从小鼠肺组织中分离活体髓系细胞和上皮细胞群体

我们研究病毒感染后肺组织的修复过程。旨在理解免疫细胞介导上皮修复的机制，以及病毒感染导致的损伤及后续修复过程中的重塑如何影响未来疾病的病理进程。本方案解决了肺组织消化产物在分别用于上皮和间质细胞或免疫细胞时存在的不兼容问题。

我们的研究需要从免疫和非免疫区室中分离出有活力的细胞。此外，我们提出了一种针对上皮细胞和巨噬细胞亚群的设门策略，希望这将有助于推动该领域的发展。本实验室致力于研究在稳态条件下以及应对环境刺激时，呼吸系统中免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。

我们的最终目标是确定如何最好地调节这种通讯以促进组织修复并预防疾病发生。首先，用70%乙醇喷洒小鼠。使用精细手术剪和7号镊子，切开腹部，并横向切开腹膜。

在膈肌上做一个小切口以释放负压。随后，将膈肌和下部肋骨从体腔中剪除，以暴露肺和心脏。使用装有27号针头的10毫升注射器，用5毫升含2毫摩尔EDTA的DPBS溶液灌注肺脏。

沿胸骨垂直剪开，并沿两侧剪开肋骨，打开胸腔以暴露气管。使用精细剪刀和7号镊子，尽可能去除肌肉和结缔组织，注意不要刺破气管或肺部。接着，用2/0缝合线缠绕气管，将其置于结扎位置，但不要打紧。

在气管上做一个侧向切口，插入导管。然后拉紧缝线以固定导管。使用注射器注入1毫升DPBS溶液充盈肺部。

然后，缓慢回抽注射器以抽出 DPBS。用相同的 DPBS 重新充盈肺部，再次回抽注射器以收集支气管肺泡灌洗液（BAL）。在保持导管留置的情况下，将注射器从导管上断开。

将收集的瓣膜放入微量离心管中。接着，用同一支一毫升注射器吸取一毫升dispase。将注射器连接至导管，并用dispase充盈肺部。

拔出导管时，收紧气管周围的缝线，以防止dispase泄漏。使用剪刀横向剪开气管。在向上牵拉肺和气管的同时，剪断肋骨后方的结缔组织，将肺从体腔中取出。

然后，将心脏从肺脏中取出。将肺脏置于含有五毫升 DPBS 的容器中，并置于冰上。在 4°C 条件下，以 400 G 离心五分钟。

用移液器吸除上清液，并将沉淀重悬于 100 微升 RPMI 中。首先，解剖从小鼠体内获取的肺部五个叶，去除结缔组织。在玻片上用剪刀将解剖后的肺组织剪切一分钟。

使用解剖剪将切碎的肺组织转移至一个50毫升离心管中。然后加入3毫升消化液，用移液器将肺组织消化混合物上下吹打2至3次。最后，加入用RPMI重悬的支气管肺泡灌洗液所获得的细胞沉淀。

将试管以45度角置于设定为37摄氏度、140转/分钟的旋转摇床中孵育40分钟。孵育结束后，从摇床中取出试管并置于冰上。用移液器将肺组织消化液上下吹打5至6次。

将混合物通过70微米细胞滤筛过滤至新的50毫升离心管中。用10毫升含5% FBS的RPMI培养基冲洗滤筛上残留的细胞，并中和酶活性。在4摄氏度下以600 × g离心5分钟。

使用真空吸液器吸除上清液。将细胞沉淀重悬于一毫升 ACK 裂解缓冲液中，在室温下孵育三分钟以裂解红细胞。然后加入九毫升 PBS，上下吹打混匀溶液。

再次离心样品，并使用真空抽滤器去除上清液，然后将细胞沉淀重悬于1毫升荧光激活细胞分选缓冲液中。将悬液通过64微米滤网过滤至微量离心管中，用于流式细胞术分析。