用于定量代谢通量研究的洗涤人血小板制备

我研究了急性雌激素暴露对血小板中心碳代谢以及静息和凝血酶激活血小板的影响。我们正试图确定血小板的急性雌激素暴露是否促成了口服避孕药使用所带来的血栓风险增加。女性健康研究长期面临资金不足的问题。

该项目是美国国立卫生研究院（NIH）为填补女性健康知识空白而发起的更大规模倡议的一部分。尽管避孕药已问世50多年，但我们仍不清楚导致血栓风险升高的确切机制。这涉及生物学变异性。

传统的细胞培养技术不适用于血小板，这意味着血小板来源于不同基因型的供体。因此需要较大的样本量，凸显了建立可重复的血小板分离流程的重要性。现有的血小板洗涤方案主要面向血小板生物学领域的专家编写。

对于初涉血小板研究的研究人员而言，本方案突显了在血小板操作过程中存在的一系列独特挑战。首先，将水浴预热至 37 °C，并将含有葡萄糖的改良 Tyrode 缓冲液放入其中。将从所有真空采血管中采集的全血合并至一个 50 mL 聚丙烯锥形管中。

使用斜面切割的移液枪头吸取适量样本进行细胞计数。用细孔移液管小心吸取，以去除产生的气泡。然后将血液置于37°C水浴中静置25分钟。

为防止离心过程中发生激活，向全血中加入前列腺素 I2 和腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase），并轻轻倒置试管一次以混匀样本。随后在 37 摄氏度条件下，以 250×g 离心 15 分钟（不启用刹车）。收集富血小板血浆（PRP），即位于白膜层和红细胞层上方的顶部黄色液体层，沿管壁转移至新的倾斜放置的 50 毫升锥形管中。

将PRP在37摄氏度下静置10分钟。孵育后，加入500纳摩尔的前列腺素I2和每毫升0.02单位的腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase），混匀。以1,000G在37摄氏度下离心10分钟，离心过程中不启用加速，不启用刹车。

现在使用塑料宽口移液管吸走上清液的大部分体积，然后用带有未切割尖端的1 mL移液管吸去靠近沉淀附近的剩余液体。接着沿锥形管壁加入含前列环素I2和apyrase的Tyrode缓冲液至沉淀中。使用斜面切割尖端的1 mL移液管头，轻轻吹打数次使沉淀充分重悬。

重悬沉淀后，使用宽口移液管将其转移至新的锥形管中，留下任何红细胞或明显成团的细胞。然后用斜切移液管头取样用于流式细胞术检测。将剩余的血小板在37摄氏度孵育一小时，以使抑制剂失效。

孵育后，使用宽口移液管轻轻混匀样品，并将样品分装用于流式细胞术检测。从全血中平均血小板回收率约为52%，白细胞污染在洗涤过程后保持在0.1%以下。在整个洗涤过程中P-选择素暴露水平较低，但在凝血酶处理后显著增加。

结合的纤维蛋白原水平在第一次1,000G离心后最初显著升高，但在第二次离心后降至5%以下，凝血酶处理后再次显著上升。在检测活化标志物之前，已成功根据细胞大小、单细胞群体及CD42a阳性对血小板进行设门。与对照组相比，凝血酶处理导致P-选择素和纤维蛋白原表达显著增加。

首先，从人血样本中获取洗涤后的血小板。将微量离心机预冷至0°C后，按1:6的比例将血小板悬浮液收集于部分冻结的生理盐水中。在0°C条件下，以16,000×g离心10分钟。

将上清液吸出至另一个微量离心管中。接着，向淬灭后的沉淀中加入0.5毫升预冷的甲醇:水溶液（-20°C），并剧烈涡旋震荡1分钟。用液氮速冻样品，然后在0°C下解冻。

将悬浮液在4°C条件下以16,000G离心10分钟，收集上清液至新的微量离心管中。将上清液过夜干燥后，用150 µL液相色谱/质谱级水重新悬浮干燥提取物，并在4°C下混合15分钟。短暂涡旋后，将提取物转移至0.22 µm的微量离心管中，以去除细胞碎片。

将样品在 16,000G 和 4°C 条件下离心五分钟。离心后，向滤膜中加入 50 微升水，再次在 16,000G 和 4°C 条件下离心五分钟。最后，收集滤液用于分析。

所有供体样本中乳酸的生成均为阳性，同时葡萄糖和乙酸被持续消耗，且凝血酶增强了这些代谢通量。