Name: 用于体外测定的人单核细胞衍生巨噬细胞的重编程模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 了解人单核细胞衍生巨噬细胞的重编程方法，用于免疫学和细胞生物学研究。该标准化体外模型可探究巨噬细胞极化机制，为药物筛选和疾病研究提供可靠工具。

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本研究工作得到了国家科学技术促进局（ANPCyT-FONCYT）的资助，项目编号分别为 PICT 2018-3070、2021-I-A-00807（授予 E.A.C.S.）和 PICT 2021-I-A-00716（授予 A.E.E.），同时得到国家科学技术研究委员会（CONICET）PIP 2022-0763 项目以及布宜诺斯艾利斯大学“社会影响力战略性研究与发展项目”（PIDAE）2022 年度项目（授予 A.E.E.）的支持。E.A.C.S. 和 A.E.E. 为 CONICET 的职业研究员。

所有健康志愿者献血者均签署了书面知情同意书，本研究已获得阿根廷国家医学科学院（IMEX-CONICET-ANM）机构伦理委员会批准。有关本实验方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
注意：PBMCs 从 40 mL 用 3.8% 枸橼酸钠抗凝的外周血中分离，采用 Ficoll-Hypaque 密度梯度（1077）离心法。本方案需在 BSL2 生物安全柜中的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>将收到的抗凝外周血样本转移至适当的15 mL或50 mL离心管中，用于离心。</li>
	<li>在室温下以200 × g 离心15分钟（加速度：4，减速度：2，最大值为5），获得上层富含血小板的血浆（PRP）以及下层包含红细胞和白细胞的细胞组分。见图1。</li>
	<li>将上层组分（PRP）转移至15 mL离心管中（若需保存血浆），然后以600 × g 离心10分钟（最大加速度和减速度），获得最终无血小板的血浆组分。将血浆储存在-20 °C。</li>
	<li>用室温预热的无菌1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）将第一次离心所得的细胞组分稀释2倍（最小）至3倍（最大）。轻轻混匀后，用于Ficoll-Hypaque密度梯度离心。</li>
	<li>将15 mL Ficoll-Hypaque转移至无菌50 mL离心管中。然后，小心缓慢地将30 mL稀释血液加至Ficoll液面上方，避免两相混合。若处理的稀释血液为10 mL或更少，将4 mL Ficoll-Hypaque转移至15 mL离心管中，再加入10 mL稀释血液样本。 
	注意：此步骤对获得单个核细胞组分至关重要。</li>
	<li>将含有Ficoll和稀释血液的离心管在室温下以600 × g 离心25分钟（加速度：1；减速度：0）。</li>
	<li>用无菌3 mL巴斯德吸管移除部分上层黄色液体。然后，用无菌巴斯德吸管小心收集黄色上层与Ficoll层之间形成的界面（单个核&#34;环状&#34;组分）。该&#34;环状&#34;组分含有目标单个核细胞（PBMC）。 
	注意：可收集部分残留的血浆相，但务必避免接触Ficoll相，因其可能对PBMC具有毒性。</li>
	<li>将收集的PBMC转移至新的含有至少3 mL无菌1× PBS的15 mL离心管中。然后用相应体积的无菌1× PBS补足至12–15 mL。以600 × g（最大加速度和减速度）离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，再次洗涤PBMC。加入1 mL无菌1× PBS重悬细胞沉淀，再用额外的无菌1× PBS补足至12–14 mL。以600 × g（最大加速度和减速度）离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将PBMC沉淀重悬于含2%灭活胎牛血清的无菌1× PBS（1× PBS-2% FBS）中，并将体积调至10 mL。使用自动细胞计数仪或显微镜计数细胞：先用无菌冷1× PBS将细胞悬液按1:5稀释，再用台盼蓝按1:2稀释，最终稀释倍数为1:10。使用光学显微镜进行计数。</li>
	<li>在8–10 °C下以300 × g 离心5分钟，沉淀PBMC。用适量无菌、冰冷的1× PBS-2% FBS重悬细胞，使终浓度为108 个细胞/mL。将细胞置于4 °C，待下一步使用。 
	注意：若收集的PBMC不能在当天使用，建议将其以108 个细胞/mL的浓度加入适当的冻存液（含10%二甲基亚砜（DMSO）的90% FBS）中，分装至冻存管。在聚乙二醇容器中于-80 °C过夜冷冻，以实现缓慢降温，从而最大限度减少细胞损伤。次日，将细胞转移至储存盒中，在-80 °C保存数天，或转移至液氮罐中长期保存。</li>
</ol>
2. 使用磁珠分选 CD14+ 单核细胞
注意：健康供体外周血单个核细胞（PBMC）中CD14单核细胞的数量因年龄和性别而异。若有条件，应使用细胞计数仪确定每个样本中单核细胞的百分比，然后计算分选所需CD14单核细胞数量对应的PBMC数量。若无细胞计数仪，可粗略按每份PBMC样本中单核细胞占10%进行估算4,6,7,10,11,12,13。
使用人 CD14 阳性选择试剂盒分离 CD14+ 单核细胞5。我们已标准化了分离方案，采用 1 至 2 × 107 个 PBMC 在 100 µL 反应体系中进行；若细胞数量更高，也请保持此比例。即使 PBMC 数量低于 1 × 107，建议的最小反应体积仍为 100 µL。
<ol>
	<li>将PBMC细胞悬浮液用含1 mM乙二胺四乙酸的1×PBS-2% FBS缓冲液（1×PBS-2% FBS-1 mM EDTA）调整至浓度为1–2 × 108 个细胞/mL，并将所需量的PBMC转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中。</li>
	<li>每100 µL细胞悬液中加入10 µL阳性选择混合液，充分混匀后室温孵育15分钟。</li>
	<li>每100 µL细胞悬液中加入10 µL磁性纳米颗粒，用力吹打混匀至少5次以上，使磁性纳米颗粒均匀悬浮，室温孵育10分钟。 
	注意：不建议使用涡旋振荡器。</li>
	<li>加入1×PBS-2% FBS-1 mM EDTA缓冲液，使细胞悬液总体积达到2.5 mL。轻轻吹打管内细胞2–3次混匀。将管子插入磁力分选器中，静置5分钟。</li>
	<li>将磁铁连同试管整体连续翻转，弃去上清液。磁性标记的细胞将保留在管内。保持磁铁和试管倒置2–3秒，然后将其垂直 upright 放置。 
	注意：管口残留的液滴请勿甩掉或吸除。</li>
	<li>从磁铁上取下试管，再次加入2.5 mL 1×PBS-2% FBS-1 mM EDTA缓冲液。轻轻吹打细胞悬液2–3次混匀。将试管重新插入磁铁中，静置5分钟。</li>
	<li>连续翻转磁铁和试管，弃去上清液。从磁铁上取下试管，将细胞重悬于适量不含EDTA的1×PBS-2% FBS缓冲液中。此时阳性选择的细胞已可用于后续实验。 
	注意：磁分选过程中共需进行两次5分钟的分离步骤。</li>
	<li>使用1×PBS-2% FBS缓冲液洗涤分选后的CD14细胞，将细胞悬液体积调整至12–14&#160;mL以稀释残留的EDTA，随后在600 × g条件下离心（最大加速度和减速度）10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，重复洗涤步骤：先用1 mL 1×PBS-2% FBS缓冲液重悬细胞沉淀，再加液至总体积12–14 mL。将试管在600 × g条件下离心（最大加速度和减速度）10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将阳性选择的CD14单核细胞重悬于2 mL 1×PBS-2% FBS缓冲液中。使用自动细胞计数仪，或通过将细胞悬液用无菌冷1×PBS稀释（1:5），再用台盼蓝稀释（1:2）后在光学显微镜下进行细胞计数。细胞在培养前需置于冰上保存。 
	注意：可通过流式细胞术检测细胞纯度，取50 µL细胞悬液，使用CD14+抗体（克隆HCD14）染色。建议纯度高于90%。</li>
	<li>进行培养时，在8–10 °C条件下以300 × g离心5分钟收集细胞悬液。用RPMI 1640培养基（添加10%灭活FBS和1%青霉素-链霉素，即RPMI-10% FBS-1% P/S）将细胞沉淀重悬至浓度为106 个细胞/mL。 
	注意：必须使用高质量、低内毒素、热灭活的FBS。操作过程中始终将细胞置于冰上，以避免单核细胞在接种前黏附于塑料器皿壁。</li>
</ol>
3. 单核细胞来源的巨噬细胞（M-DM）分化与极化
注意：M-DM 培养的操作方法为，在含有 500 µL RPMI-10% FBS-1% P/S 的 48 孔板中接种 2.5 × 105 个 CD14+ 单核细胞，在 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱中培养 7 天。建议选用经处理的培养板，以增强单核细胞在板上的贴壁能力。
<ol>
	<li>确定所有需要进行的实验条件，包括基础M-DM（M0）、促炎型M1、组织修复型M2a、调节型M2c以及所需的测试条件对应的孔。</li>
	<li>用移液器将250 µL在步骤2.11中制备的细胞悬液加入各孔，使每孔接种2.5 × 105个CD14+单核细胞。</li>
	<li>向每孔加入250 µL RPMI-10% FBS-1% P/S培养基，并添加50 ng/mL M-CSF，使总体积达到500 µL。</li>
	<li>将细胞培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中培养4天，以完成巨噬细胞分化的第一阶段。 
	注意：定期检查细胞培养的分化情况，观察是否出现预期的形态学变化，或是否存在不应有的未贴壁细胞。</li>
	<li>在M-DM培养的第4天更换一半培养基（250 µL RPMI-10% FBS-1% P/S），并根据极化条件加入相应的细胞因子或试剂，继续培养3天（终点为第7天）：M1极化使用LPS（1 ng/mL）加IFNγ（50 ng/mL），M2a极化使用IL-4（40 ng/mL），M2c极化使用IL-10（50 ng/mL）或地塞米松（0.1 µM）。</li>
	<li>在第7天收获M-DM，用于表型鉴定，或按后续两个步骤的要求收集细胞进行mRNA表达分析，或进行功能检测。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术对极化M-DM的表面表型进行表征
<ol>
	<li>弃去全部培养基（48孔板中500 µL），加入200 µL含1 mM EDTA的1× PBS-2% FBS缓冲液用于收集细胞。冰上孵育20分钟，然后加入200 µL 1× PBS-2% FBS以稀释EDTA缓冲液。用移液器反复吹打将M-DM收集至1.5 mL微量离心管中。用1× PBS-2% FBS洗涤收集的细胞一次，800 × g离心3分钟。</li>
	<li>用200 µL 1× PBS-5% FBS重悬M-DM沉淀，转移至96孔圆底微量板中，室温避光封闭15分钟。800 × g离心3分钟。</li>
	<li>在1× PBS-2% FBS中配制适当组合的直接标记抗体。每孔或每种条件（1×）加入50 µL&#160;抗体组合，4 °C避光孵育30分钟。 
	注：此处抗体组合包括CD11b-APC/Cy7、CD64-APC、CD163-PerCP/Cy5.5、CD206-AlexaFluor 488、CD14-PECy7以及MERTK-生物素联合链霉亲和素-PE。预滴定的抗体浓度见表1。</li>
	<li>加入150 µL 1× PBS洗涤染色后的M-DM，800 × g离心3分钟。</li>
	<li>为检测细胞活力，加入100 µL可固定活力染料Zombie Violet（以1× PBS按1:1,000稀释），4 °C避光孵育30分钟&#160;。</li>
	<li>加入100 µL 1× PBS洗涤染色细胞，800 × g离心3分钟。再用200 µL 1× PBS重复洗涤一次。</li>
	<li>用100 µL固定剂（来自固定/通透试剂盒）重悬M-DM沉淀，冰上避光孵育20分钟以进行固定。 
	注：为实现适当的固定效果，正确均质化细胞沉淀至关重要。</li>
	<li>加入100 µL 1× PBS-2% FBS洗涤M-DM，800 × g离心3分钟。再用200 µL 1× PBS-2% FBS重复洗涤一次。</li>
	<li>用200 µL 1× PBS重悬M-DM沉淀，上样至流式细胞仪检测染色细胞。</li>
</ol>
5. 通过qPCR分析基因表达谱以区分M-DM极化状态
注意：在培养的第7天，可使用RNA提取试剂收获2.5 × 105个M-DM，以分离高质量的总RNA。也可采用其他方法进行RNA提取，例如基于离心柱的RNA提取和洗脱试剂盒。
<ol>
	<li>弃去全部培养基体积，并通过直接加入 350 µL 裂解提取试剂裂解 M-DM。充分匀浆后，将细胞悬液转移至 1.5 mL 无 RNase/DNase 的微量离心管中，继续进行 RNA 提取。 
	注意：若当天不进行 RNA 提取，步骤 5.1 的样品可在 4 °C 下保存过夜，或在 -20 °C 下保存长达一年。</li>
	<li>为使核蛋白复合物完全解离，将步骤 5.1 中匀浆后的样品在 25 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入 70 µL 氯仿。盖紧管盖以防泄漏，并通过剧烈振荡充分混匀内容物。室温静置 2–3 分钟后，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。此步骤将使溶液完全分层，形成下层酚-氯仿相、中间相和上层无色水相。 
	注意：氯仿的体积基于裂解步骤中每 1 mL 提取试剂使用 0.2 mL 氯仿的比例。</li>
	<li>将含有 RNA 的水相转移至新的 1.5 mL 无 RNase/DNase 的微量离心管中。 
	注意：吸取水相时应保留少量体积，避免转移中间相或有机相。</li>
	<li>向每个样品中加入 175 µL 异丙醇以沉淀 RNA。在 4 °C 下孵育 10 分钟，或选择在 -20 °C 下过夜孵育。 
	注意：异丙醇的体积基于每毫升初始提取试剂加入 0.5 mL 异丙醇的比例。</li>
	<li>在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。总 RNA 将形成白色凝胶状沉淀于管底。使用移液器小心吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用 350 µL 75% 乙醇（v/v）重悬白色凝胶状沉淀以洗涤 RNA（每毫升裂解所用提取试剂对应 1 mL 乙醇&#160;）。 
	注意：RNA 可在 75% 乙醇中于 -20 °C 下保存长达 1 年，或于 4 °C 下保存长达 1 周。</li>
	<li>短暂涡旋重悬沉淀，并在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。使用移液器吸除并弃去上清液。将 RNA 沉淀在空气中或真空条件下干燥 5–10 分钟。 
	注意：为溶解 RNA，请避免过度干燥 RNA 沉淀。</li>
	<li>用 20–30 µL 无 RNase 水通过反复吹打重悬沉淀。在 55–60 °C 的水浴或加热块中孵育 10–15 分钟。随后测定 RNA 浓度，并将 RNA 储存于 -70 °C。</li>
	<li>使用 100–500 ng RNA（分别为最小和最大量）在 20 µL 反应体系中，利用 cDNA 合成试剂盒进行逆转录（生成 cDNA）。</li>
	<li>使用 1 µL cDNA（5–25 ng）进行实时 PCR 反应。
	<ol>
		<li>为每管配制反应混合液（1x）：5 µL SYBR Green 混合液（2x）、正向和反向引物各 0.2 µL，以及 3.6 µL 无核酸酶水。根据样品数量按比例放大各组分。充分混匀反应液后，分装 9 µL 至各 qPCR 管中，最后加入 1 µL cDNA，使终体积为 10 µL。</li>
		<li>在实时 PCR 仪上设置如下热循环程序：98 °C 预变性 2–3 分钟（1 个循环）；98 °C 变性 5–15 秒，60 °C 退火延伸 15–30 秒（35–40 个循环）；最后进行熔解曲线分析（65–95 °C），每步升温 0.5 °C，每步保持 2–5 秒，或采用仪器默认设置。 
		注意：本反应采用通用 SYBR Green 混合液进行标准化。用于 M-DM 极化分析的推荐引物列于 表 2 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以真核翻译延伸因子 1 alpha 1&#160;(EEF1A1) 作为内参基因对结果进行归一化处理，并通过解离曲线分析验证扩增产物的特异性。 
	注意：解离曲线分析可用于确认反应中仅存在单一 qPCR 扩增产物。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

巨噬细胞的分化、活化与极化已成为免疫学、组织稳态、疾病发病机制及炎症消退研究的核心焦点。此外，近年来的研究表明，在稳态失衡条件下，组织巨噬细胞可能来源于循环单核细胞，这进一步凸显了建立精确M-DM模型的必要性，该模型应具有明确的表型、转录程序和活化通路。
为了成功实施本方案，有必要在此讨论一些关键步骤。首先，应注意到，用于建立原代M-DM培养的血液样本在年龄、性别、遗传背景或环境因素方面可能存在异质性，这可能导致某些生物学反应出现显著差异。因此，从同一供体获取基础生物学和实验对照至关重要，建议采用配对分析方法。尽管如此，这种高变异性也可被视为一种优势，因为其反应谱更能反映生物学意义。在分选前，单细胞悬液中活细胞比例应超过70%。同样，分选后CD14+单核细胞的纯度应达到90%。M-DM培养的另一个关键因素是初始细胞密度。密度过低不利于细胞间的适当相互作用及巨噬细胞的分化，而密度过高则会增加细胞死亡。尽管细胞相互作用在巨噬细胞重编程中的影响尚未被充分研究，但一些先驱性研究表明，将人单核细胞与调节性T细胞共培养可促使巨噬细胞向M2表型分化18</su...

巨噬细胞最早由Metchnikoff根据其吞噬能力发现，是后生动物生命中具有古老起源的细胞。在成年哺乳动物体内广泛存在，巨噬细胞表现出显著的解剖学和功能多样性。作为单核吞噬细胞系统的一部分，与树突状细胞和单核细胞共同作用，巨噬细胞在多种生物学过程中发挥关键作用，从发育和稳态维持到针对病原体的免疫应答1,2。定居型巨噬细胞适应其特定组织微环境，作为哨兵细胞，持续监测组织健康状况，并对生理变化和外界威胁作出响应。其有限的可塑性被认为是一种进化适应机制，用以维持组织稳态。相比之下，募集而来的单核细胞更具可塑性，可在炎症过程中分化为多种表型的巨噬细胞。炎症信号与组织微环境的双重影响共同塑造了巨噬细胞的功能多样性3。因此，依据局部组织微环境的不同，单核细胞来源的巨噬细胞（M-DM）可分化为多种亚型。局部代谢物、生长因子、细胞因子以及细胞间相互作用4,5,6决定了它们的表型与功能。此外，巨噬细胞也是抑制炎症、促进血管再生和组织修复相关因子的关键生产者7,8。
鉴于至少存在三种主要机制调控巨噬细胞极化（外在因素、内在因素以及组织微环境条件），巨噬细胞极化应被视为一个多维度的过程2。目前描述巨噬细胞分化与极化的主要障碍和误区在于文献中实验条件的异质性，以及在体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中对巨噬细胞相关术语定义缺乏共识9。尽管如此，针对多种实验场景，实验标准的统一工作已开始推进。
为了更好地理解人类巨噬细胞领域，我们需要标准化且定义明确的 体外 M-DM 的模型，用于关联、分化、极化、表型及重编程，以及特定功能。我们的目标是建立一个标准化的 体外 人非极化M-DM M0及细胞因子极化巨噬细胞模型，用于通过流式细胞术和实时PCR研究M-DM的偏向性重编程。尽管巨噬细胞极化是一个动态过程，因其具有高度可塑性以及整合来自微环境多种信号的能力，但本文中我们对非极化M-DM（M0）及部分极化巨噬细胞进行了表征 体外 极化状态，即经典的促炎性状态，通常也称为M1，由IFNγ和LPS诱导。类似地，具有组织修复和调节功能的M2型巨噬细胞在IL-4刺激下可定义为M2a型，而在地塞米松或IL-10刺激下则可定义为M2c型。这些极化状态反映了M-DM微环境在时空分布上的广泛谱系中的某一瞬时特征，但为我们提供了若干关键参考点，用以建立分析图谱，从而定位实验条件的位置。
尽管表面标志物和转录程序的组合复杂且动态变化，但在分析时 体外 M-DM中，我们已确定CD64、CD206、CD163、CD14和MERTK可以&#160;通过流式细胞术区分未极化的M0状态与IFNγ/LPS诱导的M1、IL-4诱导的M2a以及IL-10或地塞米松诱导的M2c表型。此外， IRF1 和 CXCL10 基因表达被定义为IFNγ/LPS诱导的M1特异性； IRF4-、CCL22- 和 TGM2-特异性转录本用于IL-4诱导的M2a型；MERTK基因为地塞米松诱导的M2c型，设定额外的关键指标，以比较在不同刺激下或与其他细胞类型共培养时M-DM极化重编程的偏向性。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 小鼠抗人&amp;nbsp; CD206 抗体，克隆号 15-2</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 321113；RRID:AB_571874</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记鼠抗人 CD64 抗体，克隆株 10.1</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 305013；RRID:AB_1595539</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 标记的抗小鼠/人 CD11b 大鼠单克隆抗体，克隆号 M1/70</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 101226；RRID:AB_830642</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td>货号 554714</td><td>固定/透化试剂盒</td></tr><tr><td>生物素标记抗人 MERTK 抗体，克隆号 590H11G1E3</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 367616；RRID:AB_2721500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX-Connect 设备&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad，Hercules，CA，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒；EasySep 阳性选择混合液；EasySep 磁性纳米颗粒；Easy Sep 磁铁</td><td>STEMCELL Technologies，加拿大温哥华</td><td>货号 18058</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿-迪金森公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，新西兰来源&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;trade;&amp;nbsp;赛默飞世尔科技&lt;br/&gt; 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;</td><td>货号 10091148</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Cytiva</td><td>GE Healthcare - Life Sciences，美国</td><td>货号 17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td>RRID:SCR_008520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒，包含5倍反转录反应混合液、iScript反转录酶、无核酸酶水</td><td>Bio-Rad，Hercules，CA，美国</td><td>货号 1708891</td><td></td></tr><tr><td>Partec CyFlow space 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>Sysmex Partec，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE 链霉亲和素</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 405203</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 鼠抗人 CD14 抗体，克隆株 HCD14</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 325618；RRID:AB_830691</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 标记的小鼠抗人 CD163 抗体，克隆号 GHI/61</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 333607；RRID:AB_1134006</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco&amp;trade;&amp;nbsp;赛默飞世尔科技&lt;br/&gt; 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;</td><td>货号 11875119</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix，含有抗体介导的热启动Sso7d融合酶&amp;oacute;n 聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I 染料、增强剂、稳定剂以及被动参比染料（包括 ROX 和荧光素）的混合物。</td><td>Bio-Rad，Hercules，CA，美国</td><td>货号 1725271</td><td></td></tr><tr><td>TriZol 试剂</td><td>赛默飞世尔科技&lt;br/&gt; 生命科学解决方案&lt;br/&gt; 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德&amp;nbsp;</td><td>货号#&amp;nbsp; 15596026</td><td>RNA提取试剂</td></tr><tr><td>Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>货号 423113</td><td></td></tr></tbody></table>

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

单核-巨噬细胞谱系的细胞具有多种功能，几乎存在于所有身体组织中。它们协调先天免疫和适应性免疫的启动与消退阶段，在保护性免疫以及免疫介导的病理损伤中发挥重要作用。组织驻留型巨噬细胞在稳态条件下维持内环境稳定方面起关键作用，而在组织损伤或炎症刺激后，大量单核细胞会从外周血被募集至组织中。单核细胞来源的巨噬细胞（M-DM）可分化为多种动态亚型，其表型和功能取决于局部组织微环境。
为了比较M-DM分化和极化过程中不同的刺激因素或环境条件，我们建立了一种标准化方法 体外 人源非极化M-DM M0及若干关键细胞因子极化巨噬细胞模型，包括由IFNγ/LPS诱导的M1、IL-4诱导的M2a、以及IL-10或地塞米松诱导的M2c，用于通过流式细胞术和实时PCR分析M-DM的极化重编程。我们发现，CD64、CD206、CD163、CD14和MERTK可有效区分非极化M0与极化后的M1、M2a和M2c亚型。此外，我们定义了 IRF1 和 CXCL10 如经典IFNγ/LPS来源的M1型特定基因， IRF4-、CCL22- 和 TGM2特异性转录本，用于IL-4诱导的M2a型 MERTK 地塞米松诱导的 M2c 基因。综上所述，我们标准化的 M-DM 方案能够提供关键的 体外 利用该图谱分析不同刺激条件下人源M-DM的分化与极化。

基于我们多年来在巨噬细胞表征方面的研究工作，我们已确定了一组精确的标志物组合，可清晰区分不同亚群 体外 M-DM。表型标志物的选择基于文献以及我们先前进行的大范围筛选结果。9,14,15,16,17此外，我们确定通过流式细胞术检测CD64、CD206、CD163、CD14和MERTK的表达，可有效区分未极化的M-DM（M0）、经IFNγ/LPS诱导极化的M1型、IL-4诱导的M2a型以及IL-10或地塞米松诱导的M2c型。4,5,7,11<su...

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外 研究巨噬细胞极化与重编程的模型，为科研提供了有价值的工具。

单核-巨噬细胞谱系的细胞具有多种功能，几乎存在于所有机体组织中。它们协调先天免疫与适应性免疫……

我们的研究探讨了单核细胞和巨噬细胞谱系，强调其显著的可塑性以及整合微环境中多种信号的能力，从而在炎症、组织修复和感染过程中调控效应反应。巨噬细胞分布于全身，协调先天免疫和适应性免疫的启动与消退，影响保护性免疫及免疫介导的病理过程。巨噬细胞的重编程是该领域最具前景的研究方向。新兴的组学技术极大地革新了我们对巨噬细胞生物学的理解，使我们能够深入了解这些细胞的表型多样性、功能特征、可编程潜力及其发育起源。目前在巨噬细胞分化与极化研究中存在的主要障碍和陷阱，是文献中实验条件和操作方案的高度异质性，以及在定义“巨噬细胞”这一术语方面缺乏共识。我们展示了药物和脂质介质对巨噬细胞极化的重编程作用，并建立了巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞相互作用的体外三维模型。此外，我们已证明血小板可促使单核细胞来源的巨噬细胞分化为 N1 表型。首先，将抗凝外周血样本置于离心机中，在室温下以 200G 离心 15 分钟。观察血小板富集血浆位于上层，细胞组分（包括红细胞和白细胞）位于下层。将第一次离心获得的细胞组分用预热至室温的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。在进行Ficoll-Hypaque密度梯度离心前，轻轻混匀溶液。将15毫升Ficoll-Hypaque转移至无菌的15毫升离心管中。小心且缓慢地将30毫升稀释血液加至Ficoll溶液上方，确保两相之间尽可能减少混合。将含有Ficoll和稀释血液的离心管在室温下以600G离心25分钟。使用无菌的3毫升巴斯德吸管，移除部分黄色上层。用无菌巴斯德吸管小心收集黄色层与菲科尔层之间的界面。将收集到的外周血单个核细胞（PBMCs）转移至含有至少3毫升无菌PBS的新15毫升离心管中。用无菌 PBS 补充至试管，使总体积达到 12 至 15 毫升。然后在 600G 条件下离心 10 分钟。接下来，在 8 至 10 摄氏度下以 300G 离心 5 分钟，沉淀 PBMC 悬液。用含有2% FBS的无菌冷PBS重悬细胞，并将细胞置于4°C直至下一步操作。将所需体积的PBMC悬液转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中。然后，每 100 微升细胞悬液中加入 10 微升阳性选择混合液。充分混匀悬液后，在室温下孵育 15 分钟。接着，每 100 微升细胞悬液中加入 10 微升磁性纳米颗粒。用力吹打混悬液5次以上，确保磁性纳米颗粒均匀悬浮。室温孵育10分钟后，向悬液中加入含FBS和EDTA的PBS，使总体积达到2.5毫升。轻柔吹打细胞2至3次。将试管插入磁力分选器中，静置五分钟。以连续动作将磁铁连同试管一起翻转。保持磁铁和试管倒置两到三秒，然后将其恢复至直立位置。将离心管从磁铁上取下，然后再次向管中加入 2.5 毫升 PBS-FBS-EDTA 缓冲液。轻轻吹打细胞悬液上下 2 至 3 次以混匀。将离心管重新插入磁铁中，并静置 5 分钟。一次性连续操作，再次倒置磁铁和离心管，弃去上清液。将离心管从磁铁上取下，用适当体积的不含EDTA的PBS-FBS重悬细胞。此时，阳性筛选的细胞已可直接使用。向分选后的CD14细胞中加入PBS-FBS缓冲液，使总体积达到12至14毫升，以稀释残留的EDTA。在600×g下离心10分钟。弃去上清液后，将经阳性筛选的CD14单核细胞重悬于2毫升PBS-FBS缓冲液中。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。在培养前将细胞保持在冰上。进行培养时，将细胞沉淀重悬于补充的 RPMI 1640 培养基中，浓度为每毫升一百万个细胞。将250微升制备好的细胞悬液移液至48孔板的每个孔中。向每孔加入250微升含有50纳克/毫升巨噬细胞集落刺激因子的抗生素补充RPMI培养基。将细胞培养板置于湿润培养箱中孵育，以启动巨噬细胞分化。在巨噬细胞分化第四天，更换每孔中一半的培养基。加入细胞因子或试剂以建立所需的极化条件，并继续培养三天。在第七天收集由巨噬细胞衍生的单核细胞，用于表型鉴定。由干扰素γ联合脂多糖诱导的M1型巨噬细胞表现出CD64的最高表达水平，不表达CD206，并且CD163和MERTK的表达水平较低。由白细胞介素4诱导的M2a型巨噬细胞特征为CD206表达升高，而CD64、CD163和MERTK的表达水平降低。由白细胞介素10或地塞米松诱导的M2c型巨噬细胞表现出CD163和CD14表达增加，CD64呈中等水平表达，并且MERTK表达上调。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用于体外测定的人单核细胞衍生巨噬细胞的重编程模型

在本视频中，我们演示了利用共聚焦显微镜研究凋亡细胞清除过程的胞葬作用检测方法。胞葬作用是一个多步骤过程，其中凋亡细胞被吞噬细胞吞噬，并在称为胞葬体的囊泡内降解。本方案提供了一种可视化单个凋亡细胞被内化与未内化部分的方法，并可对胞葬作用进行定量分析。...

固定细胞吞噬凋亡细胞实验：一种利用荧光显微镜研究巨噬细胞对凋亡细胞吞噬作用的方法

本视频展示了将原代单核细胞诱导分化为巨噬细胞的过程。可通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）将原代人单核细胞分离并诱导为类似M1型的促炎表型，或通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导为类似M2型的抗炎表型。...

原代单核细胞体外培养及向巨噬细胞的分化

本视频展示了利用双分子荧光互补报告蛋白在人巨噬细胞中激活半胱天冬酶（caspase）蛋白的过程。将caspase-1的前结构域与非荧光性的Venus蛋白片段融合，这些片段可被招募至炎性小体复合物。炎性小体之间的空间接近性促使Venus片段重新折叠并产生荧光，从而证实巨噬细胞中caspase的激活。...

人源单核细胞衍生巨噬细胞中Caspase激活的可视化

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外...

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。...

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。...

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

本方案描述了从人诱导性多能干细胞高效生成巨噬细胞的方法，以及对这些细胞进行后续表征的技术。通过细胞表面标志物表达、基因表达分析和功能检测，评估由诱导性多能干细胞衍生的巨噬细胞的表型与功能特性。...

由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

本文介绍了一种评估植入物表面免疫调节潜力的详细实验方案 体外旨在提高现有实验方案的可靠性和可重复性，并推动进一步研究。通过使用人外周血单核细胞来源的巨噬细胞，检测其在钛材料表面培养时的分泌性细胞因子谱、mRNA表达及细胞表面标志物，以研究巨噬细胞的极化状态。...

在植入物表面极化并表征人单核细胞来源的M1与M2型巨噬细胞

鉴于可用于研究人源CART细胞与髓系细胞相互作用的异种移植模型有限，我们建立了 体外 和 体内...

研究髓系细胞与CAR T细胞之间的相互作用 体外 和 在体 内

了解人单核细胞衍生巨噬细胞的重编程方法，用于免疫学和细胞生物学研究。该标准化体外模型可探究巨噬细胞极化机制，为药物筛选和疾病研究提供可靠工具。

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型体外检测方法

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人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

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