Name: 用于活组织中发芽血管生成的 离体 机械表征的 2.5D 模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 了解发芽血管生成的离体机械表征方法，使用猪颈动脉2.5D模型结合牵引力显微镜技术。该方法揭示了硬度依赖性血管生成机制，为组织工程和癌症治疗研究提供新工具。

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我们感谢 LifeTec 的工作人员从当地屠宰场采集并运送猪颈动脉；感谢 Eindhoven 理工大学 ICMS 的 Leon Hermans、Pim van den Bersselaar 和 Adrià Villacrosa Ribas 在实验流程与力学表征分析方面富有成效的讨论。本研究得到了欧洲研究理事会（771168）、荷兰科学研究组织（024.003.013）、芬兰科学院（307133、316882、330411 和 337531）以及 Åbo Akademi 大学基金会卓越中心——细胞机械稳态（CellMech）项目的资助支持。

本方案使用猪颈动脉。猪颈动脉取自当地屠宰场获得的荷兰兰德瑞斯杂交猪，猪的年龄为5-7个月，活体重量为80-120 kg。本方案符合欧盟法规1069/2009关于在诊断和研究中使用屠宰场动物材料的规定，该规定由荷兰政府（荷兰农业、自然与食品质量部）监督，并已获得相关动物福利法定监管机构（食品与消费品安全局）的批准。由于组织来源于已屠宰动物的副产品，因此无需伦理审批。从动物死亡到组织运输的时间为10-25分钟，具体时间取决于屠宰场的流程。
注意：材料表汇总了本实验方案中所用材料、仪器和试剂的详细信息。二维和三维样品的实验方案详见补充文件1。
1. 二维聚丙烯酰胺（PAA）基底的制备
<ol>
	<li>在通风橱中，通过将合成用无水乙醇、乙酸和bind-silane按12:1:1的比例混合，分别取4286 µL、357 µL和357 µL，配制bind-silane溶液。将120 µL/孔的bind-silane溶液加入玻璃底12孔板中，室温孵育1小时。 
	注意：无水乙醇为高度易燃液体和蒸气（H225），可引起严重眼刺激（H319）。乙酸为易燃液体和蒸气（H226），可引起严重皮肤灼伤和眼损伤（H314）。请佩戴个人防护装备，并在通风橱中操作。</li>
	<li>在通风橱中，使用喷瓶以工业级无水乙醇对玻璃底12孔板清洗3次，弃去乙醇。</li>
	<li>使用氮气干燥玻璃底12孔板。若玻璃底部表面出现白色膜状物，表明清洗不充分，需重新清洗玻璃底12孔板。</li>
	<li>根据表1中的比例配制PAA凝胶混合液。
	<ol>
		<li>将PBS加入微量离心管中，并在凝胶混合液中重悬40%丙烯酰胺、2%双丙烯酰胺及荧光标记物。在凝胶制备前立即涡旋混匀溶液。</li>
		<li>迅速向溶液中加入10%过硫酸铵（APS）和TEMED，并在每次添加后涡旋混匀。用移液器吸取11.5 µL凝胶混合液滴加至各孔的玻璃底部，然后轻柔地将13 mm盖玻片覆盖于液滴上方。</li>
		<li>轻轻敲击并旋转培养板，使凝胶混合液在盖玻片下均匀铺展。若出现气泡，可轻轻抬起盖玻片将其去除。室温下静置1小时使凝胶聚合。使用管中剩余的凝胶混合液检测聚合情况。聚合完成的PAA凝胶在12孔板中会呈现内部光环。 
		注意：丙烯酰胺如吞咽或吸入有害（H302 + H332），可引起皮肤刺激（H315），可能引起过敏性皮肤反应（H317），可引起严重眼刺激（H319），可能引起遗传缺陷（H340），可能致癌（H350），怀疑对生育能力造成损害（H361f），长期或反复摄入可对器官造成损害（H372）。APS可能加剧燃烧（氧化剂，H272），吞咽有害（H302），引起皮肤刺激（H315），可能引起过敏性皮肤反应（H317），引起严重眼刺激（H319），吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难（H334），可能引起呼吸道刺激（H335）。TEMED为高度易燃液体和蒸气（H225），吞咽有害（H302），引起严重皮肤灼伤和眼损伤（H314），吸入有毒（H331）。请佩戴个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚合完成后，在孔中加入PBS。使用镊子和/或弯针轻柔抬起并移除盖玻片。用PBS清洗凝胶一次。</li>
	<li>为促进PAA凝胶的胶原包被，需使用交联剂Sulfo-SANPAH对凝胶进行功能化处理。将75 µL浓度为1 mg/mL的Sulfo-SANPAH溶于超纯水中，加入PAA凝胶中，并在365 nm紫外光下孵育5分钟。 
	注意：Sulfo-SANPAH需避光保存，并在紫外光孵育前立即加入超纯水。可见颜色由浅红色（紫外光孵育前）变为深红色（紫外光孵育后）。 
	注意：Sulfo-SANPAH可引起严重眼刺激（H319）。</li>
	<li>在生物安全柜中，用无菌PBS快速清洗凝胶上的Sulfo-SANPAH。随后，用无菌PBS将功能化后的PAA凝胶清洗2次，每次10分钟。 
	注意：从本步骤开始，所有操作均需在无菌条件下进行。</li>
	<li>在生物安全柜中，将IV型胶原溶于PBS中，配制成0.1 mg/mL的溶液，并置于冰上。向功能化后的PAA凝胶表面滴加50 µL 0.1 mg/mL IV型胶原溶液，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用无菌PBS清洗凝胶2次。吸除PBS后，将凝胶干燥5分钟。</li>
	<li>向凝胶表面滴加50 µL内皮细胞生长（ECG）培养基，于37 °C、5% CO2条件下孵育至少1小时。 
	注意：将凝胶在ECG培养基中孵育可改善细胞和组织在凝胶上的贴附。</li>
</ol>
2. 用于转运的改良克雷布斯溶液的制备
注意：请新鲜配制改良型克雷布斯溶液。在本实验方案中，改良型克雷布斯溶液需在组织取材前1天配制。
<ol>
	<li>通过高压灭菌对转运瓶进行灭菌。在玻璃瓶中加入所需转运液体总体积（350 mL）的90%（315 mL）超纯水。确保水温为15–20 °C。</li>
	<li>使用磁力搅拌器轻轻搅拌水的同时，加入9.6 g/L（3.36 g）Krebs-Henseleit缓冲液，持续搅拌至完全溶解。用巴斯德吸管吸取少量溶液冲洗称量舟，以确保所有粉末残留物均进入溶液。切勿加热溶液。</li>
	<li>在搅拌过程中，向溶液中加入0.373 g/L（130.55 mg）氯化钙（CaCl2），搅拌至完全溶解。用少量溶液冲洗称量舟。 
	警告：H319可引起严重眼刺激。</li>
	<li>在搅拌过程中，向溶液中加入2.1 g/L（0.63 g）碳酸氢钠（NaHCO3），搅拌至完全溶解。用少量溶液冲洗称量舟。</li>
	<li>在搅拌过程中，向溶液中加入1 × 10-1 mM（13.15 mg）罂粟碱，搅拌至完全溶解。用少量溶液冲洗称量舟。 
	注：罂粟碱是一种平滑肌松弛剂，用于防止在组织获取过程中因切割和操作血管引起的过度血管收缩。 
	警告：H301吞咽后有毒。</li>
	<li>在通风橱内，向溶液中加入0.05 mM（1.2 µL）2-巯基乙醇，并持续搅拌。 
	注：2-巯基乙醇用于维持较低水平的氧自由基。 
	警告：2-巯基乙醇吞咽或吸入有毒（H301 + H331），皮肤接触可致死亡（H310），引起皮肤刺激（H315），可能引起过敏性皮肤反应（H317），造成严重眼损伤（H318），怀疑对未出生胎儿造成损害（H361d），吞咽后长期或反复暴露可能造成器官损伤（H373），对水生生物有极高毒性并具有长期持续影响（H410）。操作时须佩戴个人防护装备，并在通风橱内进行。</li>
	<li>在搅拌过程中，通过添加1 N（1 M）HCl或1 N（1 M）NaOH将pH调节至7.2。最终目标pH为7.4，但在过滤过程中pH可能上升0.1–0.3个单位。 
	警告：HCl内含加压气体，受热可能爆炸（H280），可引起严重皮肤灼伤和眼损伤（H314），吸入有毒（H331）。操作时须佩戴个人防护装备。</li>
	<li>继续在生物安全柜中操作。加入10%超纯水，使溶液达到最终体积。</li>
	<li>立即使用孔径为0.22 µm的滤膜过滤法对溶液进行灭菌。将无菌溶液直接分装至无菌瓶中。向溶液中加入7 mL 2%青霉素/链霉素（P/S）。 
	注：在运输过程中，向培养基中添加2% P/S以清除所有细菌。在组织培养过程中，向培养基中添加1% P/S。</li>
	<li>将改良的Krebs溶液储存于4 °C，直至进行组织获取。</li>
</ol>
3. 组织采集
<ol>
	<li>根据屠宰场的不同，通过电击或 CO2 对猪进行击晕。随后将猪倒挂于后肢，放血并确认死亡。</li>
	<li>进入洁净屠宰流程前，对猪进行烫洗以去除体毛，灼烧以清除残留毛发，并对胴体表面进行消毒。</li>
	<li>沿腹部正中线做切口，小心取出内脏，完成猪的去脏处理。根据屠宰场操作方式的不同，颈总动脉可能仍附着于胴体上，或已随胸腔器官一并被移除。</li>
	<li>使用锋利的刀具，从胴体或喉部区域取下带有部分周围组织的颈总动脉，操作过程中避免触碰血管或施加机械应力。</li>
	<li>打开运输瓶短暂时间，将含有颈总动脉的组织放入盛有无菌改良克雷布斯液的运输瓶中。轻轻倒置瓶子一次，确保整个组织完全浸没于克雷布斯液中。将组织置于冰上运送到实验室，运输时间约为 30–45 分钟。</li>
</ol>
4. 组织解剖
<ol>
	<li>通过高压灭菌对解剖器械进行灭菌，包括手术镊（用于粗略操作）、环氧树脂涂层圆头镊（用于精细操作）、手术刀、持针器和盖玻片。</li>
	<li>在组织取材/转运前准备生物安全柜。用手术铺巾覆盖解剖区域。将灭菌后的解剖器械（置于无菌50 mL离心管中）、手术刀片和无菌盖玻片放置到位。用无菌PBS填充两个大培养皿，以制备解剖托盘。将组织培养物置于一个小培养皿中，加入ECG培养基，并在37 °C条件下孵育。</li>
	<li>组织转运后，在生物安全柜内，使用手术镊将颈动脉从装有改良Krebs溶液的转运瓶中转移至盛有无菌PBS的大培养皿中。</li>
	<li>使用手术镊和手术刀去除颈动脉周围多余的组织，以获得清晰的颈动脉视野。</li>
	<li>使用手术刀切除颈动脉两端各2-3 cm的血管段，以去除靠近动脉分叉的区域。使用精细圆头镊去除颈动脉周围的动脉筋膜。 
	注意：更换手术刀刀片有助于更精确地切割筋膜。</li>
	<li>将颈动脉转移至另一个盛有无菌PBS的大培养皿中。尽可能彻底地去除残留的薄层动脉筋膜。 
	注意：颈动脉在PBS中放置时间越长，筋膜越容易松动脱落。彻底去除筋膜非常重要，因为残留筋膜会阻碍显微镜观察。</li>
	<li>将清洁后的颈动脉切成宽度约为2 mm的环状血管片。将颈动脉环转移至预先温育的小培养皿中，其中含有预热的ECG培养基，并保持在37 °C条件下。</li>
</ol>
5. 组织接种
注意：在PAA水凝胶上接种动脉组织片后，通过在其上方添加无盖玻片、无菌未处理盖玻片或无菌Pluronic处理的盖玻片（1% w/v Pluronic溶于PBS，盖玻片过夜孵育后用无菌超纯水洗涤）进行组织附着测试，所用盖玻片尺寸各不相同。
<ol>
	<li>从凝胶中移除ECG培养基液滴。将颈动脉环转移至盛有无菌PBS的干净培养皿中。</li>
	<li>使用圆头镊子和手术刀将动脉环切成两半。将其中一半进一步解剖为宽度约2 mm的片状结构，制备成尺寸为2 × 2 mm的动脉组织片。注意动脉片内皮面的方向，其曲率及残留的部分筋膜有助于判断该方向。 
	注意：颈动脉环的大小可能存在差异。较大的动脉环可制备出约6–8个组织片，较小的则可获得3–4个。较大的动脉环因组织片曲率较小，更利于贴附。</li>
	<li>使用圆头镊子夹住动脉片背面（即血管壁外侧），将组织片放置于PAA凝胶边缘，使内皮层朝下接触PAA基质，以避免放置过程中损伤PAA基质。</li>
	<li>使用镊子或持针器极其轻柔地将动脉片移至PAA水凝胶中央，避免接触凝胶表面。可先将动脉片置于凝胶边缘（以防组织粘附于镊子或持针器上）。 
	注意：血管壁外侧残留的少量动脉筋膜可作为操作时的便利抓手，而血管壁的内皮内衬表面则非常光滑。</li>
	<li>在置于PAA基质上的动脉片上方加入50 µL ECG培养基。尽量使ECG培养基液滴保持在凝胶表面。</li>
	<li>使用圆头镊子将一片干燥的13 mm盖玻片置于PAA基质中动脉片上方的培养基内。利用玻璃底培养板内壁作为支点，轻轻放下盖玻片，使其边缘接触培养基液滴，从而使培养基在盖玻片下方均匀铺展。 
	注意：13 mm盖玻片的优势在于其尺寸与玻璃底培养板内孔壁大小匹配良好。若放下盖玻片速度过快，组织可能被推向盖玻片边缘。</li>
	<li>将组织在37 °C、5% CO2条件下孵育5小时，使其充分贴附，然后向每孔加入1 mL ECG培养基。继续将带有动脉片的PAA基质置于37 °C、5% CO2环境中培养24小时。</li>
</ol>
2.5D 模型的构建
<ol>
	<li>将圆头镊子进行高压灭菌以用于盖玻片的移除。用超纯水配制1 M NaOH溶液，通过0.22 µm孔径滤器过滤除菌，并于4 °C保存。 
	注意：1 M NaOH溶液可在后续实验中重复使用。</li>
	<li>使用带有弯曲尖端的无菌细针，非常轻柔地从动脉片上抬起13 mm盖玻片并将其移除。利用玻璃底培养小室的内圈作为支撑，辅助抬起和移除盖玻片。任何侧向移动均会增加动脉片从PAA基质上脱落的风险。</li>
	<li>在无菌微量离心管中，按照表2在冰上配制I型胶原混合液。加入I型胶原和NaOH后，充分重悬，并轻轻倒置管子一次，以确保混合物均匀混合。 
	注意：当将I型胶原加入混合液时，淡粉色的溶液会变为无色；加入NaOH后，无色溶液又会变为淡粉色。</li>
	<li>使用真空抽吸系统从孔中移除培养基。尽可能清除组织周围的培养基，但避免接触组织本身。 
	注意：若动脉片周围残留过多培养基，将阻碍I型胶原凝胶对其包绕。</li>
	<li>在每片动脉片上方加入10 µL I型胶原凝胶混合液，然后将样品置于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时，使胶原凝胶充分聚合。</li>
	<li>非常轻柔地向每个孔中加入1 mL预热的ECG培养基，随后将样品置于37 °C、5% CO2环境中培养。</li>
</ol>
7. 活细胞成像
注意：活细胞成像使用配备温度、CO2和湿度控制的Leica DMi8或Nikon Ti2 Eclipse落射荧光显微镜，并通过Leica或NIS软件进行控制。采用Leica的自适应聚焦控制（Adaptive focus control）和Nikon的完美聚焦系统（perfect focus system）以在时间序列成像中维持焦平面稳定。
<ol>
	<li>在2.5D系统中培养24小时后，检查出芽性血管生成情况。部分动脉片在培养24小时后已开始形成细胞出芽，而其他动脉片则需要更长时间才能启动内皮细胞出芽。</li>
	<li>若已启动出芽性血管生成，则更换ECG培养基，并将12孔板放入显微镜37 °C预热孵育箱内的载物台支架中。</li>
	<li>选择所需物镜。本研究中使用了不同物镜，可使用10倍物镜对细胞出芽的整体形成情况进行概览观察，使用20倍物镜进行牵引力显微镜（TFM）分析。</li>
	<li>定义感兴趣通道。为进行TFM分析，需使用相差通道观察细胞出芽，并在660 nm波长下通过荧光通道观察PAA基质中的荧光标记物（深红色）。</li>
	<li>选择一个或多个感兴趣区域，并&#160;确定焦平面。开启聚焦系统（Leica DMi8上的自适应聚焦控制或Nikon Ti2 Eclipse上的完美聚焦系统），以确保延时成像过程中焦平面的稳定。</li>
	<li>通过设定时间间隔和延时成像时长来定义所需的延时成像参数。本研究中根据不同目的采用了不同的时间间隔（5–20分钟）和延时成像时长（4–24小时）。</li>
	<li>为进行TFM分析，在完成延时成像后，加入数滴含5% SDS的超纯水以去除生长的细胞，静置数分钟。针对每个选定位置，采集PAA基质中荧光标记物的z轴层扫图像（设定z轴高度为2 µm，步长为0.2 µm），以获得荧光标记物的松弛状态作为参考图像。 
	注意：由于细胞可能在z轴方向拉动或推动荧光标记物，因此需进行z轴层扫成像。</li>
</ol>
8. 牵引力显微镜分析
<ol>
	<li>将延时图像相对于最佳参考图像进行对齐和裁剪，以实现精确分析。</li>
	<li>为测量PAA水凝胶中荧光标记物的位移，使用自定义的MatLab代码，在任意延时图像与参考图像之间执行粒子图像测速（Particle Image Velocimetry, PIV）。在PIV分析中，将图像划分为32×32像素的 interrogation windows（ interrogation 窗口），重叠度为0.5。</li>
	<li>基于无限厚凝胶但具有有限厚度的傅里叶变换牵引力显微技术，利用Boussinesq方程27，根据荧光标记物的位移计算牵引力。</li>
</ol>

Versatile 2.5D Model for Analyzing Cellular Sprouting in Porcine Arteries

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<li>Kretschmer, M., Rüdiger, D., Zahler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Mechanical aspects of angiogenesis.</a> Cancers. 13 (19), 4987(2021).</li>
<li>Bordeleau, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffening+promotes+a+tumor+vasculature+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffening promotes a tumor vasculature phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (3), 492-497 (2017).</li>
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作者声明无利益冲突。

出芽性血管生成——&#160;即新血管的形成——&#160;是一个受分子和力学机制共同调控的复杂过程。尽管在过去几十年中已开发出多种3D模型用于研究出芽性血管生成的分子驱动因素（例如VEGF和Notch信号通路），但由于模型的局限性，人们对细胞力学方面的了解仍然有限。牵引力显微镜技术（Traction Force Microscopy, TFM）是一种广泛使用的技术，可用于在时空维度上定量分析细胞受力，其原理是将二维基底的形变转化为细胞牵引力。因此，在本实验方案中，我们描述了一种2.5D的离体（ex vivo）模型，即在局部为细胞提供三维环境的同时，保留二维模型的简便性，从而实现在出芽性血管生成过程中对牵引力的定量测量（图1）。具体操作中，我们将猪动脉组织片（内皮面朝下；图2）接种于含有荧光标记物的IV型胶原包被的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶表面。利用13 mm的玻璃盖玻片固定动脉组织片后（图3），再覆盖一层I型胶原水凝胶薄层，以支持细胞出芽的形成（图4）。利用该模型，我们发现，在细胞出芽过程中22,23,24,25，领头细胞施加拉力（与文献报道一致19,20,21,22），而跟随细胞则施加推力（图6）。本方案所获得的牵引力场具有足够分辨率，可对细胞运动学和动力学进行时空上的定量分析，这类分析常见于在可变形基底上应用牵引力显微镜的研究工作37,38,39。
此外，我们通过改变微环境的力学信号，展示了这种出芽性血管生成2.5D ex vivo 模型的多功能性（图5）。出芽性血管生成通常发生在生理刚度为1 kPa的环境中35——这一条件可通过三维I型胶原蛋白水凝胶模拟；而肿瘤血管生成则发生在刚度更高的微环境中40，超出了传统三维I型胶原蛋白水凝胶所能达到的刚度范围。聚丙烯酰胺（PAA）基底的刚度可通过调节交联剂比例轻松调控，从而获得更高的基底刚度。利用该模型，我们发现出芽性血管生成的起始依赖于基底刚度。这些基底不仅具有可调的刚度，还可系统性地调控其他多种力学信号，例如基质成分和密度。此外，该模型允许我们在通过培养基条件调控分子调节因子（例如，抑制Notch信号通路对细胞力学特性的影响）的同时，研究细胞力学行为，从而深入理解出芽性血管生成的力学生物学机制。这表明该2.5D ex vivo 出芽性血管生成模型在多种不同微环境条件下均具有重要应用价值。
我们所展示的模型采用了传统的二维牵引力显微镜技术（2D TFM），与三维（黏弹性）TFM相比，该方法具有更简单的分析流程、更高的空间分辨率以及更易于实施的优点，因而更具可及性且成本更低26,41。然而，三维（黏弹性）TFM通过在全部三个维度上捕捉牵引力，并考虑细胞外基质复杂的力学特性，能够提供更接近生理条件的环境，从而在更真实的背景下深入揭示细胞行为42,43,44,45。维度的影响也指出了本2.5D模型的一个局限性。我们使用2D TFM的前提是假设细胞在二维基底上迁移。尽管在本2.5D模型中确实如此，但细胞处于局部三维环境中，因此会黏附于I型胶原凝胶层并在该凝胶层中施加作用力。本分析所采用的假设是，由于基质刚度存在数量级上的差异，I型胶原凝胶层与PAA界面之间在力学上并未耦合（即两种水凝胶之间无传力作用），从而最小化了细胞在I型胶原层上产生之力的影响。这使得利用2.5D ex vivo 模型进行的力学表征仅能简化反映细胞所产生的力。此外，本实验方案要求较高的操作精度，且步骤繁多，在多个环节中可能存在样本损失的风险，例如：（i）由于动脉片周围组织过多导致细胞难以观察（图2）；（ii）三个样本中约有一个无法成功黏附至PAA基底（图3）；（iii）并非所有样本均能启动细胞出芽的形成（图5）；（iv）细胞出芽未在PAA基底处形成；以及（v）当在低刚度PAA水凝胶上使用较厚的动脉片时，荧光标记物出现失焦现象。因此，我们将该方法优化为适用于12孔板，以确保拥有足够多的兴趣区域，用于对出芽型血管生成进行力学分析。
总之，本研究提出了一种简化方法，用于表征活体猪动脉片在出芽性血管生成过程中细胞牵引力，该方法基于2.5D模型图7)&#160;有助于在天然组织环境中更准确、实时地揭示血管生成过程中的力学相互作用，相较于完全三维系统，可简化动态细胞过程的研究并提高实验可重复性。该方法能够在保持二维方法分析简便性的同时，提供更接近生理状态的环境，从而深化对细胞响应力学信号机制的理解。这一认知有望推动组织工程领域的发展，不仅可用于人工血管的构建，还有助于发现治疗性药物，以抑制肿瘤血管生成，进而限制肿瘤生长并减少转移。

血管生成是指从已有的血管形成新血管的过程。该过程在胚胎发育、伤口愈合以及癌症进展中至关重要，这些生理和病理过程均伴随着微环境中的生物力学变化1,2,3,4。在血管生成起始阶段，缺氧或受损组织会释放血管内皮生长因子（VEGF），从而激活邻近血管的内皮细胞，促使其形成内皮细胞芽；在此过程中，通过分子层面的Notch信号通路，细胞分化为两种截然不同的表型——领头细胞和跟随细胞5。内皮细胞芽形成后，即进入所谓的出芽式血管生成阶段，领头细胞会降解周围细胞外基质，并在不中断与后方跟随细胞之间细胞连接的前提下，协同迁移至VEGF刺激源方向6,7。
在过去几十年中，已有越来越多的出芽性血管生成实验被报道，这些实验通过各种方法研究细胞集体迁移，每种方法都有其独特的优势和局限性。这些实验可评估细胞群体（如内皮细胞）在三维基质中的协调运动，从而在受控环境中研究出芽、侵袭和集体迁移等细胞行为8,9,10。体内出芽性血管生成实验可在活体生物中进行全面评估，能够捕捉复杂的相互作用，但耗时较长、成本较高、易出现较大变异性且难以量化11,12。体外出芽性血管生成实验则允许对实验条件进行精确控制，具有高度可重复性和精确的定量能力，但可能无法完全模拟体内的复杂性11,12,13。相比之下，离体出芽性血管生成实验（其中主动脉环实验是最广泛应用的模型）使用生物体外的组织，在避免体内复杂性的同时保留了生理相关性14,15,16。尽管这类模型在技术上具有挑战性，且有时存在组织存活率低的问题，但离体模型在复杂性与实验可控性之间提供了良好的平衡，因此成为研究出芽性血管生成的一种有前景的方法。虽然这些模型已被广泛用于研究出芽性血管生成的分子驱动机制，但机械信号的影响以及细胞的力学行为仍知之甚少。
出芽性血管生成过程中的多细胞迁移高度依赖于细胞力学，因为基于肌动蛋白-肌球蛋白的收缩力可调控内皮细胞向周围细胞外基质的侵袭17,18,19,20特别是非肌球蛋白II分子马达，它是细胞内以肌动蛋白为基础的主要收缩装置21在出芽性血管生成过程中，已被观察到可调控细胞收缩力22,23领导细胞可能是芽状结构中主要的力生成单元，因为其周围三维细胞外基质的形变显著高于其他区域，尤其是在富含肌动蛋白的细胞突起附近。23,24，与其追随者相比22,23,25尽管越来越多的证据表明细胞收缩力在三维环境下的出芽性血管生成中具有重要作用，但目前仍缺乏一种能够对出芽性血管生成过程中细胞力学进行时空力学表征的方法。
本研究的总体目标是建立一种方法，用于在出芽过程中对细胞迁移的力学特性进行表征。通过在具有生物学相关性的背景下实现对力学作用力的时空表征，我们旨在揭示细胞力学如何影响血管生成性出芽形成的全新机制。为此，我们构建了一个2.5D模型系统：首先制备二维聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶，在其上接种颈动脉组织片，并覆盖一层薄的I型胶原凝胶，从而为细胞建立局部三维环境。多细胞出芽结构从动脉组织片迁移至PAA-胶原凝胶界面。与现有技术相比，该方法的优势在于二维PAA水凝胶可支持牵引力显微镜（TFM）分析——这是一种广为人知且用途广泛的技術，其原理是细胞黏附于弹性二维基底，并在细胞牵引力作用下使基底发生形变26。这些形变可被捕捉，并结合基底的力学特性计算出细胞牵引力26。通过将TFM技术改进并应用于离体活体组织，我们旨在弥合体外（in vitro）实验的可控性与体内（in vivo）生理相关性之间的差距，从而更全面地理解血管生成过程中力学作用力的作用机制。

<table><tbody><tr><td>2% 双丙烯酰胺</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1610143</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td></td><td>Merck Life Science</td><td>60-24-2</td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Bind-Silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-100ML</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td></tr><tr><td>绝对乙醇（用于分析）</td><td></td><td>VWR International</td><td>1.00983.1000</td></tr><tr><td>绝对乙醇（工业级）</td><td></td><td>VWR International</td><td>83813.41</td></tr><tr><td>冰醋酸，100%</td><td></td><td>Merck</td><td>1000562500</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>APS</td><td>Bio-Rad</td><td>7727-54-0</td></tr><tr><td>一抗 - 钙调蛋白</td><td></td><td>abcam</td><td>ab46794</td></tr><tr><td>一抗 - CD31</td><td></td><td>Serotec</td><td>MCA1746</td></tr><tr><td>一抗 - &amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白</td><td>&amp;alpha;SMA</td><td>Dako</td><td>M0851</td></tr><tr><td>二抗 - 羊抗小鼠 IgG1 Alexa 488</td><td></td><td>Molecular Probes</td><td>A21121</td></tr><tr><td>二抗 - 羊抗小鼠 IgG2a Alexa 555</td><td></td><td>Molecular Probes</td><td>A21137</td></tr><tr><td>二抗 - 羊抗兔 IgG Alexa 555</td><td></td><td>Molecular Probes</td><td>A21428</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td>Astell</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>CaCl2</td><td>Calbiochem</td><td>208291-250GM</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾来源</td><td></td><td>Corning</td><td>354236</td></tr><tr><td>Ⅳ型胶原蛋白，人胎盘来源</td><td></td><td>Merck Life Science</td><td>C5533-5MG</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>ECG 培养基</td><td>Promocell</td><td>C-22111</td></tr><tr><td>环氧涂层圆头镊子</td><td>精细镊子</td><td>Rubis Pinzette</td><td>E78144-2A</td></tr><tr><td>荧光标记物，深红色</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>F8807</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，&amp;Oslash;13 mm，#1</td><td></td><td>Epredia</td><td>CB00130RA120MNZ0</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，&amp;Oslash;13 mm，#1.5</td><td></td><td>Epredia</td><td>CB00120RAC20MNZ0</td></tr><tr><td>盐酸，25%</td><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1.100316.1000</td></tr><tr><td>克雷布斯-亨塞尔特缓冲液</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753</td></tr><tr><td>显微镜，Leica Application Suite X 软件，版本 3.5.7.23225</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜，Leica DMi8 正置荧光显微镜</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td></tr><tr><td>显微镜，Nikon Ti2 Eclipse</td><td></td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>显微镜，NIS-Elements AR 软件</td><td></td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺</td><td>TEMED</td><td>Merck Life Science</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Nalgene 瓶</td><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>2187-0016</td></tr><tr><td>针头，21Gx1&quot;</td><td></td><td>Henke Sass Wolf</td><td>HK4710008025</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td></td><td>Gibco</td><td>10098792</td></tr><tr><td>罂粟碱盐酸盐</td><td></td><td>Sigma</td><td>61-25-6</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>P/S</td><td>Gibco</td><td>15140163</td></tr><tr><td>培养皿，大型（145x20 mm）</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td></tr><tr><td>培养皿，小型（60x15 mm）</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>628160</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td></td><td>Merck Life Science</td><td>P2443-250G</td></tr><tr><td>穿刺针，尖头闭合式</td><td></td><td>未知</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，4 号</td><td></td><td>Swann-Morton</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>NaHCO3</td><td>VWR International</td><td>144-55-8</td></tr><tr><td>磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯</td><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td></tr><tr><td>手术刀片，20 号</td><td></td><td>Swann-Morton</td><td></td></tr><tr><td>手术洞巾</td><td></td><td>Foliodrape</td><td>2775001</td></tr><tr><td>手术镊</td><td></td><td>Lettix</td><td>400024</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td></td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td></td><td>Analytik Jena</td><td>95-0042-13&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养板，96 孔，F 型底</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td></tr><tr><td>培养板，玻璃底 12 孔</td><td></td><td>MatTek</td><td>P12G-0-14-F</td></tr></tbody></table>

2.5d 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

2.5D Model for Ex Vivo Mechanical Characterization of Sprouting Angiogenesis in Living Tissue

出芽性血管生成是指从已有的血管系统中形成新血管的过程，在组织生长与修复等生理过程以及癌症和转移等病理过程中具有重要意义。出芽性血管生成是一个多步骤过程，受分子和力学因素共同驱动，包括血管内皮生长因子诱导细胞出芽、通过Notch信号通路选择领头细胞与跟随细胞、内皮细胞的定向迁移，以及血管融合与稳定。多年来已开发出多种出芽性血管生成模型，以更深入理解细胞出芽的潜在机制。尽管在解析出芽性血管生成的分子驱动机制方面已取得进展，但由于现有模型的局限性，机械信号及其在出芽性血管生成中的驱动作用仍研究不足。在本研究中，我们设计了一种2.5D离体模型，结合牵引力显微镜技术，可对来自猪颈动脉的细胞出芽过程进行力学表征。该模型识别出芽结构内部存在不同的力分布模式：领头细胞对基质施加拉力，而跟随细胞则施加推力。该模型具有良好的可调性，能够调控化学和机械信号（如基质刚度），从而增强其在模拟多种微环境中的适用性。本文证明，出芽性血管生成的启动依赖于基质刚度。所提出的这一用于量化出芽性血管生成中细胞牵引力的2.5D模型，提供了一种简化但具有生理相关性的方法，有助于加深对细胞响应机械信号机制的理解，有望推动组织工程及抗肿瘤血管生成治疗策略的发展。

通过所述方案，我们能够诱导 离体 在覆盖有一层I型胶原凝胶的二维PAA水凝胶上，源自猪颈动脉的出芽性血管生成，从而形成2.5D结构 离体 出芽性血管生成模型。该模型使我们能够进行常规的牵引力显微镜检测，并在空间和时间上测量出芽性血管生成过程中细胞在PAA凝胶界面产生的牵引力。
为建立2.5D模型，我们首先制备了嵌有荧光标记物的二维聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶，并于前一天晚上用IV型胶原蛋白包被（d-1至d0）。在第0天（d0），将颈动脉片置于IV型胶原包被的水凝胶上，使其贴附过夜（d0至d1）。随后，在动脉片上覆盖一层薄的I型胶原凝胶，并于第1天（d1）开始成像，以监测细胞出芽并追踪荧光标记物用于力学分析（d1至d2）。为验证2.5D模型中的出芽性血管生成，我们平行进行了传统的ex vivo三维I型胶原凝胶出芽性血管生成实验。具体操作为：先制备一层薄的I型胶原凝胶，接种颈动脉片，再覆盖一层额外的胶原凝胶（d0），随后随时间监测血管生成出芽情况。此外，我们还尝试在二维条件下诱导出芽性血管生成，以进一步降低模型复杂性。该实验流程与2.5D模型类似，关键区别在于不添加上层I型胶原凝胶层。三种模型及其实验流程的概览见图1。猪颈动脉取自当地屠宰场，并以无菌新鲜Krebs溶液运输。在生物安全柜中，去除颈动脉周围的多余组织，以确保在活细胞延时成像过程中不会影响出芽性血管生成的观察（图2A-E）。待动脉组织清理干净后，将其切成2 mm宽的动脉环，再将动脉环裁剪为2 × 2 mm大小的动脉片（图2F）。
为确保在2.5D和2D模型中PAA水凝胶界面上发生出芽性血管生成，我们将动脉片以内皮细胞侧朝向经IV型胶原包被的PAA水凝胶进行接种，并使其贴附。为优化动脉片在PAA水凝胶上的贴附效果，我们测试了在动脉片上方添加经抗污染涂层处理的12 mm玻璃盖玻片对贴附的影响。24小时后，移除盖玻片，并通过测量贴附至PAA水凝胶的动脉片百分比来评估贴附效率。我们观察到，无论是否具有抗污染涂层，添加玻璃盖玻片均能提高动脉片在PAA水凝胶表面的贴附效率，优于未使用盖玻片的情况（图3A-D）。接下来，我们在培养板内孔直径为14 mm的条件下，测试了玻璃盖玻片直径（12或13 mm）对动脉片贴附效率的影响。我们发现，与12 mm盖玻片相比，使用13 mm盖玻片可进一步提高动脉片在PAA水凝胶上的贴附效率（图3E-G），因为移除盖玻片时产生的剪切力更小。因此，在后续的2.5D和2D模型中，均采用未经处理的13 mm玻璃盖玻片促进动脉片在PAA水凝胶上的贴附。
将动脉片层固定于PAA水凝胶后，我们在动脉片层上方添加一层薄的I型胶原凝胶，以构建2.5D环境。将样本培养5天后，观察其出芽性血管生成情况。在3D模型中观察到细胞出芽的形成（图4A），这与文献中已报道的ex vivo出芽性血管生成现象一致28,29,30。在2.5D模型中，我们观察到与3D模型相似的细胞出芽结构（图4B）。细胞出芽在多个高度形成（视频1），包括在PAA界面处。此外，出芽性血管生成的特征是领头细胞和跟随细胞的高增殖活性，我们在2.5D模型中的出芽过程中也观察到了这一现象（视频2）。当在2D条件下培养动脉片层时，来源于不同区域的细胞（补充图1）以单层形式从组织中迁移而出，缺乏细胞出芽的有序结构（图4C）。由于在2D模型中未观察到出芽性血管生成，因此该模型未被纳入后续分析。综上所述，动脉片层需要局部3D环境才能诱导出芽性血管生成，表明该2.5D ex vivo出芽性血管生成模型具有应用潜力。
此外，2.5D 模型系统是一种多功能系统，可使研究人员考察细胞微环境中机械信号（如基质刚度）的影响。其中，I 型胶原三维水凝胶——一种常用于该系统的水凝胶——的基质刚度 离体 出芽式血管生成——依赖于细胞外基质（ECM）蛋白的浓度，蛋白浓度的增加与基质刚度的增加呈正相关。32I 型胶原蛋白的典型浓度范围为 1–4 mg/mL，用于制备可诱导出芽型血管生成的三维水凝胶，对应的基质刚度为 1 Pa 至 1 kPa32,33,34较低浓度可能过于柔软而无法提供结构支撑，而较高浓度则可能抑制细胞运动。内皮组织的生理刚度为1 kPa。35，这可以通过I型胶原蛋白三维水凝胶来模拟。然而，肿瘤的形成与进展伴随着组织硬化4因此强调了建立一种能够实现更高基质刚度的模型以研究肿瘤血管生成的必要性。PAA水凝胶的基底刚度——即动脉片内皮细胞所感知的刚度——可在1至数十kPa范围内轻松调节。本研究通过统计在添加I型胶原层后次日启动细胞出芽的样本百分比，考察了PAA基底刚度对出芽性血管生成起始的影响。我们观察到，与病理性刚性（12 kPa）PAA水凝胶相比，在生理柔软（1 kPa）PAA水凝胶上培养的动脉片中出现早期细胞出芽迹象的比例更高图5），表明该模型在研究基质刚度对出芽型血管生成影响方面的潜力。除了可调节的基质刚度外，这些基质还允许系统性调控其他力学信号（如基质成分和密度）以及化学信号（如通过调节培养基成分来抑制分子调控因子），展示了该2.5D模型的多功能性 离体 出芽型血管生成模型
为了量化出芽性血管生成过程中的细胞力学特性，我们在二维聚丙烯酰胺（PAA）界面上形成的细胞出芽结构上进行了传统的牵引力显微镜（TFM）检测。在添加I型胶原层一天后，我们对细胞（图6A）以及嵌入PAA水凝胶中的荧光标记物进行了活细胞成像。利用粒子图像测速法（PIV）测量了荧光标记物的位移（图6B），并结合PAA水凝胶的力学性质计算出细胞牵引力（图6C）。通过这种2.5D的体外（ex vivo）模型，我们观察到细胞出芽前端领头细胞突起处最初产生拉力，随后在出芽结构沿线出现推力——该推力不仅出现在领头细胞后部，也存在于跟随细胞中（图6C）。
<img alt="二维、2.5维、三维血管生成模型；基质制备、动脉接种、分析示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1： 实验模型与操作流程。（左）所测试的实验模型。2.5D模型表示将动脉片置于涂有IV型胶原的平面聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶上，并覆盖一层薄的I型胶原水凝胶。3D模型表示将动脉片夹在两层I型胶原凝胶之间，该体系已知可诱导出芽型血管生成36。2D模型表示将动脉片直接置于涂有IV型胶原的平面PAA水凝胶上。（右）对应模型的实验操作流程。对于2D和2.5D模型，PAA水凝胶在接种前一天（d-1）制备，并在夜间完成IV型胶原包被。从猪体内取出颈动脉，解剖成动脉片，在第0天（d0）接种于水凝胶表面，并在夜间使其贴附（d1）。对于2.5D样品，在动脉片上方覆盖一层薄的I型胶原凝胶。在第2天（d2）出芽开始后进行力学分析。对于2D样品，在第1天（d1）更换培养基。对于3D模型，在第0天（d0）接种前立即制备一层I型胶原凝胶。将动脉片接种于I型胶原层上，并覆盖第二层I型胶原。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="颈动脉制备；清理组织、动脉环和组织片；解剖过程；实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：颈动脉解剖步骤（d0）。 (A) 从当地屠宰场获取猪的颈动脉，长度约为10 cm。(B) 去除多余组织以及约2 cm的边缘部分（以避免过于靠近分支点，(B')。(C-E) 剥离颈动脉外层组织（C），用PBS浸泡（D），并进一步清除所有残留组织，以确保成像过程中结构清晰可见（E）。(F) 将清理干净的颈动脉切成宽度约为2 mm的动脉环，每个动脉环再被分割为4片大小约为2 × 2 mm的动脉组织片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有盖玻片的聚丙烯酰胺凝胶装置示意图；图表显示附着效率百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用13 mm玻璃盖玻片（d1）可提高动脉片在基质上的附着效率。（A-D）玻璃盖玻片对动脉片在聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶上附着的影响。比较了无玻璃盖玻片（A）、未处理玻璃盖玻片（B）以及经Pluronic F127抗污涂层处理的玻璃盖玻片（C）的情况。附着效率通过移除盖玻片后成功附着于PAA水凝胶上的动脉片数量与总样本数的比例来衡量：无盖玻片组（36个中4个）、未处理盖玻片组（36个中10个）、抗污涂层盖玻片组（36个中9个；D）。（E-G）未处理玻璃盖玻片尺寸对动脉片在PAA水凝胶上附着的影响。在14 mm孔中比较了12 mm未处理玻璃盖玻片（E）与13 mm未处理玻璃盖玻片（F）。附着效率通过移除盖玻片后附着于PAA水凝胶上的动脉片数量与总样本数的比例来衡量：12 mm盖玻片组（36个中10个），13 mm盖玻片组（72个中52个；G）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D、2.5D、2D 细胞生长模型；显微镜图像显示形态学差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：模型的维度决定了细胞外延生长过程中的组织方式（d2+）。在 3D 模型中（左），细胞以出芽状结构从组织中迁移出来，与 2.5D 模型（中）相似；而在 2D 设置中（右），细胞以单层结构从组织中迁移出来。比例尺为 250 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚丙烯酰胺凝胶出芽实验；显微镜图像 A、B；柱状图 C；刚度比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在2.5D模型中，内皮细胞出芽的起始依赖于聚丙烯酰胺水凝胶基质的刚度（d2）。（A-B）动脉片覆盖一层I型胶原凝胶，置于柔软（A；1 kPa）或坚硬（B；12 kPa）的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶之上，在实验方案的第2天（添加I型胶原凝胶后1天）的图像。（C）出芽起始通过已表现出细胞外延生长迹象的动脉片数量占总样本数的比例来衡量：柔软组（24个中7个），坚硬组（24个中3个）。比例尺代表1 mm（A, B）或500 µm（A', B'）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移延时图像，显示位移矢量；4小时期间的显微镜数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：早期出芽型血管生成过程中牵引力的表征。 上排显示了0至4小时时间序列中的细胞成像结果。中排和下排分别显示在1 kPa PAA水凝胶基底上对应的荧光标记物位移（0–2 µm）和细胞牵引力（0–50 Pa）。0 h、2 h和4 h时细胞牵引力的放大图像以橙色显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="利用动脉环和胶原基质在猪组织中进行组织制备及血管生成过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67641/67641fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：一种允许对细胞出芽进行力学表征的 2.5D ex vivo 出芽型血管生成模型方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/67641fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 kPa</td>
			<td>12 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>435 µL</td>
			<td>373.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% 丙烯酰胺</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>93.8 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% 双丙烯酰胺</td>
			<td>7.5 µL</td>
			<td>25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>荧光标记物（深红色）</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>2.5 µL</td>
			<td>2.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>0.25 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 聚丙烯酰胺凝胶混合比例。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>公式</td>
			<td>每12孔板体积（130 µL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECG培养基</td>
			<td>VECG=Vfinal-Vcol1-VNaOH</td>
			<td>82.16 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I型胶原蛋白</td>
			<td>Vcol1=(Vfinal*Cfinal)/Cstock</td>
			<td>46 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>VNaOH=0.04*Vcol1</td>
			<td>1.84 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：使用体积（V）和浓度（C）的缩写表示的I型胶原凝胶混合液体积。
视频 1：2.5D 模型中细胞出芽形成的延时成像。 使用相差成像技术对细胞进行为期 22 小时的成像，时间间隔为 17.5 分钟。如不同焦平面所示，细胞出芽在 I 型胶原凝胶层内的多个高度上形成。比例尺代表 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/Grolleman%20et%20al._Video%201_timelapse.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：2.5D 模型中细胞出芽结构内细胞的高增殖率。 使用相差成像技术对细胞进行成像，成像持续时间为 22 小时，时间间隔为 17.5 分钟。在延时成像过程中，领头细胞和跟随细胞均发生增殖。比例尺代表 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/Grolleman%20et%20al._Video%202_cell%20proliferation.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充 图1：通过免疫荧光染色检测二维模型（d2+）中的细胞表型。（A）细胞核（DAPI）、内皮细胞标志物（CD31）和成纤维细胞标志物（α-平滑肌肌动蛋白；α-SMA）的免疫荧光（IF）染色。（B）细胞核（DAPI）、内皮细胞标志物（CD31）和平滑肌细胞标志物（钙调蛋白结合蛋白；calponin）的免疫荧光（IF）染色。比例尺为 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充文件 1：免疫荧光染色实验方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67641/Supplementary%20File%201_RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

血管新生是发育和疾病中的基本过程，涉及复杂的分子和力学机制。本文介绍一种多功能的2.5D ex vivo 模型，用于分析源自猪颈动脉的细胞出芽，揭示了刚度依赖性的血管生成以及独特的领头细胞与跟随细胞的力学行为。该模型有助于推动组织工程策略和癌症治疗方案的发展。

2.5D 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

出芽式血管生成是指从已有的血管系统形成新血管的过程，在组织生理过程中具有重要意义……

量化驱动三维活体组织中血管出芽的细胞力学机制仍然十分困难，但在再生医学领域取得进一步进展又必须克服这一挑战。本方案通过将二维定量方法的易用性与三维组织的代表性相结合，使该任务更易于实现。目前针对活体组织中血管新生出芽过程的细胞力量化方法，仅限于复杂且计算成本高昂的三维力推断技术。本方案通过将牵引力显微镜技术应用于离体系统，在体外控制与体内相关性之间建立了桥梁，提供了一种易于使用且具有生理相关性的时空力学表征方法。2 Nav-D模型在保持生理环境的同时，允许对细胞力学进行定量分析，为研究驱动出芽型血管生成的力学机制提供了独特途径。首先，用移液器将120微升结合硅烷溶液加入玻璃底12孔板的每个孔中。将培养板在室温下孵育一小时。孵育结束后，使用喷瓶以无水乙醇洗涤各孔三次，并用氮气吹干培养板。用移液器将11.5 µL新配制的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶混合物滴加至每个孔的玻璃底部。将一个13毫米的盖玻片轻轻放置在每个液滴上方。聚合后，向孔中加入PBS。使用弯针轻轻将盖玻片从PAA凝胶上松解。然后使用镊子从孔中移除盖玻片。在PAA凝胶上加入75微升溶于超纯水的1毫克/毫升磺胺沙帕溶液。将培养板置于365纳米紫外光下照射5分钟。用 PBS 快速冲洗凝胶上的磺胺样品。随后用 PBS 将功能化的 PAA 凝胶洗涤两次，每次 10 分钟。在功能化的 PAA 凝胶上加入 50 微升胶原蛋白 4 溶液，于 4 摄氏度孵育过夜。第二天，用 PBS 将凝胶洗涤两次，然后使其干燥五分钟。在凝胶表面加入 50 µL 内皮细胞生长培养基（ECG 培养基）。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育一小时。首先，使用无菌外科镊子将盛有改良CREB溶液的运输瓶中的猪颈动脉转移至一个装有无菌PBS的大培养皿中。用外科镊子和手术刀去除颈动脉周围多余的组织。使用手术刀从动脉两端各切除两到三厘米，以去除靠近动脉分叉的区域。使用精细的圆头镊子和手术刀，去除颈动脉周围的动脉筋膜。用镊子将清理好的颈动脉转移至一个盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的新的大培养皿中。将动脉切成宽度约为两毫米的环状片段。然后将血管环转移至含有ECG培养基的预热小培养皿中，置于37摄氏度环境中。开始操作时，使用圆头镊子将猪颈动脉环从ECG培养基转移至盛有PBS的中等大小培养皿中。使用圆头镊子和手术刀将血管环切成两半，然后将半环解剖成宽度约为两毫米的片状，制备成尺寸为2×2毫米的动脉片。用圆头镊子夹住动脉片背面，将内皮内衬面向PAA基质，置于PAA凝胶边缘。接着，在镊子辅助下，轻柔地将动脉片移至PAA水凝胶中央，避免接触凝胶表面。在动脉片上加入50微升ECG培养基，同时确保液滴保留在凝胶上。使用圆头镊子将一片干燥的13毫米盖玻片置于PAA基质上的动脉片表面的培养基中。利用玻璃底培养皿的内缘轻轻放下盖玻片，直至培养基液滴在盖玻片下方铺展开来。将组织置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育5小时，使其贴壁。随后，向每个孔中加入1毫升ECG培养基。将动脉片在PAA基质上于37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。第二天，使用弯针小心地掀起盖玻片，并用镊子将其从动脉片上移除。用真空抽吸法去除孔内及周围组织的培养基，注意不要触碰组织。在每片动脉片上加入10 µL I型胶原凝胶混合物。在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时，使凝胶聚合。孵育后，向每个孔中轻柔加入1毫升预热的ECG培养基。将培养板转移至37°C、5% CO₂的培养箱中培养24小时。当使用13毫米未经处理的盖玻片时，可观察到动脉片贴壁效率提高，且在移除过程中剪切力最小。在2.5D系统中培养猪颈动脉24小时后，检查是否存在出芽性血管生成。若观察到出芽性血管生成，则更换ECG培养基，并将12孔板放入显微镜37摄氏度预热孵育箱内的载物台支架中。根据成像需求选择显微镜物镜。使用相差成像设置曝光时间并调整焦平面。然后添加荧光通道以对荧光微球进行成像，并再次设置曝光时间。在样品中选择多个感兴趣区域，并为每个位置调整焦平面。通过选择 5 到 20 分钟的时间间隔以及 4 到 24 小时的持续时间，确定所需的时间序列。开启聚焦系统，以在整个延时成像过程中保持稳定的聚焦。接下来进行牵引力显微镜实验时，在孔中加入含 5% SDS 的超纯水，静置数分钟，使向外生长的细胞脱落。在每个选定位置获取PAA基质中荧光标记物的Z轴层扫图像，以获得荧光标记物的松弛状态作为参考图像。使用自定义的MATLAB代码，选择时间序列图像和参考图像进行图像处理，并定义分析参数。相对于最佳参考图像对时间序列图像进行对齐和裁剪，以实现精确分析。通过分析荧光标记物在PAA水凝胶中的位移，执行粒子图像测速不对称性分析，比较时间序列图像与参考图像之间的差异。将图像测速不对称性分析设置为将图像划分为32×32像素的 interrogation windows（ interrogation 窗口），重叠度为0.5。最后，根据PAA凝胶的力学特性计算细胞牵引力。在猪动脉组织的2.5D和3D模型中观察到细胞出芽的形成，呈现出类似血管生成的模式，而2D模型中未见出芽性血管生成。与较硬的PAA水凝胶基质相比，较软的PAA水凝胶基质促进了早期动脉出芽性血管生成，表明了基质刚度的影响。牵引力显微镜显示，细胞出芽结构在突起部位表现出拉力，沿出芽轴向则表现出推力，这些力学行为由前导细胞和跟随细胞共同驱动。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于活组织中发芽血管生成的 离体 机械表征的 2.5D 模型

由诱导性多能干细胞（iPSC-EPs）衍生的内皮祖细胞有望彻底改变心血管疾病的治疗方法，并可用于构建更贴近真实情况的心血管疾病模型。本文介绍了将iPSC-EPs包封于三维（3D）胶原微环境中的方法，以及对这些细胞血管生成潜能的定量分析。...

一种用于量化iPSC来源内皮祖细胞成血管潜能的体外三维模型及计算分析流程

本方法描述了在标准化的微流控平台上培养由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞，形成40条可灌注的三维微血管。该平台能够以可扩展且高通量的方式研究三维环境中由浓度梯度驱动的血管生成出芽过程，包括出芽的吻合及稳定化。...

体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

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模拟新生血管化初始事件的微流控模型

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体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

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了解发芽血管生成的离体机械表征方法，使用猪颈动脉2.5D模型结合牵引力显微镜技术。该方法揭示了硬度依赖性血管生成机制，为组织工程和癌症治疗研究提供新工具。

2.5D 模型离体活体组织中出芽式血管生成的力学表征

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