小鼠内耳组织的冷冻切片和免疫染色：从胚胎阶段到成人阶段

我的研究重点是耳蜗的神经发育。具体来说，我的目标是揭示耳蜗内 SNAPS 形成的潜在机制，并研究阿尔茨海默病与听力损失之间的联系。实时成像和遗传工具正在提高我们更详细地研究耳蜗结构和神经回路的能力，从而更深入地了解听析员系统的弹性和功能障碍。通过发布此协议，我们希望帮助刚接触听析员科学的研究人员，尤其是那些以前没有使用过耳蜗的研究人员。本指南逐步解释如何制备胚胎、新生儿和成年小鼠的内耳样本。我们的目标是使内耳实验更容易，并确保结果可靠和一致。与全片免疫染色等其他方法相比，横截面免疫染色具有多种优势。它可以很好地保存蛋白质和核酸，并创建薄的、接近 2D 的切片，使测量更加准确和一致。该方法还可以保持所有耳蜗细胞类型完整且可见，从而改善免疫染色的培养。与整片制剂不同，横截面保留了重要的结构，如螺旋韧带、血管纹、赖斯纳膜和盖膜。

[导师]首先，将幼年安乐死小鼠放在手术平台上。使用细解剖剪刀，小心地沿着头皮做一个中线切口，从颈部开始，一直延伸到鼻子。接下来，将剪刀的底部刀片放在枕骨大孔处，将顶部刀片放在颅骨处。将颅骨的上半部分切至鼻子，完成第二次切口。将剪刀从部分切开的头部中取出。将剪刀的底部刀片放在颅骨底部，将顶部刀片放在枕骨大孔处。将头部的下半部分切到鼻子，完成第三次切割。使用细镊子和剪刀，小心地分离颞骨周围的任何软组织，包括大脑、肌肉和结缔组织。接下来，将小鼠半头放入含有PBS的24孔板的孔中。用4%多聚甲醛溶液代替PBS进行固定，并在室温下孵育45分钟。固定后，用PBS冲洗组织3次，持续5至10分钟。在小鼠半头内找到颞骨或内耳囊。使用细镊子小心地分离内耳囊周围的软组织。松开后，切开内耳囊周围的组织。然后使用镊子对内耳囊周围区域施加轻轻的压力，使其完全释放。将内耳样本储存在四摄氏度的PBS中。首先，将成年安乐死小鼠放在手术平台上。使用锋利的解剖剪刀，沿着头皮做一个中线切口，从颈部开始，一直延伸到鼻子。在第一次切割时将皮肤向后折叠以暴露头骨。将剪刀的底部刀片放在枕骨大孔处，将顶部刀片放在颅骨处。将颅骨的上半部分切至鼻子，完成第二次切口。将剪刀从部分切开的头部中取出。将底部刀片放置在颅底，将顶部刀片放置在大孔。沿着中线将头部的下半部分切到鼻子，避开内耳。对于每个半头，使用镊子和剪刀分离颞骨周围的软组织，包括大脑、肌肉和结缔组织。接下来，用手指反向卷曲颅骨组织，并用拇指轻轻按压颞骨的下侧。逐渐从周围的附件中松开骨头。取出内耳囊后，用 PBS 彻底冲洗。将装有 4% 多聚甲醛的 Sylgard 培养皿放在显微镜下。将单个内耳囊放入培养皿中。检查内耳是否有任何附着的软组织或骨骼，然后轻轻将其取出。识别椭圆形窗口并使用镊子轻轻取出镫骨。接下来，使用细镊子在耳蜗顶端开一个小孔。使用装有 4% 多聚甲醛的 P20 移液器冲洗耳蜗，以确保稀释的血液或内淋巴等液体通过椭圆形窗口排出。将固定耳蜗转移到充满4%多聚甲醛的24孔板中。标记时间并使用摇杆或章动器轻轻搅拌孵育30至60分钟。孵育后，用PBS冲洗样品3次，持续5至10分钟。最后一次冲洗后，将耳蜗放入 1.25 毫摩尔 EDTA 中，并在 4 摄氏度下摇晃两到三天。EDTA处理后，用PBS冲洗耳蜗3次，每次5分钟。首先，将解剖的内耳囊放入 10% 蔗糖溶液中，并在室温下孵育两小时。孵育后，用20%蔗糖代替10%蔗糖溶液，再孵育两个小时。然后用30%蔗糖代替20%蔗糖溶液，并将样品在4摄氏度下孵育过夜。第二天，取出一半的 30% 蔗糖溶液。用最佳切割温度或 OCT 化合物填充空间，让样品摇晃 30 分钟到两个小时。 将样品转移到填充有OCT化合物的标记冷冻模具中。检查嵌入冷冻块中耳蜗的方向。确保内耳;对于标准耳蜗横截面，凹面面向冷冻模具的窄侧。接下来，将干冰放入一个小容器中，加入 5 至 10 毫升二甲基丁烷。将含有 OCT 的冷冻模具和样品放在冒泡的干冰上以快速冷冻块。将冷冻块转移到预冷至零下 20 摄氏度的低温恒温器的腔室中。让样品平衡 30 至 60 分钟。使用铅笔或钢笔标记冷冻块与耳蜗位置相对应的一侧，以确保切片的正确方向。接下来，在卡盘上添加一小池 OCT，并将冷冻块放在其上，确保没有铅笔标记的宽边朝下。将装有 OCT 和样品的卡盘放入冷却的低温恒温器室中，让 OCT 完全冷冻。几分钟后，将装有样品的卡盘放在卡盘支架上，铅笔标记指向右侧或左侧。在低温恒温器上，使用 40 微米设置修剪块，直到组织变得明显。一旦组织明显，使用专为冷冻切片设计的载玻片收获 12 微米切片。在显微镜下检查切片位置。如果接近耳蜗转弯，请继续收获 12 微米切片，定期检查位置，直到所有耳蜗转弯都切片完毕。