上限。 
	注意：为保持细胞尺度的分辨率，最佳成像效果需采用小于或等于5 µm的步长。具体成像速度与分辨率之间的权衡取决于共聚焦显微镜系统。</li>
	<li>按照所述方法在t = 0和24 h时对所有类球体进行成像。根据实验条件，也可对48 h时间点进行成像。图4B展示了t = 0和t = 24 h的代表性最大投影图像。</li>
</ol>
7. 平行分层外向类球体迁移实验（PLOSMA）方法：三维图像分析
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 至 3.4 所述，将图像导入分析软件。在左侧面板右上角，点击通道 1 的下拉菜单，选择背景减除，然后点击面板底部的确定。</li>
	<li>返回 3D 视图后，在“显示调整”弹出窗口中点击自动调整所有通道，并根据需要进行校正。</li>
	<li>在侧边菜单上方的小型工具栏中，点击添加新参考坐标系图标（如图 5A所示，包含三个正交箭头），以添加一个名为“Reference Frame 1”的新标签页。</li>
	<li>将原点在三个平面上均移动至类球体的中心位置，如图 5B所示。</li>
	<li>在与三个正交箭头相同的工具栏中，点击带有橙色球体的图标，添加新的“Spots”以创建名为“Spots 1”的标签页，然后点击蓝色箭头按钮。</li>
	<li>在斑点检测下，将估计的 XY 直径设置为细胞的估计直径，然后点击蓝色箭头按钮。 
	注意：&#160;对于 HDF 细胞，该数值为 15.0 µm。</li>
	<li>进行阈值设定时，调整强度直方图，使其仅包围最亮的部分。使用切片器上下移动图像堆栈，确保检测尽可能准确，然后点击蓝色下一步箭头。</li>
	<li>点击绿色的执行按钮以完成分析。</li>
	<li>取消勾选在切片器上渲染，或点击设置面板右侧的黄色方块图标。</li>
	<li>点击统计标签页。在第一个下拉菜单中选择特定值，在第二个下拉菜单中选择距参考坐标系原点的距离。所有选定表面的数值将被显示，如图 5C所示。点击唯一的保存图标，即可下载一个 .xls 文件。</li>
	<li>通过主工具栏中的保存图标保存对图像和分析所做的更改。图 6A展示了在 24 小时成像的类球体的 3D 渲染图，而图 6B展示了 IMARIS 斑点功能标记的扩散细胞，其颜色编码依据其距参考坐标系原点的距离。</li>
	<li>将导出的数据归一化至 t = 0 时的图像，并计算每个类球体的细胞迁移平均距离和 z 轴高度，从而为每个样本获得单一数值。图 7A、B 分别展示了每项输出的代表性图表。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了两种用于表征伤口愈合和组织整合过程中细胞在三维环境中迁移的体外模型。第一种模型为基于单层细胞的迁移实验，依赖于正确贴壁且达到汇合状态的细胞。该方案以成纤维细胞系开发，并在接种密度为1,20,000个细胞/cm2的条件下进行了优化。此密度可使细胞在培养板底部均匀生长，过夜后至少达到80%汇合度。该步骤可确保细胞在z轴方向上的迁移在至少24小时内发生；若在添加凝胶层时汇合度不足，细胞可能继续在组织培养塑料表面以及凝胶内部同时扩散，导致迁移模式不均一且速度减慢，此现象在优化过程中已被观察到。即使在80%汇合度下，细胞密度较低的区域仍可能出现迁移高度不均的情况。通过设置良好的重复样本，可降低这些细胞行为带来的干扰。过度汇合的细胞可能在离心过程中发生脱落，甚至导致细胞死亡。为解决这一变异性，需以一致的细胞数量进行接种，并采集一致的成像区域，以便进行适当的数据比较。据作者所知，尚未有文献报道使用培养板离心来实现凝胶平整化，但离心技术在细胞传代和生物材料处理中已被广泛应用21,22。将离心速度调整至与传代条件一致，可维持细胞活力，有利于后续最佳的细胞处理。
该方法的主要挑战是在确保最佳分析效果的同时，最大限度地提高成像分辨率和成像深度，并尽量缩短成像时间。绿色细胞示踪染料的亮度足以对96孔板进行成像，步长可达5 µm或更小，曝光时间可低至1000 ms。降低曝光时间可减少细胞脱离培养条件的时间，但也会降低分辨率。这些参数需根据具体显微镜进行个体化优化，但在同一项研究中，通过确保所有图像均采用相同设置采集，可降低实验间的变异性。
分析MAMAs时需要注意，必须剔除位于单层细胞高度处及以下的细胞，以确保统计检验仅包含迁移中的细胞。由于过滤后细胞位置的分布呈非高斯分布，因此报告重复孔的中位数。组间比较可通过直方图进行可视化，中位数可采用非参数检验进行统计分析。
尽管存在这些挑战，基于单层细胞的上向迁移方法归根结底仍是一种可重复的检测细胞三维浸润多孔支架的实验方法。为研究细胞迁移的机制性效应，需确保各项参数与所研究的细胞类型相匹配，这可能包括在凝胶或培养基中添加趋化性或黏附性因子。人真皮成纤维细胞完全培养基中含有促进迁移的趋化因子，但其他依赖更特异性信号通路的细胞类型则需对实验条件进行相应调整。该实验方法适用于检测多种变量，但本方案未涵盖这些变量的具体范围。MAMA 提供了一种生理学上相关的环境，模拟细胞从大块组织向注射入体内的多孔水凝胶迁移的过程。 体内.
对于PLOSMA方法而言，将类球体放置在支架的中心位置对于实现成功的成像以及有意义的三维细胞迁移至关重要。类球体在凝胶中心位置的精确接种依赖于操作者。为此，使用非惯用手握住移液器的管身有助于实现居中操作，且可通过明场或荧光显微镜确认接种位置的有效性。若类球体偏离中心，可使用新的类球体重新尝试接种，既可在同一支架上，也可在新的支架上进行。因此，作者建议制备比实际所需数量更多的类球体，并准备比实际所需量更多的MAP凝胶。
第二步离心步骤可确保类球体（1）被凝胶均匀包裹，以及（2）能够均匀地向凝胶上下扩散，这对于研究递送的细胞至关重要。离心还可能导致类球体从孔中央向边缘移动；尽管本方案通过优化离心步骤及每层凝胶的体积（15 µL）以实现均匀分布，从而限制了这一现象，但无法完全消除其移动。为减少类球体移动所需的精确离心速度和时间可能需要根据离心机型号进行调整；然而，本方案中描述的参数可作为个体化优化的参考基准。另一种方法是在加入第二层凝胶前，让类球体孵育2小时，以使其附着于支架上。当同时采用这两种策略时，类球体的移动可得到尤为有效的抑制。最后，由于该方法涉及多步离心过程，可能不适用于活力较弱的细胞系。
除了PLOSMA方法中类球体铺板的操作流程外，成像过程中也存在一些限制。类球体可使用4倍或10倍放大倍数进行成像，但为了获得最佳结果，建议至少使用10倍放大倍数，并将z轴堆栈的步进尺寸减小至2–5 µm。在整个研究过程中，放大倍数应保持一致。随着分辨率的提高，成像时间会相应增加，因此应限制每块培养板中的样本数量（每板4–8个孔），以尽量减少样本在培养箱外的时间。采用活细胞成像系统也有助于改善追踪效果，并提供更深入的观察信息。
由于颗粒状水凝胶具有独特的拓扑结构和设计参数，包括固有体积、孔隙率、机械强度，以及在某些情况下的生物活性，因此有必要尽可能精确地研究细胞行为与这些因素之间的关系。PLOSMA 方法旨在模拟细胞递送后或细胞完全进入颗粒状凝胶后的细胞运动行为。由于细胞被迫迁移通过颗粒状水凝胶结构中固有的孔隙，PLOSMA 方法有效地将孔隙率作为影响细胞行为的独立因素进行分离。该检测方法的潜在应用包括细胞递送 原位 以及颗粒状支架内的组织整合，特别是在伤口愈合领域23.
由于成纤维细胞迁移在组织修复和重塑中的重要作用，这两种方案均使用原代人皮肤成纤维细胞进行开发4,24。然而，任何贴壁细胞在多孔支架发生改变时（包括添加生长因子以及凝胶表面或整体成分的变化）的迁移行为均可被检测。这些变化可能需要对实验方案进行相应调整，以获得可观测的结果。需要进一步优化的参数包括细胞接种密度、实验持续时间以及分析流程。IMARIS 是一种强大的成像分析工具，可用于细胞迁移分析，其功能远不止本文所述内容，例如可根据表面积、体积、强度以及与其他已构建表面之间的距离等多种属性，将选定“表面”内的所有对象分类为不同集合。目前存在大量在线资源可用于确定进一步的分析方法。
本文所述的两种方法不仅以生理学方式解决了组织初次引入颗粒材料时的状态问题，还研究了细胞完全嵌入材料后的后续反应。与所有迁移实验一样，实验中的细胞在迁移过程中能够同时增殖，但所描述实验的设计不会干扰细胞增殖，从而确保对分析结果无不当影响。这两种方法既适用于终点染色，也适用于纵向成像，后者可通过PFA固定来检测细胞骨架、胶原沉积、增殖等指标。与以往方法相比，采用本文所述方法可更准确地实现对三维细胞迁移的时空动态表征，并将细胞浸润作为可量化的参数1,6,14,15,25,26,27。

用于治疗应用的生物材料正日益向更复杂且更贴近真实细胞环境的模型发展，以研究组织整合。生物材料支架为细胞生长提供三维（3D）结构，并旨在模拟目标组织。1,2三维细胞培养模型包括天然基质和合成支架，可为细胞提供更复杂的环境 通过 趋化性或趋触性信号3,4传统的水凝胶支架以整体交联方式制备，形成纳米多孔网络结构，可允许小分子扩散5,6，但需要降解以实现向需要修复的组织区域进行细胞尺度的迁移7颗粒状水凝胶是一类生物材料，由于其具有良好的生物相容性、能够贴合不规则形状，并且在许多情况下具备可注射性，因而具有较高的临床转化潜力。8,9其模块化特性提供了细胞尺度的孔隙结构，有利于组织浸润和血管生成，同时也具有可调节性，可添加多种异质性信号以调控细胞行为。10,11,12理解细胞在三维支架内的反应与迁移对于所有利用生物材料实现组织整合的应用中的生理相关性至关重要。
然而，对组织在三维环境中的长入进行研究已被证明难以实现定量上的精确。三维环境复杂性的增加要求 体外 可不仅有助于深入理解细胞行为，还能优化材料条件的细胞迁移模型。以往关于三维颗粒支架中细胞迁移的已发表研究采用表面接种法来探究细胞行为，报道了细胞向多孔结构内的侵袭及细胞形态的变化13 以及其他类球体出芽14,15，测量出芽长度和分支数量。表面接种的细胞迁移距离可能受到重力作用的不均匀影响，且由于显微镜技术的限制，无法进行纵向观察。该类球状体出芽方法目前仅限于二维定量分析 通过 最大投影法无法捕捉受控侵袭的机制。这两种方法均在xy平面内测量，缺乏充分再现三维细胞运动和支架浸润所需的关键细节。
本实验方案描述了两种用于量化细胞迁移的方法，例如细胞在多孔三维颗粒水凝胶支架中的体外（in vitro）侵袭过程，特别是使用微孔烧结颗粒（Microporous Annealed Particle, MAP）支架16,17,18,19。以下方法的目的是通过控制细胞迁移的方向性，研究细胞在颗粒凝胶中的行为，以实现三维分析。第一种方法为基于单层细胞的上行迁移实验（monolayer-based ascending migration assay, MAMA），这是一种内源性细胞整合的简化模型，可展示均匀的细胞-材料相互作用，用作模拟细胞与颗粒水凝胶接触初期微环境的平台，并可在细胞侵入支架前分离并观察其个体行为。第二种方法称为平行分层外向类球体迁移实验（parallel layered outward spheroid migration assay, PLOSMA），是一种三维细胞类球体迁移实验，用于研究细胞在被复杂支架环境完全包围时的运动行为，模拟细胞递送后的迁移过程，以及细胞完全进入颗粒凝胶后的运动情况。
这两种方法均可通过三维图像分析进行量化，并可用于再生医学和组织工程应用中材料-细胞相互作用的研究与优化，其中促进或限制细胞迁移均属于设计标准的一部分。此外，这些方法利用平板离心实现均匀的多孔板检测制备。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>VWR International</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDS 染料，1 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td>20 × 50 μg 单位，492/517 nm</td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>75016085</td><td>ST Plus 系列</td></tr><tr><td>透明 96 孔板</td><td>MilliPore Sigma</td><td>CLS3997-50EA</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>成纤维细胞基础培养基</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-030</td><td>480 mL，无酚红</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长试剂盒 - 低血清</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-041</td><td>7.5 mM L-谷氨酰胺，5 ng/mL 重组人碱性成纤维细胞生长因子，5 μg/mL 重组人胰岛素，1 μg/mL 氢化可的松，50 μg/mL 抗坏血酸，2% 胎牛血清</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>公开访问下载</td></tr><tr><td>人皮肤成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>成人人皮肤成纤维细胞</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro 共聚焦显微镜</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>配备 4×、10× 放大倍数的转盘共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3/4D 图像可视化与分析软件，专有软件</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>ThermoFisher</td><td>Finnpipette F2 可调体积移液器</td><td>HeraCell Vios 160i CO₂ 培养箱，165 L</td></tr><tr><td>M-20 微孔板摆动桶转子</td><td>ThermoFisher</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Fisher Scientific</td><td>9004-67-5</td><td>实验级，粉末状</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>多聚甲醛（4%）</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ19943K2</td><td>用于固定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>08-757-100A</td><td>带盖细菌培养皿 35 × 10 mm</td></tr><tr><td>移液器</td><td>ThermoFisher</td><td>4642080</td><td>Finnpipette F2 可调体积移液器</td></tr><tr><td>无菌 PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>吐温-X</td><td>Fisher Scientific</td><td>327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

量化细胞在颗粒状水凝胶生物材料内部及向其内部的三维迁移

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

颗粒状水凝胶支架在再生医学中具有重要应用潜力，可作为细胞递送的载体或组织整合的界面。本文介绍了两种用于定量分析细胞在颗粒状水凝胶内部及向其内部迁移的新方法，突出了这些支架的不同应用方向。首先，提出了一种细胞单层界面检测法，用于模拟组织向颗粒状水凝胶内的生长过程，适用于组织整合研究。其次，描述了一种基于类球体的检测方法，旨在追踪细胞在水凝胶基质内的运动，特别适用于细胞递送相关应用。这两种方法均可实现对细胞迁移的精确且可控的测量，为使用颗粒状水凝胶支架的研究人员提供了全面的技术工具。这些方法的提出源于对细胞在支架内迁移行为进行针对性调控的需求，以匹配特定应用场景。通过优化和标准化这些定量技术，研究人员可逐步改进颗粒状水凝胶的性能，确保其在多种再生医学情境下的有效性。这一套可靠的定量工具为提升颗粒状水凝胶支架性能提供了新机遇，推动其在细胞递送与组织整合应用中的进一步发展。

本方案旨在详细说明两种新型颗粒支架迁移实验的必要步骤。MAMA 方法可用于评估细胞在组织界面处的侵袭能力。颗粒水凝胶系统比块状水凝胶更为复杂，因此其迁移实验的处理本身也更具挑战性9,20。理解 图1 中所示的逐步操作流程至关重要。每个步骤均依次递进，并已在本方案中优化。以 120,000 个细胞/cm2 的密度接种 HDFs 可确保过夜达到至少 80% 的融合度（图 1A），且这些非荧光细胞最好在实验当天用细胞示踪染料标记，以最大化成像潜力（图 1B）。本方案采用与 HDF 传代时相同的较低离心力，以维持细胞活性。由于单次离心步骤会产生特定角度，因此必须将培养板翻转 180°，以确保凝胶完全覆盖孔底表面（图 1C）。在退火后将细胞置于培养箱中恢复 30 分钟（图 1D），有助于维持细胞活性并实现最佳迁移效果（图 1E）。可使用 4 倍物镜对 96 孔板的大面积区域进行成像，并在 0–24 小时的时间点之间进行匹配（图 2A、B），以广泛评估细胞行为。在分析软件中处理所得的 z 轴层扫图像，可在用户友好的界面中对多个大型数据集进行高级分析。本方案总结了生成各时间点细胞高度（即位置 Z）数据集的步骤，并通过 图 2B、C 中的代表性图像进行可视化展示。处理后数据的分析结果见 图 3A，以各时间点中位高度的均值及其标准差表示；相对于 t = 0 小时时未迁移细胞的高度变化倍数则显示在 图 3B 中。该方法的底层数据通常呈非正态分布，因此中位数是更稳健的比较指标，故用于数据汇总。
同样，PLOSMA 方法可用于评估细胞在三维颗粒状水凝胶支架内的运动能力。图4A 概述了 PLOSMA 方法的操作步骤，尤其重要的是将类球体接种于孔板的中心位置。建议将类球体置于视野中心，但具体操作取决于显微镜的成像能力。图4B 展示了在 FITC 通道（488 nm）下以 10 倍放大倍数拍摄的类球体扩散的代表性图像，时间分别为 t = 0 h 和 t = 24 h。在软件中，可为每个 z 层图像创建并调整一个原点参考坐标系（图5A、B）。软件可追踪从该原点参考坐标系出发的径向距离，并将其导出为所需的数据集（图5C）。图6A 展示了 t = 24 h 类球体三维重建的代表性图像，而 图6B 展示了软件的“Spots”功能。图7 展示了数据处理结果的一个示例。图7A 表示从中心出发的平均迁移距离，并以第 0 天的距离进行归一化处理。图7B 则单独展示了仅在 z 平面方向上的迁移距离，因为该方向正是 PLOSMA 方法旨在研究的目标方向。
<img alt="基于单层的上行迁移实验示意图；细胞生长、染料应用、水凝胶离心。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1基于单层细胞的上行迁移实验细胞培养与成像 MAMA 中细胞与凝胶处理主要步骤示意图。（A细胞过夜培养至汇合。B) 细胞示踪染料在加入颗粒凝胶前立即添加。支架由此构建完成 通过 (C）板离心并用（D）光交联。在多个时间点进行成像可实现（E细胞向上迁移的可视化 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦显微镜图像，0小时和24小时细胞生长的顶视图和侧视图，荧光检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2MAMA 图像处理 图像处理的代表性图像。原始共聚焦图像的顶部和侧面视图对比，位于（A) t = 0 和 (B) t = 24 h，4倍放大，FITC通道。B) 处理后的细胞位置Z高度的顶部与侧面视图对比C) t = 0 和 (Dt = 24 h。24 h 处理包括减去中位非迁移 z 轴高度。比例尺 = 500 µm缩写：MAMA = 基于单层细胞的上行迁移实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移分析柱状图；中位位置，随时间点的变化倍数；统计学数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：MAMA 细胞迁移输出分析。（A）各重复样本中细胞高度的中位 Z 位置及标准差（n = 6），时间点 t = 0 h（27.0 µm ± 1.4 µm）和 t = 24 h（46.6 µm ± 10.8 µm）。（B）24 h 时细胞迁移相对于 0 h 的归一化结果，以变化倍数表示（1.8 ± 0.4）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PLOSMA 方法示意图，细胞培养，MAP 层，细胞球体；显微镜图像 t0 和 t24" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4平行层外向类球体迁移实验（PLOSMA）细胞培养与成像。 (A) 支架分层步骤示意图。B) 类球体在 0 和 24 小时拍摄的最大强度投影图像。图像已采集 通过 在FITC通道（488 nm）中以10倍放大倍数进行共聚焦荧光显微镜观察。比例尺 = 200 µm缩写：PLOSMA = 平行层向外类球体迁移实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用光谱系统进行三维体积可视化分析；发射数据表；模拟界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：创建新的原点参考坐标系。（A）以红色框标出的新原点参考坐标系按钮。（B）新原点在三维空间中均设置为类球体的中心位置。（C）输出的度量指标显示细胞表面到原点参考坐标系的距离，用于描述细胞从中心迁移的距离。比例尺 = 120 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示细胞中蛋白质定位的三维荧光显微镜图像，细胞成像研究示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：24小时时包埋类球体的三维重建图像。（A）在三维空间中处理后的类球体。（B）使用IMARIS软件中的原点参考坐标系功能确定同一类球体的中心，细胞扩散程度根据其与原点的距离以颜色编码表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="移动距离和Z轴高度变化倍数的柱状图；统计数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67627/67627fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：PLOSMA分析结果示例。 （A）PLOSMA结果示例，显示以 µm 为单位的移动距离。平均移动距离为 240.8 µm ± 36.87 µm。（B）类球体出芽的Z轴高度变化倍数（tf/t0）。平均变化倍数为 3.82 ± 1.495。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67627/67627fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于定量评估细胞在颗粒状水凝胶内部及其界面处三维迁移的实验方案。

颗粒状水凝胶支架在再生医学中具有重要潜力，可作为细胞递送的载体或作为……的界面

我们的研究重点是利用颗粒状水凝胶的独特性质，研究细胞在组织再生过程中的运动行为与功能。在理解其转化应用意义时，对细胞微环境响应的建模至关重要。随着三维多孔支架的应用日益增多，迫切需要更全面的三维迁移检测方法，以更真实地模拟细胞在伤口愈合环境中的行为。我们开发了两种从支架构建到成像与分析的三维实验流程，用于体外研究细胞运动与迁移。通过这两种新建立的检测方法，我们能够在伤口愈合的两个不同阶段追踪响应细胞：一是从大块组织向支架的初始浸润阶段，二是细胞被复杂支架包围后的移动阶段。首先，在96孔板的每个孔中，以每平方厘米接种120,000个人类皮肤成纤维细胞，至少设置六个复孔。经过过夜孵育后，使用移液器或抽吸装置从细胞孔中移除培养基。使用正向置换移液器，将每种凝胶条件下的 20 微升染料加入各孔中。使用设定为 25 摄氏度的板式旋转转子离心机附件，以 100×g 离心 15 秒，加速度和减速度均设为 8，以使凝胶表面平整。将培养板旋转180度，再次离心，以确保凝胶在孔底均匀分布。为无菌光交联凝胶，使用365纳米的聚焦光照处理30秒，使支架退火。所有支架形成后，向每孔中加入200 µL培养基，在37 °C孵育30分钟。使用共聚焦显微镜对细胞进行成像，以捕获其迁移行为。进行图像分析时，打开 Imaris 图像转换软件以进行批量转换。将显微图像拖放到转换软件中，并在软件界面内选择一个文件夹以导入文件。依次选择每个文件以设置体素大小。按下“全部开始”以启动转换。接下来，在 Imaris Arena 软件中，从 arena 中选择一幅图像以开始处理。单击主工具栏中的“图像处理”选项卡。然后，单击通道1的下拉菜单并选择“背景减除”。按“确定”返回3D视图。在小型工具栏中，单击标有“添加新表面”的蓝色圆润形状图标，以创建名为“表面 1”的可编辑对象选项卡。使用蓝色箭头按钮手动为所有重复样本生成参数。将表面细节设置为 0.7 微米，并选择背景减除和局部对比度。将平均细胞长度输入到可容纳于对象框内的最大球体的直径中。对于阈值分割，确定强度直方图以仅分割最亮的细胞。启用“分割相接触对象”、“区域生长”功能，并将种子点直径设置为与先前使用的直径一致。为保存用于批量分析的创建参数，请点击标有“Creation”的魔棒图标。点击“store parameters for batch”，命名文件，然后点击“OK”。为收集所有细胞高度，请点击“Detailed”选项卡。从下拉菜单中选择特定数值，然后选择“Position Z”。单击保存图标，将所有Z轴位置和分类信息导出为XLS文件。首先，在超净工作台中将PBS倒入培养皿，然后用移液器将20微升细胞培养液滴加到培养皿倒置的盖子上。将盖子重新放回培养皿上，并将培养板进行孵育，以获得悬滴培养的3D球状体。使用正向置换移液器将15微升凝胶无菌加入透明96孔板的孔中，以设置PLOSMA。使用板式旋转转子离心机附件，在1,000g条件下离心10秒，使凝胶表面平整。将板翻转180度后再次离心，以确保凝胶分布均匀。然后，使用365纳米的聚焦光照射30秒，以退火支架并从顶部对凝胶进行光交联。将悬挂液滴的培养皿无菌转移至组织培养罩内，并将皿盖倒置。使用20微升移液枪，缓慢吸取一个液滴，直至类球体进入枪头，然后将液滴挤出至孔中央的支架上。将培养板置于37摄氏度孵育2小时，使类球体附着于支架上。孵育后，用移液器在每个类球体上方再添加15微升凝胶。以300g离心15秒，每个方向各一次，以确保凝胶均匀分布。使用紫外线照射使凝胶顶层退火，方法如前所述。将培养板置于共聚焦显微镜下，在选定最低和最高Z平面后对类球体进行成像。将图像导入Imaris Arena软件后，点击通道1的下拉菜单，选择背景扣除。点击面板底部的“确定”按钮。在3D视图中，按下“显示调整”弹出窗口中的“自动调整所有通道”按钮，并根据需要进行校正。在较小的工具栏中，单击“添加新参考帧”图标，以创建一个标为“参考帧1”的选项卡。将原点在三个平面上均移动至类球体的中心。在同一工具栏中，单击带有橙色球体的图标以添加新的点，创建一个名为 Spots 1 的选项卡，然后按蓝色箭头按钮继续。进行阈值分割时，调节强度直方图，仅分割最亮的部分。使用切片器浏览图像堆栈以确保准确性。按三次蓝色的“下一步”箭头。取消勾选“在切片器上渲染”，或点击设置面板上的黄色方形图标。单击“统计”选项卡。在下拉菜单中，选择特定值和距原点参考系的距离。单击“保存”图标。为保存所有更改和分析结果，请点击主工具栏中的保存图标。该方法被用于评估组织界面处的细胞浸润情况。迁移细胞在Z轴上的中位位置从0小时到24小时显著增加，表明细胞发生了明显的垂直移动。沿Z轴的细胞迁移倍数变化在24小时后增加了一倍。采用PLOSMA方法接种的细胞在24小时后表现出从类球体核心显著扩散和迁移的现象。三维重建图像显示，PLOSMA支架中的细胞在24小时后广泛铺展，并可见向外延伸的突起结构。使用“斑点”功能处理后的3D图像显示，细胞在支架中的位置呈分散分布，表明细胞发生了广泛的迁移。细胞迁移的平均距离超过200微米，且在不同样本间结果一致。PLOSMA支架中细胞的Z轴高度折叠变化约为4，表明细胞有显著的向上移动。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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三维胶原基质中细胞迁移的分析

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本文介绍了一种用于实时研究人胶质瘤细胞（hGC）迁移的离体混合单层培养系统。该模型能够在分隔式培养腔内观察hGCs与有髓鞘及无髓鞘轴突之间的相互作用。...

在背根神经节轴突-少突胶质细胞共培养体系中实时监测人胶质瘤细胞迁移

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。...

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在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。...

牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

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