Name: 使用扩增辅助迭代荧光原位杂交对完整果蝇大脑中的基因表达进行多重检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习EASI-FISH技术用于果蝇大脑多重基因表达检测。该方法结合扩增显微镜与荧光原位杂交，可在完整Drosophila中枢神经系统中实现高分辨率成像，帮助研究人员精确定义细胞类型的基因表达特征。

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我们感谢 Paul Tillberg 在扩展显微镜技术动力学方面的建议，感谢 Christina Christoforou 在脑组织解剖方面的帮助，以及 Geoffrey Meissner 提供的宝贵反馈意见。我们进一步感谢 Tanya Wolff 和 Gerry Rubin，以及 Geoffrey Meissner 和 Wyatt Korff，允许我们纳入作为两项更大规模研究组成部分所获得的结果。所有工作均在珍利亚研究园区完成，并由霍华德·休斯医学研究所为多荧光原位杂交（MultiFISH）和果蝇扩展荧光原位杂交（Fly-eFISH）项目团队、Gerry Rubin 及项目技术资源团队提供资金支持。

本实验方案适用于成年（5-6日龄）雌性Drosophila melanogaster，但也可应用于任何性别或Drosophila物种。关于凝胶锚定剂配方，请参见补充表1；凝胶配方请参见补充表2；其他EASI-FISH试剂请参见补充表3。每日所需材料与试剂指南请参见补充表4。关于&#160;光片显微镜用凝胶支架，请参见&#160;补充文件1。&#160;图1A-C 示意性展示了大脑在凝胶中包埋的过程（在膨胀和探针杂交之前，步骤2.1至3.8）&#160;。图1D 为包埋后脑组织的照片，图1E 展示了用于光片显微镜的凝胶支架，图1F 描绘了一次典型实验的时间线。所用试剂和设备的商业信息列于材料表中。
1. 果蝇脑解剖与固定
<ol>
	<li>在冰冷的 S2 培养基中解剖果蝇大脑或中枢神经系统（更多解剖细节参见参考文献21）</li>
	<li>固定大脑时，将最多 20 个大脑或 10 个中枢神经系统组织加入 2 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛/PBS 中，在 4°C 下于旋转摇床上孵育过夜。 
	注意：多聚甲醛如吞咽或吸入有害，对皮肤和眼睛有刺激性，可能具有致癌性。</li>
	<li>用 2 mL 冰冷的 PBT（0.5%，参见补充表 4）冲洗样本一次（1×），然后在 4°C 下用 2 mL 冰冷的 PBT 洗涤样本 4 次，每次 15 分钟，置于旋转摇床上进行。</li>
	<li>用 2 mL 冰冷的 70% 乙醇冲洗样本一次（1×）。将大脑保存在 2 mL 70% 乙醇中，于 4°C 下可保存长达 6 个月。</li>
</ol>
2. 脑组织切片的固定及RNA与蛋白接头的添加（第1天）
注意：始终佩戴手套，并持续使用 RNase Away 擦拭设备和工作区。佩戴手套是必要的，（1）以防止 RNase 污染样品，以及（2）作为对多种具有健康危害的试剂的防护措施。
<ol>
	<li>用RNase去污染试剂擦拭未带电的载玻片以准备凝胶室。移除保护硅胶垫粘合面的不透明薄膜，将硅胶垫（最多含4个腔室）粘附到载玻片上，并使用P20移液器吸头向每个腔室表面加入1 µL多聚赖氨酸。风干后重复该步骤。 
	注意：步骤2.1可在前一天完成。</li>
	<li>将脑组织转移至0.2 mL PCR管中（每管最多4个脑组织），在150 µL PBT（0.1%）中重水化两次，每次5分钟，随后在PBS中再重水化两次，每次5分钟。</li>
	<li>为固定脑组织，向每个腔室中加入40 µL PBS，然后用精细镊子将脑组织轻轻排成一列并置于腔室中央，脑组织之间需留出一定间隙（见图1D）。每个腔室最多可固定6个脑组织或2个中枢神经系统（CNS）样本。</li>
	<li>移除PBS，并立即加入50 µL 20 mM MOPS缓冲液。室温（RT）孵育30分钟。</li>
	<li>在脑组织于MOPS缓冲液中平衡的同时，解冻Melphalan-X和Ac-X储备液，并为每个腔室准备75 µL Melphalan-X/Ac-X工作液（将Melphalan-X储备液用MOPS缓冲液1:1稀释，再以1:100比例加入Ac-X）。涡旋混匀后短暂离心收集液体；请控制配制时间，确保溶液在30分钟孵育结束时恰好准备好，不得提前。 
	警告：Melphalan-X若吞咽或吸入有害，对皮肤和眼睛具有刺激性，可能具有致癌性。</li>
	<li>完全移除MOPS缓冲液，加入50 µL Melphalan-X/Ac-X溶液。</li>
	<li>将盖玻片覆盖在腔室上方以封闭腔室，但不要使用垫圈粘合剂进行密封。将腔室放入湿盒中，避光条件下室温过夜孵育。</li>
</ol>
3. 凝胶化与蛋白酶K消化（第2天）
<ol>
	<li>小心移除盖玻片及Melphalan-X/Ac-X，将固定好的脑组织用100 µL PBT（0.1%）清洗2次，每次2分钟，再用100 µL PBS清洗1次，每次2分钟。</li>
	<li>解冻TREx-1000溶液、4HT、TEMED和APS，置于冰上保存。 
	注意：TREx-1000 在 -20 °C 下可能析出沉淀；&#160;涡旋混匀至完全溶解&#160;解冻 
	警告：这些试剂若被吞咽或吸入，可能有害或有毒，且会刺激皮肤和眼睛。</li>
	<li>按94:2:2:2的比例混合TREx-1000、4HT、TEMED和APS以配制凝胶溶液。涡旋混匀后置于冰上保存。每个腔室准备150 µL凝胶溶液。</li>
	<li>用移液枪头吸出腔室中的 PBS，并用无绒擦拭布小心吸除残留的 PBS。每个腔室立即加入 40 µL 凝胶溶液覆盖脑组织。在 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>移除凝胶溶液，加入 40 µL 新鲜凝胶溶液，在 4 °C 下继续孵育 10 分钟。 
	注意：将凝胶废液收集于微量离心管中，聚合后再丢弃。</li>
	<li>移除凝胶溶液，并从垫圈表面的粘合剂上剥离透明保护膜。加入最后45 µL新鲜凝胶溶液，轻轻将盖玻片覆盖在腔室上，避免产生气泡。按压盖玻片以密封腔室，于4 °C孵育10分钟（总计在4 °C下平衡30分钟）。</li>
	<li>在37 °C下聚合凝胶1.5小时。</li>
	<li>凝胶凝固后，将其在实验台上静置冷却几分钟。小心取下盖玻片，并用新的剃刀片移除硅胶垫圈。随后，将凝胶修整为矩形，并切去右上角以标记样品方向。</li>
	<li>用蘸有少量蛋白酶K缓冲液的细毛刷将凝胶从载玻片上取下，并逐一转移至2 mL微量离心管中。</li>
	<li>将每块凝胶与500 µL蛋白酶K缓冲液和5 µL蛋白酶K酶（1:100）于37 °C孵育过夜。</li>
</ol>
4. DNA 消化与探针杂交（第 3 天）
<ol>
	<li>在室温下用 1 mL PBS 溶液清洗凝胶（3 次），每次 10 分钟。 
	注意：更换溶液时请使用细尖移液器，以避免损伤凝胶。</li>
	<li>将凝胶在 37 °C 下用 1 mL DNase1 缓冲液孵育 30 分钟。</li>
	<li>将 50 µL DNase1 酶加入 450 µL DNase 缓冲液中，轻轻混匀，切勿涡旋。每块凝胶加入 500 µL DNase1 溶液，在 37 °C 下孵育 2 小时。然后在室温下用 1 mL PBS 溶液清洗（4 次），每次 15 分钟。 
	注意：凝胶可在 DNase 消化或清洗前后置于 5x SSC 溶液中，在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>解冻杂交（hyb）缓冲液和探针洗涤缓冲液。将凝胶置于不含探针的 500 µL 杂交缓冲液中，在 37 °C 下孵育 30 分钟。 
	警告：杂交缓冲液和探针洗涤缓冲液含有甲酰胺，可能具有致癌性。</li>
	<li>用杂交缓冲液将探针稀释至 1:100（终浓度 10 nM），每块凝胶准备 300 µL。将凝胶与含探针的杂交缓冲液在 37 °C 下孵育过夜。同时将探针洗涤缓冲液和 PBS 保持在 37 °C。</li>
</ol>
5. 探针洗涤（第4天）
<ol>
	<li>用 750 µL 探针洗涤缓冲液在 37 °C 下洗涤凝胶（3 次），每次 30 分钟。</li>
	<li>用 1 mL PBS 在 37 °C 下洗涤凝胶 30 分钟（3 次），然后每次 1 小时（3 次）。</li>
	<li>在室温下用 2 mL PBS 洗涤凝胶过夜，或在 4 °C 下过周末。</li>
</ol>
6. 荧光发夹介导的杂交链式反应（HCR）（第5天）
注意：有关 HCR 原理，请参见参考文献22。
<ol>
	<li>将凝胶在500 µL扩增（amp）缓冲液中于室温下孵育30分钟。</li>
	<li>在PCR仪中将荧光发夹探针于95°C加热90秒，然后迅速冷却至25°C并保持30分钟。</li>
	<li>针对每种探针，将匹配的发夹探针对（h1和h2）按1:50比例用扩增缓冲液稀释，每块凝胶准备300 µL，并涡旋混匀。</li>
	<li>将凝胶与发夹探针混合物在避光条件下于室温孵育3小时。</li>
	<li>用750 µL 5x SSCT溶液在室温下洗涤凝胶两次，每次15分钟；再用1 mL 0.5x SSCT溶液在室温下洗涤两次，每次30分钟。</li>
	<li>若脑组织表达GFP，则加入500 µL含&#160;5 mg/mL超纯BSA的PBT（0.1%）稀释的抗GFP-AF488抗体（1:500），于4 °C孵育过夜（或整个周末）。</li>
</ol>
7. 凝胶的固定与成像（第6天）
<ol>
	<li>抗体孵育后，用1 mL含0.1% PBT缓冲液冲洗凝胶一次，洗涤30分钟，随后用1 mL PBS缓冲液洗涤3次，每次30分钟。 
	注意：使用 PBS 洗涤将导致 2 倍扩增；若需 3 倍扩增，请使用 0.05x SSC 洗涤。</li>
	<li>洗涤时，将光片的凝胶附着表面进行包被&#160;显微镜凝胶支架用1 µL多聚赖氨酸涂覆两次，每次涂覆之间于37 °C下干燥。同样，对于共聚焦成像，涂覆共聚焦培养皿的凝胶粘附区域&#160;经多次涂布多聚赖氨酸的玻璃底培养皿</li>
	<li>在室温下，用1 mL浓度为5 µg/mL的DAPI/PBS或DAPI/0.05x SSC溶液染色30分钟；或 alternatively，在4 °C下过夜染色。</li>
	<li>将凝胶安装到凝胶支架（光片显微镜）或玻璃底培养皿（共聚焦显微镜）时，先将凝胶置于盖玻片上，并用无尘纸小心擦干边缘。确保凝胶方向正确，使组织部分最靠近物镜。使用画笔将凝胶轻柔地一次性放置于多聚赖氨酸表面。成像时，用 PBS（若膨胀至 3 倍体积，则用 0.05x SSC）浸没凝胶。 
	注意：成像后，可用湿润的画笔轻轻将凝胶从多聚赖氨酸表面取下，并转移至2 mL微量离心管中。</li>
	<li>如需立即重新探针，继续进行第7天步骤。如需长期保存（1周至6个月），将凝胶置于1 mL 5x SSC中，4 °C保存。使用前，用1 mL PBS洗涤凝胶3次，每次10分钟，然后继续后续操作。 
	注意：在所述缓冲液中，膨胀程度通常较为一致（在 PBS 中约为 2 倍，在 0.05x SSC 中约为 3 倍）。为检测膨胀倍数，可在荧光体视显微镜下拍摄脑组织膨胀前后的图像，并测量其大小。为可视化膨胀后的脑组织，可用 DAPI 短暂染色。近似膨胀倍数等于膨胀后尺寸除以膨胀前尺寸。</li>
</ol>
8. 多重检测中的探针和发夹结构剥离（第7天）
<ol>
	<li>将凝胶在 37°C 下用 1 mL DNase1 缓冲液孵育 30 分钟。</li>
	<li>将 50 µL DNase1 加入 450 µL DNase 缓冲液中，轻轻混匀，切勿涡旋。将凝胶在 500 µL DNase1 溶液中 37 °C 孵育 2 小时。</li>
	<li>在室温下用 1 mL PBS 洗涤 4 次，每次 15 分钟。凝胶现在已准备好进行下一轮杂交（第 3 天，步骤 6）。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

所述用于完整样本的EASI-FISH方案 黑腹果蝇 神经系统能够在同一脑组织或中枢神经系统中检测数十种转录本。该方法具有稳健、简便和高灵敏度的特点，可与GFP检测联合使用，以鉴定特定的神经元或胶质细胞亚群。由于该技术易于实施，有望推动相关研究的开展 果蝇 对完整果蝇大脑中基因表达进行定位与定量研究感兴趣的实验室。
EASI-FISH 相较于未结合扩增显微技术的先前 FISH 方案具有多项优势。如先前在小鼠组织中所报道，该方法在多轮 FISH 操作中均表现出优异的 RNA 稳定性17这可能是由于mRNA与凝胶基质的结合，以及组织来源的RNase被结合并发生部分降解所致。与其他已发表的方案类似5,7,25，组织在4% PFA中于4°C固定（原始方案使用2% PFA在室温下固定1小时）...

荧光原位杂交（FISH）技术最早在 40 多年前被用于在果蝇（Drosophila）的多线染色体上进行基因定位1,2。如今，单分子 FISH 已成为在完整组织中对 mRNA 转录本进行空间定位和定量的金标准3。然而，由于样本完整性问题和 RNA 丢失，果蝇（Drosophila）中的整体封片单分子 FISH 技术仅限于在同一样本中分析少数几个基因4,5,6,7。尽管近年来条形码技术的发展（例如8,9,10）使得即使在较厚的组织中也能检测到数百种转录本11,12，但建立此类实验方案需要投入大量资源，这可能成为推广应用的障碍。事实上，许多创新的空间转录组学技术从未走出其原始研发机构13。因此，开发一种简单且相对低成本的方法，用于在同一完整脑组织中检测数十个基因的表达，将有助于实现多种研究目标：验证 RNA 测序和细胞图谱数据、绘制中枢神经系统中分子定义的细胞类型分布、量化发育过程、性别或物种间基因表达的差异，或测量由果蝇（Drosophila）中丰富的遗传或环境扰动所诱导的基因表达变化。
膨胀显微技术是一种通过将组织嵌入可膨胀水凝胶中使其体积膨胀，从而实现更高分辨率观察的成像方法14。EASI-FISH 结合了膨胀显微技术和 RNA 荧光原位杂交（RNA FISH）15，其中利用杂交链式反应（HCR）——一种非酶促技术——来检测寡核苷酸探针的结合16。EASI-FISH 最初被开发为一种替代传统薄组织 FISH 的方法，用于绘制小鼠外侧下丘脑厚切片（300 µm）中数十个基因的表达图谱17。该方法特别适用于成年果蝇脑组织，因为其厚度通常小于 300 µm，且已有研究近期报道了一种果蝇 EASI-FISH 的原型实验方案18。在此方法中，解剖并固定的 Drosophila 脑组织被包埋于可膨胀水凝胶中，mRNA 和蛋白质分别通过烷化剂 Melphalan-X 和 Acryloyl-X（Ac-X）共价锚定在凝胶聚合物上。在进行蛋白消化处理后，脑组织可实现各向同性膨胀&#160;，随后进行基因特异性 DNA 寡核苷酸探针与组织内 mRNA 的杂交&#160;，以定位目标转录本&#160;。&#160;在第二步杂交中加入荧光标记的 DNA 发夹分子，多个发夹分子在 HCR 反应中聚合形成亚稳态 DNA 聚合物，从而实现对单个转录本信号的放大，这些信号可通过光片显微镜或共聚焦显微镜观察为明亮的荧光点。
mRNA 和蛋白质通过共价键锚定在凝胶基质上，并在凝胶形成后对蛋白质进行蛋白酶消化，从而构建出一个 mRNA 转录本相对稳定且可能更易于探针结合的环境。mRNA 和凝胶的稳定性使得可在多轮重复探针杂交与成像中反复使用，每轮之间通过 DNase1 酶孵育去除 DNA 探针和 HCR 产物15,17。此外，样品的扩增通过分子去拥挤效应减少了自发荧光和光散射，有效提高了成像分辨率14。因此，单个 mRNA 转录本更易于被分辨。
GFP 能够充分维持该过程，使其可通过荧光或扩增后抗体结合检测到。因此，该报告基因可用于标记和分割目标细胞类型。结合目前已有的多种神经元特异性分裂 GAL4 驱动品系（例如19,20），这为深入理解特定神经元类型的分子特征，或识别那些难以通过解剖结构区分的分子亚型提供了可能。
此处描述&#160;是原型果蝇 EASI-FISH 实验方案的更新版本18 具有优异的mRNA保留效果，消除了技术难点，并提高了凝胶的稳定性。改进措施包括增加PFA浓度、降低固定温度，以及在脑组织孵育Melphalan-X和Ac-X之前进行包埋以简化样本制备。本方案还引入了一种新的凝胶配方以增强凝胶的稳定性，从而在多次FISH实验和成像过程中有效减少凝胶损伤。这些改进使实验操作更加简便，缩短了处理时间，减少了试剂用量，并提高了结果的一致性和可靠性。重要的是，多重检测能力得到提升，可在数月内对同一脑组织中的数十个基因进行分析。文中通过展示成年小鼠脑中多个神经元基因的表达模式对此进行了说明 黑腹果蝇 在不同表达水平下对大脑进行检测。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR管&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL螺口微量离心管，琥珀色</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1405-9707</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA，pH 8，无RNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>10M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 3994</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM 9763</td><td></td></tr><tr><td>40%丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>4-羟基-TEMPO（4HT）</td><td>Sigma</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl，无RNase&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>AM97060G</td><td></td></tr><tr><td>5 mL移液管，细尖头</td><td>Global Scientific&amp;nbsp;</td><td>134070-S20</td><td></td></tr><tr><td>6孔玻璃底培养板&amp;nbsp;</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>无水乙腈&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>042311-K7</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸</td><td>TCI</td><td>A0141</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰基-X&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>扩增缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>无水DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>AstA_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR477</td><td></td></tr><tr><td>ChAT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRG115</td><td></td></tr><tr><td>Crz_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR480</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>开源软件</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>FMRFa_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR487</td><td></td></tr><tr><td>GAD1_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE581</td><td></td></tr><tr><td>GFP多克隆抗体，Alexa Fluor 488标记</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21311</td><td></td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Stitcher</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Viewer</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer</td><td></td></tr><tr><td>JF-669, SE&amp;nbsp;</td><td>Tocris</td><td>6420</td><td></td></tr><tr><td>美法仑</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16665</td><td></td></tr><tr><td>MOPs缓冲液</td><td>Fisher</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>N,N-亚甲基双丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma</td><td>T22500</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸探针&amp;nbsp;</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>Photoflo-200&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（聚赖氨酸）</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>探针洗涤缓冲液</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick核苷酸去除试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28306</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>7003，去污染试剂</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>S2培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>硅胶垫圈&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P24743</td><td></td></tr><tr><td>Tdc2_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE880</td><td></td></tr><tr><td>Tk_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR484</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermofisher</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>超纯BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>未标记及Alexa Fluor标记发夹探针</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>VAChT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTA904</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTB212</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z7凝胶支架&amp;nbsp;</td><td>Janelia&amp;nbsp;</td><td>可应要求提供CAD文件</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980共聚焦倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z7光片显微镜</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</td><td></td></tr></tbody></table>

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

理解基因表达对于解析细胞功能至关重要。然而，分析大量基因表达的方法 原位 在特定组织内的研究仍然有限。本文所述的EASI-FISH方案已改进用于在完整成年组织中检测数十个基因的表达 果蝇 使用市售试剂对中枢神经系统（CNS）进行全脑范围的基因表达成像。本方案包含一种新型凝胶配方，可增强凝胶的稳定性，支持多轮杂交反应，并允许在单个凝胶中包埋多个大脑样本。该改进显著提高了实验通量，便于对不同实验条件进行优化比较，同时降低了试剂成本。此外，通过采用GAL4-UAS系统实现绿色荧光蛋白（GFP）的共检测，可在特定神经元或胶质细胞类型中可视化基因表达。值得注意的是，结合扩展显微镜技术所达到的高分辨率与本方法的高灵敏度，能够检测到单个RNA转录本。该方法有效整合了高成像质量与高通量优势，成为研究完整果蝇大脑中基因表达的强大工具。

关键词：中枢神经系统（CNS），扩展显微镜，基因表达，RNA检测，GAL4-UAS系统，绿色荧光蛋白（GFP），果蝇大脑，高通量，单分子RNA成像

通过多轮实验检测成年Drosophila大脑中多种不同神经递质相关基因及神经肽基因的表达，展示了该改良版EASI-FISH方案的性能。通常每轮实验中，对凝胶化并扩增的大脑样本使用两到三种探针进行杂交，随后采用与Alexa Fluor（AF）488（除非存在GFP表达）、AF546、AF647或Janelia Fluor（JF）669偶联的发夹探针对进行HCR扩增。成像主要在光片显微镜上完成，获取单个z轴层扫图像或多个拼接后的图块，以覆盖整个大脑。部分单z轴层扫图像也通过共聚焦显微镜获取（详见图2和图3图注中的说明）。
图2&#160;显示神经递质相关联的示例&#160;基因VGluT，Gad1，Tdc2）和神经肽基因（AstA，Crz，Tk) 在其中表达的 果蝇 脑组织。转录本在同一次杂交过程中共同被检测到（VGluT</em...

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。

理解基因表达对于解析细胞功能至关重要。然而，原位分析大量基因表达的方法……

我们开发了一种可靠的实验方案，可在同一只果蝇大脑上进行多轮原位杂交，从而实现多种不同基因表达模式的可视化。将果蝇大脑包埋于水凝胶中，可有效维持组织完整性和 mRNA 稳定性，并在多轮杂交过程中保持良好效果。此外，该方法在成像时可显著提高光学通透性。EASI-FISH 可被任何配备共聚焦显微镜或光片显微镜的实验室采用，用于定义果蝇大脑中细胞类型的基因表达谱。首先，用RNA去污染试剂擦拭无电荷载玻片。移除保护硅胶垫粘合面的不透明薄膜。然后将含有最多四个腔室的垫圈粘附到载玻片上。使用P20移液器将一微升多聚赖氨酸涂覆于每个腔室表面。接着，将每管最多四只黑腹果蝇脑组织转移至0.2毫升PCR管中。用含有 0.1% Triton X-100 的 150 微升 PBS 重悬脑组织，随后再加入 PBS。向每个腔室中加入 40 微升 PBS。使用一对精细镊子，将脑组织轻轻排列在腔室中央，彼此之间留出一定间距。从腔室中移除 PBS，立即加入 50 微升 20 毫摩尔的 MOPS 缓冲液。在脑组织于 MOPS 缓冲液中平衡的同时，用移液器将等体积的解冻 Melphalan-X 加入另一管中，并加入等体积的 MOPS 缓冲液。然后按 1 比 100 的比例加入 Ac-X 储存液。将溶液涡旋混匀，并短暂离心收集。移除各腔室中的所有MOPS缓冲液，加入50 µL美法仑-X Ac-X溶液。将盖玻片置于每个腔室上方，不使用垫圈粘合剂进行密封。然后将孵育 chamber 置于湿盒中。次日，小心移除盖玻片，并吸除 Melphalan-X Ac-X 溶液。用 100 µL 的 0.1% PBT 缓冲液洗涤封片后的脑组织两次，随后用 100 µL 的 PBS 缓冲液洗涤。 将解冻的TREx-1000、4-羟基-TEMPO、TEMED和过硫酸铵溶液置于冰上。涡旋振荡TREx-1000溶液，确保无沉淀物。混合上述溶液以配制凝胶溶液，混匀后涡旋振荡，再置于冰上。用移液器吸头吸除腔室中的 PBS，并用无绒擦拭布吸走残留液体。立即在每个腔室的脑组织上加入 40 微升凝胶溶液。将腔室置于 4 摄氏度孵育 10 分钟。现在将凝胶溶液从电泳槽中移除。然后从垫圈表面的粘性保护膜上撕下透明保护膜。加入最后45微升新鲜凝胶溶液。轻轻将盖玻片盖在腔室上，按压盖玻片以密封腔室，然后在4°C下继续孵育10分钟。将腔室置于37°C孵育1.5小时，使凝胶聚合。在实验台面上冷却凝胶后，使用刀片小心移除盖玻片和硅胶垫圈。将凝胶修剪成矩形，并切去右上角以指示样品方向。接着，用少量蛋白酶K缓冲液润湿的细毛刷小心地将凝胶从载玻片上取下。将每块凝胶单独转移至一个2毫升微量离心管中。将500微升Pro K缓冲液与5微升蛋白酶K酶混合，将混合液加入每块凝胶中。37摄氏度孵育过夜。次日，用细软的移液管吸除缓冲液，然后用PBS洗涤凝胶三次，每次10分钟。将凝胶在 37 摄氏度下，用 1 毫升 DNASE1 缓冲液孵育 30 分钟。将 50 微升 DNASE1 酶与 450 微升 DNASE1 缓冲液混合。轻轻混匀，避免涡旋振荡。将每块凝胶在 500 微升 DNASE1 溶液中于 37 摄氏度孵育 2 小时。然后，在室温下用 1 毫升 PBS 洗涤凝胶 4 次，每次 15 分钟。接着，将凝胶在 500 微升不含探针的解冻杂交缓冲液中于 37 摄氏度孵育 30 分钟。将探针按1:100的比例用杂交缓冲液稀释，每块凝胶准备300微升。将凝胶与含有探针的杂交缓冲液在37摄氏度下孵育过夜。次日，先用探针洗涤缓冲液洗涤凝胶，再用PBS洗涤。对于杂交链式反应，向凝胶中加入500微升扩增缓冲液，在室温下孵育30分钟。在PCR仪中将荧光发夹探针于95摄氏度加热90秒，然后将溶液冷却至25摄氏度并维持30分钟。针对每种探针，将匹配的发夹探针成对以1:50的比例用扩增缓冲液稀释，每块凝胶准备300微升。涡旋混合后，将混合物加入凝胶中并进行孵育。为进行光片成像而安装凝胶时，先在凝胶支架的凝胶附着面上涂布1微升多聚赖氨酸，共涂两次，每次涂布后在37摄氏度下干燥。然后将凝胶放置在盖玻片上，使切口位于左侧。使用画笔将凝胶一次性转移至处理过的表面。与神经递质相关的基因和神经肽基因在成年黑腹果蝇大脑中表现出不同的表达模式。VGluT 和 Gad1 在同一轮杂交中被共检测到，显示出不重叠的表达模式。AstA 在视叶中呈现强表达，在中央复合体中表达较弱。Crz 在侧部区高度表达，而在视叶神经元中观察到较低水平的表达。通过特定的分裂GAL4品系结合光片显微镜或共聚焦显微镜观察Mer-GFP表达，可在H delta D神经元中检测到Tk的存在。在由 Mer-GFP 标记的 PFG 神经元中未检测到 FMRFamide，但在周围神经元中可检测到。对 FB4K 神经元的高分辨率成像证实了 VGluT 和 ChAT/VAChT 转录本的空间分布。某些细胞中神经肽（如 AstA 和 Crz）的表达水平极高，以至于代表单个转录本的荧光点无法被分辨开来。

multiplex-detection-gene-expression-intact-drosophila-brain-using

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用扩增辅助迭代荧光原位杂交对完整果蝇大脑中的基因表达进行多重检测

本方案涉及一种非放射性方法 原位...

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

本视频展示了对转基因果蝇大脑进行免疫荧光染色，以实现胶质细胞的单细胞成像。该果蝇大脑在胶质细胞特异性重组酶系统的调控下，表达与不同抗原表位组合融合的膜靶向蛋白。分离并固定的脑组织经针对这些抗原表位的一抗孵育后，再使用荧光染料偶联的二抗进行染色。该标记方法可实现对不同脑区中多种胶质细胞亚群的同时成像。...

果蝇大脑的免疫荧光染色用于胶质细胞的单细胞成像

来源：Jolly, S.，等．在小鼠脑切片中联合使用双重荧光原位杂交与免疫标记检测三个基因的表达．J. Vis. Exp.

在小鼠脑切片中进行双重荧光原位杂交以检测基因表达

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇...

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

由于缺乏特异性抗体，将基因表达定位到特定细胞类型可能具有挑战性。本文中，我们描述了一种通过结合双重荧光RNA原位杂交与免疫染色技术，实现基因表达同时三重检测的实验方案。...

双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

细胞表现出不同的形态，并与其邻近细胞建立多种相互作用。本方案描述了如何利用成熟的Gal4/UAS表达系统揭示单个细胞的形态，并研究细胞间的相互作用。...

多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

演示用于记录新生啮齿类动物脊髓电生理信号的细胞外吸吮电极的制备与使用方法...

脊髓电生理学 II：细胞外吸吮电极的制备

本文介绍了一种利用反义吗啉环寡核苷酸在成年斑马鱼端脑室管膜细胞中调控基因表达的方法。我们提出该方法是一种高效且快速的实验方案，可用于成年脊椎动物脑部的功能研究。...

利用吗啉代寡核苷酸脑室微量注射技术对成年斑马鱼大脑进行基因表达的微操作

学习EASI-FISH技术用于果蝇大脑多重基因表达检测。该方法结合扩增显微镜与荧光原位杂交，可在完整Drosophila中枢神经系统中实现高分辨率成像，帮助研究人员精确定义细胞类型的基因表达特征。

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