Name: 表征人类肠道菌群中 C-糖苷代谢酶的结构生物学和分析化学方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 了解人类肠道菌群中C-糖苷代谢酶的结构生物学和分析化学综合方法。本研究整合蛋白质纯化、LC-MS/MS和NMR技术，系统表征DgpA/B/C酶的催化机制与晶体结构。

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本研究由北京中医药大学（BUCM）启动基金项目（90011451310011）资助予 W.M.，北京中医药大学抗击新冠肺炎应急基金项目（1000061223476）资助予 W.M.，国家中医药管理局创新团队及人才培育项目（ZYYCXTD-C-202006）资助予 W.M.，以及北京中医药大学研究生自主研究项目（ZJKT2023012）资助予 H.P.。我们感谢马文福实验室所有成员提供的有益讨论。

1. 蛋白质的制备与纯化
<ol>
	<li>表达载体的构建 
	注意：在本研究中，来自人类肠道微生物群的 DgpA、DgpB 和 DgpC 基因， PUE 菌株作为模式系统。第一步是利用表达质粒产生相应的重组蛋白。
	<ol>
		<li>从NCBI获取DgpA/B/C基因簇序列（GenBank: LC422372.1）。随后，商业合成DgpA/B/C DNA，并将DgpA、DgpB和DgpC基因分别克隆至修饰后的pET-28a载体中，以表达带有N端SUMO和6×His标签（His-SUMO标签）的目标蛋白28.</li>
		<li>将 DgpA、DgpB 或 DgpC 质粒分别转化进入 E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞。随后，在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C 培养细菌。</li>
		<li>当菌液密度（OD）达到0.6时，向培养基中加入0.2 mM IPTG。600) 达到 0.6。在 16 °C 下培养细菌 16 小时。</li>
		<li>将表达 DgpA、DgpB 和 DgpC 的细菌培养物分别在 4,000 x&#160;g 4 °C 下离心 20 分钟。将细胞沉淀重悬于 20 mL 缓冲液 A 中（表1每1升细菌培养物</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质纯化 
	注意：高纯度且足量的重组酶对于功能表征和结构生物学研究至关重要。DgpB 与 DgpC 可形成稳定的蛋白质复合物（在裂解过程中会自发形成 DgpB/C 复合物）以实现其功能10,26随后进行 DgpA 蛋白以及 DgpB/C 复合物的纯化。
	<ol>
		<li>向细菌重悬液中加入 1 mM PMSF。将步骤 1.1.4 中的 DgpB 和 DgpC 细菌悬液混合，然后使用超声波细胞破碎仪裂解 DgpA 细菌悬液或 DgpB 与 DgpC 的混合物（以形成有功能的 DgpB/C 复合物）。</li>
		<li>将细菌裂解液在48,000 x g下离心&#160;g 4 °C下孵育40分钟。保留含有蛋白的上清液，弃去细菌沉淀。</li>
		<li>使用镍亲和层析柱（Ni-NTA）从上清液中纯化 DgpA 或 DgpB/C 复合物。用缓冲液 A 和缓冲液 B 建立 0 - 50% 的咪唑浓度梯度，洗脱结合的蛋白质表1在ÄKTA纯化仪中。</li>
		<li>取10 µL洗脱样品，与2 µL 5 × 蛋白上样缓冲液混合，使用垂直电泳系统在220 V条件下进行SDS-PAGE电泳45分钟，随后用考马斯亮蓝染色以显示蛋白质条带。根据SDS-PAGE分析结果，收集含有DgpA或DgpB/C复合物的组分，用于后续实验。 
		注意：带有 His-SUMO 标签（17 kDa）的 DgpA（44 kDa）蛋白条带迁移位置约为 61 kDa图 2D），而带有His-SUMO标签（17 kDa）的DgpC（33 kDa）迁移至约50 kDa处，带有His-SUMO标签（17 kDa）的DgpB（15 kDa）迁移至约33 kDa处（图2J)..</li>
		<li>使用10 kDa截留分子量透析膜，将步骤1.2.3中获得的DgpA或DgpB/C复合物样品在缓冲液C中透析，以去除咪唑，并加入泛素样蛋白酶1（Ubiquitin-like protease 1, ULP1； 材料表) 酶以去除 His-SUMO 标签29.</li>
		<li>将透析后的蛋白质样品加入缓冲液C中（表1) 通过离子交换层析柱（Q柱）。随后，使用由缓冲液C和缓冲液D配制的氯化钠浓度梯度（从100 mM至600 mM）洗脱结合的蛋白质。表1) 在 ÄKTA 纯化仪中。</li>
		<li>按照步骤1.2.3对从Q柱洗脱的DgpA及DgpB/C复合物进行SDS-PAGE分析，注意观察以下分子量：His-SUMO标签（17 kDa）、DgpA（44 kDa）、DgpA的寡聚条带（高于95 kDa）图2E），DgpB（15 kDa）、DgpC（33 kDa）、DgpB 和 DgpC 的寡聚条带（53 kDa 至 95 kDa 之间）（图 2K).</li>
		<li>使用缓冲液 E 通过尺寸排阻色谱柱（SEC）纯化蛋白质表1）使用洗脱组分中的蛋白质进行SDS-PAGE分析，随后用考马斯亮蓝染色以观察蛋白条带。通过SDS-PAGE分析后，收集含有目标蛋白DgpA或DgpB/C复合物的组分。 
		注意：DgpA 条带出现在约 44 kDa 处，而寡聚化的 DgpA 条带位于 95 kDa 以上图2F），而DgpC约为33 kDa，DgpB约为15 kDa，且存在寡聚化的DgpB和DgpC（分子量介于53 kDa至95 kDa之间）（图2L).</li>
		<li>使用纳米分光光度计在280 nm处测定DgpA或DgpB/C复合物的蛋白浓度。随后，利用超滤管将DgpA或DgpB/C复合物浓缩至约20 mg/mL，分装后用液氮速冻。将DgpA或DgpB/C复合物于-80 °C保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>圆二色性（CD）光谱数据采集 
	注意：由于DgpA催化的糖基氧化反应是该代谢途径中的关键起始步骤，因此特别采用圆二色光谱（CD）来验证DgpA的正确折叠状态及其二级结构的完整性。这些结构参数对于酶活性以及蛋白质成功结晶均至关重要。
	<ol>
		<li>用1×PBS缓冲液（pH 7.4）将DgpA蛋白稀释至0.2 mg/mL表1).</li>
		<li>将1× PBS缓冲液（pH 7.4）加入石英比色皿中，使用圆二色光谱仪在200–260 nm范围内记录基线CD光谱，以灵敏检测二级结构和折叠状态的差异27.</li>
		<li>将缓冲液比色皿替换为1.3.1步骤中的蛋白质样品，在200 - 260 nm范围内记录圆二色光谱，并扣除缓冲液基线，得到蛋白质样品的圆二色光谱。</li>
		<li>采集三次扫描以确保准确性，并分析数据以获取二级结构特征和蛋白质折叠状态图 3G, 3H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质晶体学与结构测定
注意：在确认 DgpA 保持正确的折叠和结构完整性后，采用结构生物学方法测定 DgpA 的三维结构。由于 DgpB/C 复合物的催化活性已通过先前的功能实验在生物化学上得到证实10,26,27，因此省略了圆二色（CD）光谱验证步骤。
<ol>
	<li>蛋白质晶体生长与优化
	<ol>
		<li>将0.5 µL纯化的DgpA（20 mg/mL）或DgpB/C复合物（20 mg/mL）与来自结晶试剂盒的储液溶液等体积（0.5 µL）混合，采用悬滴法在48孔结晶板上进行结晶30将晶体板转移至16 °C以进行晶体生长。 
		注意：使用显微镜观察这些悬滴，以确定DgpA或DgpB/C复合物晶体生长的条件（包括蛋白质浓度以及沉淀剂，如PEG 3350、甲酸镁等）。</li>
		<li>采用悬滴蒸汽扩散法对 DgpA 及 DgpB/C 复合物进行结晶条件优化30.</li>
		<li>对于 DgpA，从步骤 2.1.1 确定的条件（20 mM 甲酸镁，20% PEG3350）开始，采用正交优化方法，测试六个 PEG3350 浓度梯度（17%、18%、19%、20%、21% 和 22%）与四个甲酸镁浓度梯度（16 mM、18 mM、20 mM 和 22 mM）的组合30.</li>
		<li>在硅化玻璃盖玻片上混合0.8 µL DgpA蛋白溶液（10或20 mg/mL）与0.8 µL储液，制备结晶液滴。随后将盖玻片倒置于24孔结晶板上，于16 °C孵育以促进晶体生长。</li>
		<li>对于 DgpB/C 复合物的优化，采用相同方法：将 0.8 µL 蛋白复合物（10 或 20 mg/mL）与 0.8 µL 含乙酸镁（16、18、20 或 22 mM）和 PEG 8000（8%、9%、10%、11%、12% 或 13%）的储液混合。同样地，在经硅烷化处理的盖玻片上设置悬滴，置于 24 孔板上，于 16°C 下孵育。</li>
		<li>让DgpA和DgpB/C复合物的蛋白质晶体生长至完全大小，直至晶体停止生长，随后将晶体转移至浸泡溶液中，该溶液含有储液缓冲液以及5 mM的DgpA和DgpB/C复合物底物化合物（葡萄糖和葛根素），在16 °C下浸泡30分钟。</li>
		<li>将晶体（包括含葡萄糖或无底物的 DgpA，以及无底物的 DgpB/C 复合物）转移至含有浸渍缓冲液并添加 25% 甘油的冷冻保护溶液中，立即存于液氮中以备数据收集。 
		注意：尽管 DgpA 和 DgpB/C 复合物晶体均经过底物（葡萄糖和染料木苷）浸泡，但只有葡萄糖成功进入 DgpA 的催化中心。因此，共获得三种不同的晶体形式用于结构分析：含葡萄糖的 DgpA（图3E）；无底物的 DgpA（图3B- C）；以及无底物的 DgpB/C 复合物（图 3D）。冷冻保护剂溶液通过防止蛋白质晶体在液氮中快速冷却时形成冰晶，从而保护晶体的结构完整性，并减少辐射损伤。该溶液通常以母液为基础配制，并添加优化浓度的冷冻保护剂（如甘油或乙二醇）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据收集与结构解析
	<ol>
		<li>在中国上海国家蛋白质科学设施（NFPS）的上海同步辐射光源（SSRF）收集DgpA与葡萄糖结合或无底物状态以及DgpB/C复合物无底物状态的晶体X射线衍射数据，入射波长为0.978 Å。</li>
		<li>使用晶体学数据处理软件处理三组X射线衍射数据，包括DgpA以及DgpB/C复合物的数据31首先加载原始数据，然后依次点击软件中的相应按钮，执行索引（index）、整合（integrate）和标度（scale）功能。生成适用于后续结构解析的已处理输出文件（output.sca）。</li>
		<li>确定 DgpA 在结合葡萄糖或无底物状态下的结构（图3B-摄氏度，3E），以及无底物状态下的 DgpB/C 复合物（图3D) 使用分子置换法（材料表）。然后通过引入相关配体（如葡萄糖、Mn2+，H2O等31.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 反应活性监测与动力学参数的测定
注意：DgpA/B/C 系统介导 C通过明确的两步级联反应实现糖苷类转化：DgpA 首先催化糖基部分的氧化反应，生成中间产物，随后由 DgpB/C 复合物对其进行裂解或异构化10,26,27在本研究中，DgpA/B/C 指负责该反应级联的酶，但需注意 DgpA 与 DgpB/C 复合物之间不存在直接相互作用。这种偶联活性可通过三种互补方法进行严格量化：高效液相色谱产物分析、监测电子传递的 DCPIP 偶联分光光度法检测，或对反应参数进行详细的动力学表征27,32特别是 C通过高效液相色谱法（HPLC，265 nm 紫外检测）分析 DgpA/B/C 催化产生的糖苷裂解产物（大豆苷元）。采用标准校准曲线对产物生成量进行定量（标准曲线的建立方法详见步骤 3.3.2 下方的注释），并通过非线性回归分析将产物生成速率拟合至米氏方程模型，以确定动力学参数。27,32抑制实验通过检测葡萄糖对葛根素C-糖苷键裂解的影响，提供了佐证证据，表明糖类可作为DgpA的底物。随后，DCPIP实验通过监测氧化糖释放的电子将蓝色的2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）还原为无色的白质DCPIP的过程，来检测糖的氧化反应33从而反映 DgpA 的催化活性。
<ol>
	<li>通过高效液相色谱法监测 DgpA/B/C 活性
	<ol>
		<li>在 500 µL 缓冲液 F（表 1）中进行 DgpA/B/C 催化的 C-糖苷裂解或异构化反应，反应体系包含 20 µM DgpA 和 DgpB/C 复合物（来自步骤 1.2.7），以及 0.1 mM 的底物：裂解反应使用染料木素-8-C-葡萄糖苷或葛根素，异构化反应使用大豆苷或染料木苷27。在 37 °C 下反应 8 小时，然后向反应混合物中加入 1.5 mL 甲醇终止反应。</li>
		<li>将反应液在 16,000 × g 下离心 15 分钟，以去除因甲醇导致酶变性而产生的蛋白沉淀。使用 0.22 µm 滤膜过滤上清液。</li>
		<li>采用梯度洗脱方式进行高效液相色谱分析，流速为 1 mL/min，进样体积为 10 µL，检测波长为紫外 265 nm。 
		注：流动相为乙腈（流动相 A）和 0.1% 乙酸水溶液（流动相 B），采用梯度洗脱程序。流动相梯度如下：0–5 分钟为 5%–20% A，5–15 分钟为 20%–45% A，15–18 分钟为 45%–52% A，18–19 分钟为 52%–55% A，19–21 分钟为 55%–5% A，21–23 分钟为 5% A。DgpA/B/C 酶系统对大豆苷和染料木苷等底物表现出显著不同的催化效率，导致其产物生成速率存在明显差异。为定量评估底物转化动力学及产物积累动态，采用高效液相色谱在 0、2、4、6、12、16、20、24、36 和 48 小时时间点进行系统的时间进程分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）法监测 DgpA 活性 
	注：DCPIP 法通过检测蓝色 DCPIP 接受氧化糖释放的电子后还原为无色的白质 DCPIP 的过程，来监测糖的氧化反应33。本实验采用 DCPIP 报告系统检测野生型 DgpA 及其糖结合缺陷突变体对不同糖基化化合物、单糖、二糖或多糖的氧化活性。所用蛋白包括野生型 DgpA 及其糖结合缺陷突变体 D182A、Δ(308–316) 和 Δ(311–316)27。
	<ol>
		<li>在 1×&#160;PBS 缓冲液（pH 7.4）中，将 0.8 mM DCPIP 与 50 µM 蛋白（包括野生型 DgpA 及其三种糖结合缺陷突变体 DgpA D182A、DgpA Δ(308–316) 或 DgpA Δ(311–316)）以及 10 mM 底物（包括葛根素、牡荆素、染料木苷、可溶性淀粉、麦芽三糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖或麦芽糖）共同孵育。</li>
		<li>反应 20 小时后，使用酶标仪在 600 nm 处记录 DCPIP 吸光度的变化33。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定葡萄糖对葛根素 C-糖苷键裂解反应的抑制率 
	注：DgpA 属于糖氧化还原酶家族，能够氧化 C-糖苷中的糖基部分。图 3E 显示葡萄糖结合于 DgpA 的催化中心，DgpA 结构测定的具体步骤详见步骤 2.2.3。为研究葡萄糖与 C-糖苷葛根素在 DgpA 上的竞争性结合，进行了以下实验。
	<ol>
		<li>在 1 × PBS 缓冲液（pH 7.4）中进行反应。向葛根素（C-糖苷）裂解反应体系中加入不同浓度的葡萄糖（1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、80 mM 和 100 mM），反应条件同步骤 3.1 所述。在 37 °C 下反应 12 小时。</li>
		<li>利用标准品（标准大豆苷元）的高效液相色谱校准曲线对产物（大豆苷元）进行定量分析。首先计算含不同葡萄糖浓度的反应与未受抑制的 C-糖苷裂解反应（无葡萄糖）之间的产物产量差值，再将该差值除以未受抑制反应的产物产量，从而计算出抑制率。 
		注：为建立定量高效液相色谱分析用校准曲线，需配制参考标准品（如葛根素或大豆苷元）的系列稀释液，浓度范围例如为 0.1–1 mM（以 0.1 mM 为增量）。通过高效液相色谱分析各浓度样品，记录峰面积，并将其对相应标准浓度作图。进行线性回归分析（y = mx + b，其中 y 为峰面积，x 为浓度），建立标准曲线。利用该回归方程可根据样品测得的峰面积推算其未知浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动力学参数的测定 
	注：动力学参数被广泛认为是定量评估酶催化效率的关键金标准。为定量评估 DgpA/B/C 催化的反应，测定了 DgpA/B/C 催化葛根素（C-糖苷）裂解反应的动力学参数。
	<ol>
		<li>为 DgpA/B/C 催化的 C-糖苷裂解反应配制底物 C-糖苷（葛根素）的浓度梯度（浓度范围为 0.01 至 4 mM，按 2 倍递增）。</li>
		<li>按照步骤 3.1 所述方法，在 37 °C 下反应 8 小时。利用标准大豆苷元的高效液相色谱校准曲线对产物（大豆苷元）进行定量分析。然后将定量得到的产物量除以反应时间，计算反应速率（即产物生成速率）。</li>
		<li>使用统计软件（材料表）将计算得到的反应速率与底物浓度拟合至米氏-门顿（Michaelis-Menten）模型，以确定 Km 和 kcat 动力学参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 反应中间产物的制备与检测
注意：除了具有 C-糖苷键断裂活性外，DgpA/B/C 还可催化 O-糖苷异构化为 C-糖苷。因此，当以 O-糖苷作为 DgpA/B/C 的底物时，反应中间产物将以异构化的 C-糖苷形式生成。为了表征中间产物（芒柄花素），对该中间化合物进行了纯化，并随后采用分析化学手段（包括液相色谱-串联质谱 LC-MS/MS 和核磁共振 NMR 波谱）进行分析。
<ol>
	<li>DgpA/B/C 催化的 C-糖苷异构化反应中反应中间产物的制备27
	<ol>
		<li>采用 0.2 mM O-糖苷（大豆苷）作为底物，20 µM DgpA 和 DgpB/C 复合物，在 90 mL 反应体系中，按照上述步骤 3.1 所述方案进行 DgpA/B/C 催化的 O 至 C-糖苷异构化反应。</li>
		<li>采用制备型高效液相色谱（HPLC），按照梯度洗脱策略纯化中间产物 C-糖苷（葛根素）。 
		注：流动相为乙腈（流动相 A）和 0.1% 乙酸水溶液（流动相 B），采用梯度洗脱。流动相梯度洗脱程序如下：0–5 分钟，5%–20% A；5–15 分钟，20%–45% A；15–18 分钟，45%–52% A；18–19 分钟，52%–55% A；19–21 分钟，55%–5% A；21–23 分钟，5% A。</li>
		<li>使用步骤 3.3.2 中的标准校准 HPLC 曲线计算纯化后中间产物的浓度，在步骤 4.1.1 的 90 mL 反应体系中可获得约 6 mg 葛根素，随后使用真空离心浓缩仪将纯化后的中间产物干燥，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用 LC-MS/MS 表征反应中间产物
	<ol>
		<li>收集步骤 4.1.3 中获得的干燥中间产物。称取 100 µg 来自大豆苷反应的中间产物，溶于 2 mL 甲醇中，得到终浓度为 50 µg/mL 的溶液。在 13,500 x&#160;g 条件下离心 10 分钟，收集上清液用于 LC-MS/MS 分析。</li>
		<li>采用与步骤 4.1.2 相同的 HPLC 梯度洗脱程序进行 LC-MS/MS 分析，进样体积为 5 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用 NMR 表征反应中间产物
	<ol>
		<li>将来自大豆苷反应的 4 mg 纯化中间产物溶于 340 µL 二甲基亚砜-d6&#160;中，用于 1H 和 13C 核磁共振（NMR）波谱分析。仪器参数设置如下：温度 298 K，匀场 3 次，脉冲宽度 18 µs，弛豫延迟 1.5 s，扫描次数 48 次，其余参数设为默认值27。</li>
		<li>使用 600 MHz NMR 仪器采集 NMR 1H 和 13C 谱图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+aloesin+and+related+compounds+by+human+intestinal+bacteria%3A+a+bacterial+cleavage+of+the+C-glucosyl+bond+and+the+subsequent+reduction+of+the+acetonyl+side+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Pharm+Bull+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain.</a> Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).</li>
<li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+mechanism+of+intestinal+bacteria+in+enzymatic+cleavage+of+C-C+glycosidic+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).</li>
<li>HATTORI, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+barbaloin+by+intestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Pharm+Bull+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria.</a> Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).</li>
<li>Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+human+intestinal+bacterium+capable+of+transforming+barbaloin+to+aloe-emodin+anthrone1%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+medica%22%5BJournal%5D)">Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1.</a> Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).</li>
<li>Braune, A., Blaut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deglycosylation+of+puerarin+and+other+aromatic+C-glucosides+by+a+newly+isolated+human+intestinal+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium.</a> Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).</li>
<li>Braune, A., Blaut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+bacterium+Eubacterium+cellulosolvens+deglycosylates+flavonoid+C-and+O-glucosides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).</li>
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<li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+Enterococcus+gallinarum+P581a%2C+a+strain+of+intestinal+bacteria+deglycosylating+flavone+C-glycosides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides.</a> J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).</li>
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<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newly+isolated+human+intestinal+bacterium+strain+capable+of+deglycosylating+flavone+C-glycosides+and+its+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties.</a> Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).</li>
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<li>Karpinska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degradation+of+MLK3+by+a+novel+CEP1347-VHL-02+PROTAC+compound+limits+the+oncogenic+potential+of+TNBC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC.</a> J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

目前，领域内对C-糖苷代谢酶的结构与功能特征仍不清楚，且缺乏适当的研究方法10,24,26。本研究利用化学与生物技术相结合的显著优势40,41,42,43,44,45，提出一种整合结构生物学、酶学及其他生物技术手段，并结合LC-MS/MS和NMR等化学技术的研究方法，用于探究肠道微生物中C-糖苷代谢酶的结构与功能特征。利用这些方法，我们对DgpA和DgpB/C复合物进行了结构表征。DgpA的结构与活性数据揭示了其底物特异性的机...

近年来，人类肠道微生物群因其在维持宿主健康方面的重要作用而受到广泛关注1,2。这些微生物群落能够代谢宿主来源的化合物，产生具有生物活性的代谢产物1,2,3。例如，黄酮类化合物是我们日常饮食中含量最丰富的天然化合物之一，主要以O-或C-糖苷形式存在，而这些糖苷在人体肠道中吸收较差4。然而，肠道微生物群可将这些糖苷转化为更具生物活性的衍生物，如次级糖苷或苷元，降低其溶解度并增强吸收能力，从而使其相较于原始形式具有更强的生物活性5,6。
历史上，O-糖苷的水解机制已被广泛研究7,8。而C-糖苷由于具有C-C糖苷键，表现出更高的化学稳定性并更耐降解9,10。尽管如此，某些肠道细菌已进化出降解C-糖苷的能力11,12。1988年，Hattori 等人首次证明某些肠道细菌能够从C-糖苷上移除糖基13。随后的研究分离出首株具备该能力的细菌菌株，从而推动了对C-糖苷裂解机制的进一步探索14。然而迄今为止，仅有少数几种肠道细菌菌株及C-糖苷代谢酶被鉴定和表征14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。最近的研究表明，PUE菌株中裂解葛根素（大豆苷元-8-C-葡萄糖苷）的酶（DgpA/B/C）可通过两步反应将葛根素裂解为大豆苷元和葡萄糖：首先由Gfo/Idh/MocA家族氧化还原酶DgpA将葛根素氧化为3''-氧代-葛根素，随后在DgpB/C复合物介导下发生β-消除反应，生成苷元和葡萄糖10,26。然而，C-糖苷代谢酶（特别是DgpA/B/C系统）的结构与功能特征仍不完全清楚，该领域研究亟需更先进的方法学，尤其是生物学与化学策略的整合，以推动深入研究24。
为解决这一空白，我们采用整合的多学科方法研究人类肠道微生物群中 DgpA/B/C 催化的反应 C-糖苷代谢反应。在此反应中，DgpA 催化糖基的氧化反应 C-糖苷，随后，DgpB 和 DgpC 形成一种 DgpB/C 复合物，该复合物特异性切割氧化的 C糖苷产物10,26,27我们首先分别进行了DgpA和DgpB/C的重组表达与纯化。随后对纯化的DgpA和DgpB/C蛋白进行结晶，并通过X射线晶体学解析了它们的三维结构。最后，我们重建了 C使用完整的 DgpA/B/C 酶系统进行糖苷键裂解功能研究，并进行全面的代谢产物分析 通过 联用液相色谱-串联质谱与核磁共振波谱技术27基于这些方法，我们已开展研究 C由 DgpA/B/C 酶系统催化的糖苷代谢。

<table><tbody><tr><td>2,6-二氯靛酚（DCPIP）</td><td>Solarbio Science and Technology</td><td>D6350</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（&amp;beta;-ME）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08168</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp; 5 &amp;times; 蛋白上样缓冲液</td><td>Sangon Biotech</td><td>C508320</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>上海麦克林生化科技有限公司</td><td>A111247</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;?Invitrogen</td><td>A12147</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III HD 700 MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td>AVANCE III HD 700MHz</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td>AVANCE III 400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>022620601</td><td></td></tr><tr><td>Chirascan&amp;trade; plus 圆二色光谱仪</td><td>Applied Photophysics</td><td>Chirascan&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>大豆苷元</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>B20227</td><td></td></tr><tr><td>大豆苷</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>B20226</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Solarbio Science and Technology</td><td>D8220</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 BL21 (DE3) 感受态细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;?Invitrogen</td><td>EC0114</td><td></td></tr><tr><td>染料木素</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>S31565</td><td></td></tr><tr><td>染料木素-8-C-葡萄糖苷</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>BP2095</td><td></td></tr><tr><td>染料木苷</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>S31591</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad Software</td><td>Version?Prism 9</td><td>用于计算 K&lt;sub&gt;m&lt;/sub&gt; 和 k&lt;sub&gt;cat&lt;/sub&gt; 动力学参数</td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 pg 制备型尺寸排阻色谱柱</td><td>Cytiva</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP His标签蛋白纯化柱</td><td>Cytiva</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q FF 阴离子交换色谱柱</td><td>Cytiva</td><td>17515601</td><td></td></tr><tr><td>HKL-3000</td><td>HKL Research 公司</td><td>&amp;nbsp;版本 723</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 色谱柱 TC-C18(2)，170&amp;Aring;，5 &amp;micro;m，4.6 × 250 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>518925-902</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHG0010</td><td></td></tr><tr><td>乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17814</td><td></td></tr><tr><td>LC-20AT 高效液相色谱系统</td><td>岛津</td><td>LC20AT</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47288</td><td></td></tr><tr><td>麦芽三糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443713</td><td></td></tr><tr><td>氯化锰</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>S31112</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;?Invitrogen</td><td>M23142</td><td></td></tr><tr><td>NAD&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Solarbio Science and Technology</td><td>N8110</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX12 体视显微镜</td><td>OLYMPUS&amp;nbsp;</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Phenix 开发团队</td><td>1.21.2</td><td>Phenix 是一套全面的蛋白质晶体结构解析软件套件，集成了使用 Phaser 软件的 SAD（单波长反常衍射）和 MR（分子置换）方法。</td></tr><tr><td>制备型高效液相色谱仪</td><td>Waters</td><td>2545/2998</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质结晶筛选试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098</td><td></td></tr><tr><td>葛根素</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>B20446</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>上海智楚仪器有限公司</td><td>&amp;nbsp;ZQZY-AF8</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin&amp;trade; 透析膜，10 kDa 截留分子量，35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;?Invitrogen</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>可溶性淀粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LYNX 6000 超高速离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;</td><td>75006590</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪</td><td>MOLECULAR DEVICES</td><td>SpectraMax i3x&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax QuickDrop 微体积分光光度计规格</td><td>MOLECULAR DEVICES</td><td>QuickDrop</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>SunFire C18 OBD 制备柱</td><td>Waters</td><td>186002741</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVE 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;?Invitrogen</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>泛素样蛋白酶 1</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;trade;?Invitrogen</td><td>12588018</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>905GP-ULTS</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>北京金曼技术有限公司</td><td>CV600</td><td></td></tr><tr><td>牡荆素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49513</td><td></td></tr></tbody></table>

结构生物学与分析化学方法在表征中的应用 c人类肠道微生物群中的糖苷代谢酶

Structural Biology and Analytical Chemistry Approaches for Characterizing C-Glycoside Metabolic Enzymes in Human Gut Microbiota

肠道微生物群作为宿主健康的關鍵調控因子日益受到關注，尤其因其能夠代謝飲食中的糖苷類物質。與O-糖苷相比，C-糖苷具有更優異的化學穩定性和對酶解作用的抵抗能力，但特定的腸道細菌仍可選擇性地代謝這類物質，從而提高其生物利用度。儘管微生物來源的C-糖苷酶已被鑑定，其精確的反應機制尚未完全闡明，且目前尚缺乏研究這些過程的標準化方法。為填補這一空白，我們提出了一種整合性的多學科方法，結合結構生物學、酶學以及分析技術，包括液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR），以系統性地表徵這些酶活性。這一綜合性方法能夠在分子、酶學及代謝層面精確解析C-糖苷的代謝過程。

遵循以下所述的步骤 图1，我们首先在 E. coli BL21(DE3) 细胞。由于 DgpB 和 DgpC 会形成稳定的酶复合物（DgpB/C 复合物）10,26,27,34，表达这两种蛋白的细胞被混合用于共纯化。细胞裂解后，通过48,000 x g离心收集上清液。 g 40 分钟 4 °C 并进行镍亲和层析。结合的蛋白质使用 Buffer A 中的咪唑线性梯度（0-500 mM）洗脱图 2A, 2G）。DgpA 在 280 nm 处的紫外吸收曲线（图 2...

近期研究表明，人类肠道微生物群的酶在代谢C-糖苷中发挥重要作用。本文介绍了一种综合性方法，结合分析化学技术（LC-MS/MS 和 NMR）与结构生物学手段，系统性地表征这些C-糖苷代谢酶的结构特征及酶促反应过程。

结构生物学与分析化学方法在表征中的应用 C人类肠道微生物群中的糖苷代谢酶

肠道微生物群已成为宿主健康的关键调节因子，尤其是因其能够代谢膳食糖苷。虽然……

用于表征人类肠道微生物组中C-糖苷代谢酶的结构生物学与分析化学方法。实验方案一：蛋白质的表达与纯化。表达载体的构建。从 NCBI 获取基因簇序列 GenBank LC422372.1。将基因克隆至修饰的 pET-28a 载体中。将质粒转化至大肠杆菌 BL21 DE3 感受态细胞中。随后在含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中，于37摄氏度培养细菌。当菌液密度OD600达到0.6时，向培养基中加入0.2毫摩尔IPTG。于16摄氏度继续培养细菌16小时。在 4,000 × g 条件下，4 °C 离心细菌培养物。弃去上清液，保留细菌沉淀。用缓冲液 A 重悬细菌沉淀。蛋白质纯化。向细菌重悬液中加入一毫摩尔的PMSF。使用超声波细胞破碎仪裂解细菌悬液。在4°C条件下，以48,000 ×g离心细菌裂解物40分钟。使用镍亲和层析NTA柱纯化上清液中的蛋白质。用缓冲液B进行梯度洗脱结合的蛋白质。收集在280纳米处具有高紫外吸收值且SDS-PAGE显示清晰蛋白条带的样品，用于下一步实验。用缓冲液C对样品进行透析。使用离子交换层析柱纯化透析后的蛋白质。用缓冲液C将目标蛋白结合到层析柱上。用缓冲液D的组分洗脱结合的蛋白质。使用缓冲液E通过凝胶过滤层析柱进一步纯化蛋白质。收集蛋白质样品用于下一步实验。将蛋白样品浓缩至20毫克/毫升，分装后用液氮迅速冷冻，于-80 °C保存以备后续使用。使用QuickDrop在280纳米紫外波长下测定蛋白浓度。圆二色性（CD）光谱数据采集。将蛋白质用1倍PBS缓冲液（pH 7.4）稀释至0.2毫克/毫升。设置仪器扫描速度为50纳米/分钟，光谱带宽为1纳米。在200至260纳米波长范围内采集CD光谱数据。扣除PBS背景信号，并取三次测量的平均值。二、蛋白质晶体学与结构测定。蛋白质晶体生长与优化。使用48孔晶体板和蛋白质结晶试剂盒，采用坐滴法进行结晶的初步筛选。通过悬滴法设置沉淀剂和蛋白质浓度梯度，以优化蛋白质结晶条件。晶体完全生长后，将其转移至含有储液缓冲液和目标化合物的浸泡溶液中，在16摄氏度下孵育30分钟。随后将晶体转移至冷冻保护溶液中，该溶液为添加了25%甘油的结晶缓冲液，并立即存于液氮中以进行数据收集。进行蛋白质晶体的数据收集与结构测定。使用位于国家同步辐射研究设施（NFPS）的上海同步辐射光源（SSRF）线站，以0.978埃的入射波长收集完整的X射线衍射数据。首先使用晶体学数据处理软件对晶体衍射数据进行处理。采用自动数据处理程序进行相位确定。使用晶体结构测定软件进行自动结构模型的精修与优化。三、反应活性监测及动力学参数的测定。通过高效液相色谱法（HPLC）监测 DgpA/B/C 的活性。在 pH 7.4 的 PBS 缓冲液中配制 C-糖苷裂解反应体系，体系中包含 20 微摩尔/毫升 DgpA/B/C、1 毫摩尔/升锰离子、1 毫摩尔/升 NAD、10 毫摩尔/升 DTT 以及 0.1 毫摩尔/升底物（染料木苷、大豆苷、葛根素）。用移液器充分混匀，37 摄氏度孵育 8 小时。向反应体系中加入三倍体积的甲醇以终止反应。将反应溶液在16,000 ×g下离心15分钟，以去除沉淀。使用0.22微米滤膜过滤上清液。采用梯度洗脱进行高效液相色谱分析，流速为1毫升/分钟，检测波长为紫外265纳米，进样体积为10微升。使用2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）检测DgpA活性。在1倍PBS缓冲液（pH 7.4）中孵育0.8毫摩尔/升DCPIP、50微摩尔/升蛋白和10毫摩尔/升底物。反应20小时后，使用微孔板读数仪在600纳米处记录DCPIP的吸光度变化。测定葡萄糖对葛根素C-糖苷键断裂反应的抑制率。在3.1节所述条件下，于1倍PBS缓冲液（pH 7.4）中，向反应体系加入不同浓度的葡萄糖，37°C下反应12小时。采用高效液相色谱法（HPLC）对生成产物进行定量分析，并测定动力学参数。在DgpA/B/C C-糖苷裂解反应中，葛根素的浓度设定为0.01至4毫摩尔每升，大豆苷和染料木苷的浓度设定为0.01至2毫摩尔每升。按照第3.1节所述方法，在37摄氏度下反应八小时。使用Prism软件将计算得到的反应速率与底物浓度拟合到米氏方程（Michaelis-Menten）模型中，以获得Km和kcat动力学参数。四、反应中间产物的制备与检测。反应中间产物的制备。以染料木苷和大豆苷为底物，按照3.1节所述方法在90毫升反应体系中进行反应。使用制备型高效液相色谱仪和制备型液相色谱柱纯化中间产物。将纯化后的中间产物用真空离心浓缩仪干燥，以备后续使用。采用液相色谱-质谱法（LC-MS）对反应中间产物进行表征。取部分经纯化的染料木苷和大豆苷反应中间产物，溶于甲醇中，配制成浓度为每毫升50微克的各化合物溶液。在13,500 × g条件下离心10分钟，收集上清液用于LC-MS/MS分析。LC-MS分析采用与HPLC分析相同的梯度洗脱程序，进样体积为5 µL。利用核磁共振（NMR）对反应中间产物进行表征。将染料木苷反应的纯化中间产物部分溶解于六重氘代二甲基亚砜中，用于氢和碳13核磁共振波谱分析。使用核磁共振仪在400兆赫条件下记录氢谱，在175兆赫条件下记录碳13谱。代表性结果。总体而言，我们设计了一种综合实验方法，包括蛋白质的表达与纯化、结晶实验、活性测定以及反应产物结构的鉴定，如图一所示。具体而言，我们通过三步纯化色谱法，即离子交换色谱和凝胶过滤色谱，获得了高纯度的蛋白质，如图二所示。在结晶实验中，我们测定了 DgpA 以及 DgpB/C 复合物的晶体结构，其分辨率分别为 2.7 埃和 2.1 埃，如图 3A 至 3D 所示。我们进一步发现，DgpA 在其六聚体形式中呈现自抑制构象，如图 3B 和 3C 所示，该构象通过图 3F 中的 DCPIP 还原实验得到了验证。接着，我们发现葡萄糖在 DgpA 底物识别口袋中与关键氨基酸形成了氢键网络，如图 3E 所示。基于这一发现，我们设计了突变体，并利用动力学参数评估了它们的底物切割活性，结果如图 3J 所示。有趣的是，在 O-糖苷类黄酮和 DgpA/B/C 的裂解过程中，我们在图 4A 和 4B 中观察到中间产物的形成。通过图 4C 至 4H 的核磁共振（NMR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，这些中间产物被鉴定为 C-糖苷类黄酮，表明 DgpA/B/C 能够将 O-糖苷转化为 C-糖苷。结论：我们率先将化学与生物技术相结合，研究 C-糖苷代谢酶的结构与功能特性，证明这是一种合理且可行的解决方案。该方法填补了该领域研究方法上的空白，并可轻松应用于其他具有不同代谢功能的基因。因此，它也为今后研究其他肠道微生物功能蛋白的结构与功能特征提供了新的参考模型。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

表征人类肠道菌群中 C-糖苷代谢酶的结构生物学和分析化学方法

本文介绍了一种特异且灵敏的方法，用于深入了解免疫器官和细胞中糖鞘脂抗原的表达谱。该方法利用离子阱质谱技术，通过逐步裂解糖鞘脂分子，并与化学合成的标准品进行比较，实现对分子结构的分析。...

糖鞘脂抗原的质谱分析

来源：Hu, Y. et.al., 利用体外批次发酵系统分析内源性物质与人体肠道微生物群之间的相互作用。J. Vis. Exp.

探究人类肠道微生物对胞外多糖的活性作用

通过稳定同位素示踪（SIP）结合焦磷酸测序技术，确定了与埃及棉铃虫（Spodoptera...

通过使用 13C-葡萄糖的DNA稳定同位素示踪法鉴定广食性昆虫Spodoptera littoralis肠道中具有代谢活性的细菌

一种用于酶筛选的高通量检测方法被描述。该多重即用型检测试剂盒包含预先选定的 C显色 P聚合物 H水凝胶（CPH）基质与复杂 我不溶性 C显色 B生物质（ICB）底物。靶向酶为多糖降解酶...

高通量筛选碳水化合物降解酶的新型不溶性显色底物检测试剂盒

本文介绍了一种在体外培养结肠肠道微生物群的实验方案,...

应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

本文介绍了一种利用全细胞生物传感器对岩藻糖基化人乳寡糖（HMOs）进行高通量检测与定量的方法。同时，我们还展示了该平台在HMO生产菌株分析中的应用，重点在于提高信噪比。...

利用基因编码生物传感器在生物技术背景下分析岩藻糖基化人乳三糖

本文描述了一种利用体外批次发酵系统研究内源性物质与人类肠道微生物群相互作用的实验方案。...

利用体外批次发酵系统分析内源性代谢物与人体肠道微生物群的相互作用

利用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

本研究建立了一套标准操作程序（SOP），用于高效筛选和分离能够裂解C-糖苷的肠道细菌。...

筛选与分离可裂解C-糖苷的肠道细菌

了解人类肠道菌群中C-糖苷代谢酶的结构生物学和分析化学综合方法。本研究整合蛋白质纯化、LC-MS/MS和NMR技术，系统表征DgpA/B/C酶的催化机制与晶体结构。

结构生物学与分析化学方法在表征中的应用 C人类肠道微生物群中的糖苷代谢酶

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