完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

我们开发了一种可靠的实验方案，可在同一只果蝇大脑上进行多轮原位杂交，从而实现多种不同基因表达模式的可视化。将果蝇大脑包埋于水凝胶中，可有效维持组织完整性和 mRNA 稳定性，并在多轮杂交过程中保持良好效果。此外，该方法在成像时可显著提高光学通透性。

EASI-FISH 可被任何配备共聚焦显微镜或光片显微镜的实验室采用，用于定义果蝇大脑中细胞类型的基因表达谱。首先，用RNA去污染试剂擦拭无电荷载玻片。移除保护硅胶垫粘合面的不透明薄膜。

然后将含有最多四个腔室的垫圈粘附到载玻片上。使用P20移液器将一微升多聚赖氨酸涂覆于每个腔室表面。接着，将每管最多四只黑腹果蝇脑组织转移至0.2毫升PCR管中。

用含有 0.1% Triton X-100 的 150 微升 PBS 重悬脑组织，随后再加入 PBS。向每个腔室中加入 40 微升 PBS。使用一对精细镊子，将脑组织轻轻排列在腔室中央，彼此之间留出一定间距。

从腔室中移除 PBS，立即加入 50 微升 20 毫摩尔的 MOPS 缓冲液。在脑组织于 MOPS 缓冲液中平衡的同时，用移液器将等体积的解冻 Melphalan-X 加入另一管中，并加入等体积的 MOPS 缓冲液。然后按 1 比 100 的比例加入 Ac-X 储存液。

将溶液涡旋混匀，并短暂离心收集。移除各腔室中的所有MOPS缓冲液，加入50 µL美法仑-X Ac-X溶液。将盖玻片置于每个腔室上方，不使用垫圈粘合剂进行密封。

然后将孵育 chamber 置于湿盒中。次日，小心移除盖玻片，并吸除 Melphalan-X Ac-X 溶液。用 100 µL 的 0.1% PBT 缓冲液洗涤封片后的脑组织两次，随后用 100 µL 的 PBS 缓冲液洗涤。

将解冻的TREx-1000、4-羟基-TEMPO、TEMED和过硫酸铵溶液置于冰上。涡旋振荡TREx-1000溶液，确保无沉淀物。混合上述溶液以配制凝胶溶液，混匀后涡旋振荡，再置于冰上。

用移液器吸头吸除腔室中的 PBS，并用无绒擦拭布吸走残留液体。立即在每个腔室的脑组织上加入 40 微升凝胶溶液。将腔室置于 4 摄氏度孵育 10 分钟。

现在将凝胶溶液从电泳槽中移除。然后从垫圈表面的粘性保护膜上撕下透明保护膜。加入最后45微升新鲜凝胶溶液。

轻轻将盖玻片盖在腔室上，按压盖玻片以密封腔室，然后在4°C下继续孵育10分钟。将腔室置于37°C孵育1.5小时，使凝胶聚合。在实验台面上冷却凝胶后，使用刀片小心移除盖玻片和硅胶垫圈。

将凝胶修剪成矩形，并切去右上角以指示样品方向。接着，用少量蛋白酶K缓冲液润湿的细毛刷小心地将凝胶从载玻片上取下。将每块凝胶单独转移至一个2毫升微量离心管中。

将500微升Pro K缓冲液与5微升蛋白酶K酶混合，将混合液加入每块凝胶中。37摄氏度孵育过夜。次日，用细软的移液管吸除缓冲液，然后用PBS洗涤凝胶三次，每次10分钟。

将凝胶在 37 摄氏度下，用 1 毫升 DNASE1 缓冲液孵育 30 分钟。将 50 微升 DNASE1 酶与 450 微升 DNASE1 缓冲液混合。轻轻混匀，避免涡旋振荡。

将每块凝胶在 500 微升 DNASE1 溶液中于 37 摄氏度孵育 2 小时。然后，在室温下用 1 毫升 PBS 洗涤凝胶 4 次，每次 15 分钟。接着，将凝胶在 500 微升不含探针的解冻杂交缓冲液中于 37 摄氏度孵育 30 分钟。

将探针按1:100的比例用杂交缓冲液稀释，每块凝胶准备300微升。将凝胶与含有探针的杂交缓冲液在37摄氏度下孵育过夜。次日，先用探针洗涤缓冲液洗涤凝胶，再用PBS洗涤。

对于杂交链式反应，向凝胶中加入500微升扩增缓冲液，在室温下孵育30分钟。在PCR仪中将荧光发夹探针于95摄氏度加热90秒，然后将溶液冷却至25摄氏度并维持30分钟。针对每种探针，将匹配的发夹探针成对以1:50的比例用扩增缓冲液稀释，每块凝胶准备300微升。

涡旋混合后，将混合物加入凝胶中并进行孵育。为进行光片成像而安装凝胶时，先在凝胶支架的凝胶附着面上涂布1微升多聚赖氨酸，共涂两次，每次涂布后在37摄氏度下干燥。然后将凝胶放置在盖玻片上，使切口位于左侧。

使用画笔将凝胶一次性转移至处理过的表面。与神经递质相关的基因和神经肽基因在成年黑腹果蝇大脑中表现出不同的表达模式。VGluT 和 Gad1 在同一轮杂交中被共检测到，显示出不重叠的表达模式。

AstA 在视叶中呈现强表达，在中央复合体中表达较弱。Crz 在侧部区高度表达，而在视叶神经元中观察到较低水平的表达。通过特定的分裂GAL4品系结合光片显微镜或共聚焦显微镜观察Mer-GFP表达，可在H delta D神经元中检测到Tk的存在。

在由 Mer-GFP 标记的 PFG 神经元中未检测到 FMRFamide，但在周围神经元中可检测到。对 FB4K 神经元的高分辨率成像证实了 VGluT 和 ChAT/VAChT 转录本的空间分布。某些细胞中神经肽（如 AstA 和 Crz）的表达水平极高，以至于代表单个转录本的荧光点无法被分辨开来。