活体成像观察离体幼年斑马鱼神经肌肉接头中的突触囊泡循环

我们以斑马鱼幼鱼的神经肌肉接头作为模型系统，研究突触传递的分子与细胞机制。我们致力于阐明在不同生理和病理条件下突触调控的机制。本实验方案使我们能够以更高的灵敏度观察斑马鱼幼鱼神经肌肉接头中由动作电位诱导的新突触传递。

我们可以监测由中等强度刺激引发的突触功能，而该功能此前尚未被检测过。该成像方案可在常规的落射荧光显微镜下完成，无需一定使用共聚焦激光扫描显微镜。换言之，与其他实验装置相比，该方法为神经肌肉功能的成像提供了一个更具成本效益的平台。

配制 200 毫升细胞外液，需混合 6.4 毫升 3.5 摩尔的氯化钠、0.4 毫升 1 摩尔的氯化钾、1 毫升 1 摩尔的 HEPES、0.4 毫升 1 摩尔的氯化钙、0.2 毫升 1 摩尔的氯化镁以及 360 毫克葡萄糖。然后加入超纯水至总体积为 200 毫升。为配制含 3 微摩尔 D-筒箭毒碱的 100 毫升细胞外液，可加入 20 微升 15 毫摩尔的 D-tubocurarine 储存液。

配制含有0.02%三卡因的25毫升细胞外溶液时，将0.5毫升1%三卡因储备液加入25毫升溶液中。使用微电极拉制仪将θ型玻璃毛细管拉制，直至尖端直径达到3至10微米范围内。用细胞外溶液填充该微电极。

将一根细铂丝插入毛细管的每个开口中，并将θ形玻璃移液电极固定在电动显微操作器的电极夹持器上。然后将每根导线的后端连接至刺激隔离器。取25毫升含有0.02%三卡因的细胞外溶液置于玻璃培养皿中，将一条斑马鱼幼鱼转移至该培养皿中以进行解剖。

使用两把精细镊子剥离幼虫的皮肤。用第一把镊子固定幼虫，另一把镊子夹住鳔背侧的皮肤。然后用手术刀去除鳔、内脏和头部。

使用尖端经火焰抛光的玻璃巴斯德移液管，将解剖好的斑马鱼样品转移至成像室。用尼龙线将样品固定在C形铂丝上，以使其方向大致与刺激电极平行。通过重力灌流系统以每分钟1毫升的流速灌注含有3微摩尔D-筒箭毒碱的细胞外溶液。

接下来，将刺激电极插入脊髓。小心地将电极尖端置于脊髓运动神经元附近，这些神经元为位于脊髓腹侧的TagRFP阳性神经元。从相邻节段以倾斜角度推进电极至目标位置。

在计算机上开始操作时，根据TagRFP荧光的实时图像选择成像区域。确保所选区域包含多个突触小体，并排除靠近体节边界的突触小体。切换荧光滤光片装置至GFP荧光通道以进行成像。

接下来，调节光源强度，以在1赫兹时间间隔模式下获得明亮但未饱和的图像。在MicroManager窗口的曝光时间（毫秒）字段中输入100。配置图像采集软件和数字输入输出设备，以实现图像采集与电刺激的同步。

接下来，在 Arduino 脚本中确定刺激频率、动作电位数量以及图像采集开始与刺激施加之间的时间延迟。根据这些设置，计算采集所需的总图像数量，并将该值输入到 Micro-Manager 多维采集窗口的计数字段中。在时间间隔字段中设置 1 秒的间隔，以实现 1 赫兹的时间序列成像。

进行电刺激时，将刺激隔离器设置为输出持续1毫秒、70毫伏的恒定电压脉冲。执行数字化仪指令以开始图像采集。监测过程，确保无明显图像漂移，并可观察到氟信号及响应。

根据实验目的调整刺激强度，例如脉冲次数对应的频率，或调节温度。将延时图像保存为TIFF时间序列堆栈。选择信号显著增强的突触进行分析，尽管在20赫兹100个动作电位条件下，所有突触终扣均表现出可检测到的变化。在高频电刺激下观察到强烈的荧光反应，荧光变化表明刺激期间发生胞吐作用，随后信号衰减，反映了突触囊泡的内吞作用及再酸化过程。

荧光衰减时间常数随刺激、强度和温度的变化而变化，其中20赫兹25次动作电位出现在16.6秒，20赫兹100次动作电位出现在56.8秒，50赫兹500次动作电位出现在62.7秒。