使用扩增辅助迭代荧光原位杂交对完整果蝇大脑中的基因表达进行多重检测
May 2nd, 2025
扩增辅助迭代荧光原位杂交 （EASI-FISH） 是一种强大的技术，它将扩增显微镜与荧光原位杂交 （FISH） 相结合，以检测厚组织中多个基因的表达。该协议概述了该方法的最新进展及其对标记完整果蝇中枢神经系统的适应性。
我们开发了一种强大的方案，可以在同一个果蝇大脑上进行多轮原位杂交，从而能够可视化许多不同基因的表达模式。将果蝇脑包埋在水凝胶中可确保在多轮杂交中实现出色的组织完整性和 mRNA 稳定性。它还显著提高了成像时的光学清晰度。
EASI-FISH 可被任何具有共聚焦或光片显微镜的实验室采用，以定义果蝇脑中细胞类型的基因表达谱。首先，用 RNA 去污试剂擦拭未带电的载玻片。撕下保护胶粘剂免受硅胶垫圈影响的不透明薄膜。
然后将包含最多四个腔室的垫圈粘附到载玻片上。使用 P20 移液器在每个腔室表面涂上 1 微升聚赖氨酸。接下来，每管最多将 4 个果蝇大脑转移到 0.2 毫升 PCR 管中。
在 150 微升含有 0.1% Triton X-100 的 PBS 中再水化大脑，然后是 PBS。向每个腔室中加入 40 微升 PBS。用一把细镊子，轻轻地将大脑排成一排，放在腔室的中心，在它们之间留出一些空间。
从腔室中取出 PBS，并立即加入 50 微升 20 毫摩尔 MOPS 缓冲液。当大脑在 MOPS 缓冲液中平衡时，将等体积的解冻的 Melphalan-X 移液到具有等体积 MOPS 缓冲液的试管中。然后以 1 比 100 的比例加入 Ac-X 储备液。
涡旋溶液并短暂旋转以收集它。从腔室中取出所有 MOPS 缓冲液，并加入 50 微升 Melphalan-X Ac-X 溶液。将盖玻片放在每个腔室的顶部，不要使用垫圈粘合剂进行密封。
然后将腔室放入加湿箱中。第二天，小心地取下盖玻片并吸出 Melphalan-X Ac-X 溶液。在 100 微升 0.1% PBT 中洗涤封固的大脑两次，然后用 100 微升 PBS 洗涤。
将 TREx-1000 4-羟基-TEMPO、TEMED 和过硫酸铵解冻的溶液置于冰上。涡旋 TREx-1000 溶液以确保没有沉淀。混合溶液以制备凝胶溶液并在结冰前涡旋。
使用移液器吸头，从腔室中取出 PBS，然后用无绒布吸走任何残留液体。立即在每个腔室的大脑上加入 40 微升凝胶溶液。将腔室在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。
现在从腔室中取出凝胶溶液。然后从垫圈表面粘合剂上撕下透明的保护膜。最后加入 45 μL 新鲜凝胶溶液。
轻轻地将盖玻片盖在腔室上，然后按压盖玻片以密封腔室，然后在 4 摄氏度下再孵育 10 分钟。将腔室在 37 摄氏度下孵育 1.5 小时以聚合凝胶。在工作台上冷却凝胶后，使用剃须刀片小心地取下盖玻片和硅胶垫圈。
将凝胶修剪成矩形，并切开右上角以指示样品方向。接下来，使用蘸有少量 Pro K 缓冲液的细画笔小心地将凝胶从载玻片上提起。将每块凝胶单独转移到 2 mL 微量离心管中。
混合 500 μL Pro K 缓冲液和 5 μL 蛋白酶 K 酶，并将混合物添加到每块凝胶中。在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，用细小灵活的移液管去除缓冲液，然后在 PBS 中洗涤凝胶 3 次，每次 10 分钟。
将凝胶在 37 摄氏度下放入 1 mL DNASE1 缓冲液中孵育 30 分钟。将 50 μL DNASE1 酶与 450 μL DNASE1 缓冲液混合。轻轻混合，不要涡旋。
将每块凝胶在 500 μL DNASE1 溶液中于 37 摄氏度下孵育 2 小时。然后，在室温下用 1 mL PBS 洗涤凝胶 4 次，每次 15 分钟。现在，将凝胶在 500 μL 解冻的杂交缓冲液中（不含探针）在 37 °C 下孵育 30 分钟。
在杂交缓冲液中以 1 比 100 的比例稀释探针，每块凝胶制备 300 μL。将凝胶与含有探针的杂交缓冲液在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，先在探针洗涤缓冲液中洗涤凝胶，然后在 PBS 中洗涤凝胶。
对于杂交链式反应，向凝胶中加入 500 μL 扩增缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。在 PCR 机器中将荧光发夹在 95 摄氏度下加热 90 秒，然后将溶液冷却至 25 摄氏度 30 分钟。对于每个探针，在扩增缓冲液中以 1 比 50 的比例稀释匹配的发夹对，每块凝胶制备 300 μL。
涡旋混合物后，将混合物加入凝胶中并孵育。要封片用于光片成像，请在凝胶支架的凝胶附着面上涂上 1 微升聚赖氨酸两次，使其在两次涂层之间在 37 摄氏度下干燥。然后，将凝胶放在盖玻片上，使切口在左侧。
使用画笔，只需一个动作即可将凝胶转移到处理过的表面上。神经递质相关基因和神经肽基因在成年果蝇大脑中表现出不同的表达模式。VGluT 和 Gad1 在同一杂交轮中共检测到，显示出不重叠的表达模式。
AstA 在视叶中表达强烈，在中央复合体中表达较弱。Crz 在外侧部高表达，而在视叶神经元中观察到较低的表达水平。通过光片或共聚焦显微镜使用特异性分裂 GAL4 线在用 Mer-GFP 表达鉴定的 H delta D 神经元中检测到 Tk。
FMRFamide 在 Mer-GFP 标记的 PFG 神经元中不存在，但在周围神经元中检测到。FB4K 神经元的高分辨率成像证实了 VGluT 和 ChAT/VAChT 转录本的空间分布。神经肽（如 AstA 和 Crz）在某些细胞中高表达，以至于代表单个转录本的单个荧光点无法再分离。
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概述
本文介绍了扩展辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH），这是一种将扩展显微镜与荧光原位杂交相结合的新技术，用于观察厚组织中的基因表达。该方法专为果蝇中枢神经系统设计，使研究人员能够在不同细胞类型中观察多个基因的表达模式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因表达
- 细胞生物学
背景
- 扩展显微镜能够在成像厚组织时提供更好的光学清晰度和分辨率。
- 荧光原位杂交是一种检测基因表达的强大方法。
- 这些技术的结合增强了分析模式生物复杂组织结构的能力。
- 果蝇是理解神经发育和基因功能的宝贵模型。
研究目的
- 详细介绍一种促进多轮RNA原位杂交的稳健协议。
- 实现对果蝇大脑中基因表达的全面可视化。
- 提供一个可以轻松被配备基本显微镜工具的各种实验室采用的框架。
使用的方法
- 该研究利用水凝胶嵌入技术来保持果蝇大脑的组织完整性。
- 关键的生物模型包括完整的果蝇中枢神经系统，重点关注各种神经元基因表达。
- 文章中未提到多组学工作流程。
- 包括了详细的组织处理、杂交和成像协议。
- 通过使用共聚焦或光片显微镜的比较空间表达分析验证结果。
主要结果
- 在果蝇大脑中观察到神经递质相关和神经肽基因的不同表达模式。
- 示例发现包括VGluT和Gad1的非重叠表达，表明它们在神经传递中的作用是不同的。
- 像AstA和Crz这样的神经肽在特定神经区域表现出高水平的表达，与功能意义相关。
- 该方法能够精确绘制细胞层间的基因表达图，并有助于理解神经元的结构-功能关系。
结论
- EASI-FISH代表了复杂组织中基因表达可视化的重大进步。
- 该研究突出了不同成像技术的互补使用，为神经基因功能提供见解。
- 其影响延伸到增强对神经机制的理解，并在发育生物学和神经遗传学中有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed gene expression mapping in intact neural tissue is a critical capability for early discovery and target validation in neurobiology-focused drug development. The EASI-FISH protocol enables high-throughput, high-resolution detection of dozens of transcripts in the Drosophila brain, supporting robust comparative analyses and reducing reagent costs. This approach enhances predictive confidence in cell-type specific gene expression, informing mechanistic de-risking and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of gene expression patterns across neuronal and glial subtypes.
- Supports functional target validation by visualizing spatial transcript distribution at single-molecule resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing multiplexed detection in disease-relevant neural circuits.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization in neurogenetics pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening and phenotypic assays.
- Standardizes assay conditions by embedding multiple brains per gel, enabling direct comparison of experimental variables.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of gene expression for reliable compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse through robust gel formulation and iterative hybridization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression mapping with translational biomarker discovery in neural tissue models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling high-throughput, cell-type specific analyses.
- Reduces biological risk in advancing neuroactive compounds by clarifying target engagement in complex tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
EASI-FISH integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research in neurobiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping multiplexed gene expression in situ.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible tissue systems for quantitative evaluation of gene modulation.
- Analytics: Enables single-transcript resolution and spatial quantification for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by aligning gene expression data with disease-relevant neural circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed gene expression analysis across diverse neurobiological models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in gene expression workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal or light sheet microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to robust imaging infrastructure and commercially available reagents.
- Demands cross-team standardization for gel preparation and hybridization protocols.
- Adaptable to other model systems with optimization of gel and probe conditions.
- Throughput and multiplexing are limited by imaging capacity and probe design constraints.
