结构生物学与分析化学方法在表征中的应用 C人类肠道微生物群中的糖苷代谢酶

用于表征人类肠道微生物组中C-糖苷代谢酶的结构生物学与分析化学方法。实验方案一：蛋白质的表达与纯化。表达载体的构建。

从 NCBI 获取基因簇序列 GenBank LC422372.1。将基因克隆至修饰的 pET-28a 载体中。将质粒转化至大肠杆菌 BL21 DE3 感受态细胞中。

随后在含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中，于37摄氏度培养细菌。当菌液密度OD600达到0.6时，向培养基中加入0.2毫摩尔IPTG。于16摄氏度继续培养细菌16小时。

在 4,000 × g 条件下，4 °C 离心细菌培养物。弃去上清液，保留细菌沉淀。用缓冲液 A 重悬细菌沉淀。蛋白质纯化。

向细菌重悬液中加入一毫摩尔的PMSF。使用超声波细胞破碎仪裂解细菌悬液。在4°C条件下，以48,000 ×g离心细菌裂解物40分钟。

使用镍亲和层析NTA柱纯化上清液中的蛋白质。用缓冲液B进行梯度洗脱结合的蛋白质。收集在280纳米处具有高紫外吸收值且SDS-PAGE显示清晰蛋白条带的样品，用于下一步实验。

用缓冲液C对样品进行透析。使用离子交换层析柱纯化透析后的蛋白质。用缓冲液C将目标蛋白结合到层析柱上。用缓冲液D的组分洗脱结合的蛋白质。使用缓冲液E通过凝胶过滤层析柱进一步纯化蛋白质。收集蛋白质样品用于下一步实验。

将蛋白样品浓缩至20毫克/毫升，分装后用液氮迅速冷冻，于-80 °C保存以备后续使用。使用QuickDrop在280纳米紫外波长下测定蛋白浓度。

圆二色性（CD）光谱数据采集。将蛋白质用1倍PBS缓冲液（pH 7.4）稀释至0.2毫克/毫升。设置仪器扫描速度为50纳米/分钟，光谱带宽为1纳米。

在200至260纳米波长范围内采集CD光谱数据。扣除PBS背景信号，并取三次测量的平均值。二、蛋白质晶体学与结构测定。

蛋白质晶体生长与优化。使用48孔晶体板和蛋白质结晶试剂盒，采用坐滴法进行结晶的初步筛选。通过悬滴法设置沉淀剂和蛋白质浓度梯度，以优化蛋白质结晶条件。

晶体完全生长后，将其转移至含有储液缓冲液和目标化合物的浸泡溶液中，在16摄氏度下孵育30分钟。随后将晶体转移至冷冻保护溶液中，该溶液为添加了25%甘油的结晶缓冲液，并立即存于液氮中以进行数据收集。进行蛋白质晶体的数据收集与结构测定。

使用位于国家同步辐射研究设施（NFPS）的上海同步辐射光源（SSRF）线站，以0.978埃的入射波长收集完整的X射线衍射数据。首先使用晶体学数据处理软件对晶体衍射数据进行处理。采用自动数据处理程序进行相位确定。

使用晶体结构测定软件进行自动结构模型的精修与优化。三、反应活性监测及动力学参数的测定。通过高效液相色谱法（HPLC）监测 DgpA/B/C 的活性。

在 pH 7.4 的 PBS 缓冲液中配制 C-糖苷裂解反应体系，体系中包含 20 微摩尔/毫升 DgpA/B/C、1 毫摩尔/升锰离子、1 毫摩尔/升 NAD、10 毫摩尔/升 DTT 以及 0.1 毫摩尔/升底物（染料木苷、大豆苷、葛根素）。用移液器充分混匀，37 摄氏度孵育 8 小时。向反应体系中加入三倍体积的甲醇以终止反应。

将反应溶液在16,000 ×g下离心15分钟，以去除沉淀。使用0.22微米滤膜过滤上清液。采用梯度洗脱进行高效液相色谱分析，流速为1毫升/分钟，检测波长为紫外265纳米，进样体积为10微升。

使用2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）检测DgpA活性。在1倍PBS缓冲液（pH 7.4）中孵育0.8毫摩尔/升DCPIP、50微摩尔/升蛋白和10毫摩尔/升底物。反应20小时后，使用微孔板读数仪在600纳米处记录DCPIP的吸光度变化。

测定葡萄糖对葛根素C-糖苷键断裂反应的抑制率。在3.1节所述条件下，于1倍PBS缓冲液（pH 7.4）中，向反应体系加入不同浓度的葡萄糖，37°C下反应12小时。

采用高效液相色谱法（HPLC）对生成产物进行定量分析，并测定动力学参数。在DgpA/B/C C-糖苷裂解反应中，葛根素的浓度设定为0.01至4毫摩尔每升，大豆苷和染料木苷的浓度设定为0.01至2毫摩尔每升。

按照第3.1节所述方法，在37摄氏度下反应八小时。使用Prism软件将计算得到的反应速率与底物浓度拟合到米氏方程（Michaelis-Menten）模型中，以获得Km和kcat动力学参数。四、反应中间产物的制备与检测。

反应中间产物的制备。以染料木苷和大豆苷为底物，按照3.1节所述方法在90毫升反应体系中进行反应。使用制备型高效液相色谱仪和制备型液相色谱柱纯化中间产物。

将纯化后的中间产物用真空离心浓缩仪干燥，以备后续使用。采用液相色谱-质谱法（LC-MS）对反应中间产物进行表征。取部分经纯化的染料木苷和大豆苷反应中间产物，溶于甲醇中，配制成浓度为每毫升50微克的各化合物溶液。

在13,500 × g条件下离心10分钟，收集上清液用于LC-MS/MS分析。LC-MS分析采用与HPLC分析相同的梯度洗脱程序，进样体积为5 µL。利用核磁共振（NMR）对反应中间产物进行表征。

将染料木苷反应的纯化中间产物部分溶解于六重氘代二甲基亚砜中，用于氢和碳13核磁共振波谱分析。使用核磁共振仪在400兆赫条件下记录氢谱，在175兆赫条件下记录碳13谱。

代表性结果。总体而言，我们设计了一种综合实验方法，包括蛋白质的表达与纯化、结晶实验、活性测定以及反应产物结构的鉴定，如图一所示。具体而言，我们通过三步纯化色谱法，即离子交换色谱和凝胶过滤色谱，获得了高纯度的蛋白质，如图二所示。

在结晶实验中，我们测定了 DgpA 以及 DgpB/C 复合物的晶体结构，其分辨率分别为 2.7 埃和 2.1 埃，如图 3A 至 3D 所示。我们进一步发现，DgpA 在其六聚体形式中呈现自抑制构象，如图 3B 和 3C 所示，该构象通过图 3F 中的 DCPIP 还原实验得到了验证。接着，我们发现葡萄糖在 DgpA 底物识别口袋中与关键氨基酸形成了氢键网络，如图 3E 所示。基于这一发现，我们设计了突变体，并利用动力学参数评估了它们的底物切割活性，结果如图 3J 所示。

有趣的是，在 O-糖苷类黄酮和 DgpA/B/C 的裂解过程中，我们在图 4A 和 4B 中观察到中间产物的形成。通过图 4C 至 4H 的核磁共振（NMR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，这些中间产物被鉴定为 C-糖苷类黄酮，表明 DgpA/B/C 能够将 O-糖苷转化为 C-糖苷。结论：我们率先将化学与生物技术相结合，研究 C-糖苷代谢酶的结构与功能特性，证明这是一种合理且可行的解决方案。该方法填补了该领域研究方法上的空白，并可轻松应用于其他具有不同代谢功能的基因。

因此，它也为今后研究其他肠道微生物功能蛋白的结构与功能特征提供了新的参考模型。