Name: 反映天然肠道生理特性的二维猪肠道类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解利用猪肠道类器官构建二维单层模型的方法，通过跨上皮电阻和Ussing室实验评估转运特性。该模型为研究胃肠道生理提供了可靠的体外替代方案。

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感谢德国联邦食品和农业部（BLE# 28N-2-071-00）提供的资金支持。

本方案中，两只健康的猪（本特海姆黑白花猪；1 只雄性，1 只雌性；4.5 月龄；体重约 65 kg）通过击晕枪击毙并放血处死。根据动物保护法，此类操作（屠宰及组织摘取）不被归类为动物实验，但需向汉诺威兽医大学基金会的动物福利官员报备（注册编号：TiHo-T-2023-15）。
1. 插件的包被
注意：所有步骤均需在安全柜内使用无菌材料进行。除非另有说明，本方案的所有步骤均需在冰上操作。
<ol>
	<li>将冻存的基底膜置于冰上，在室温下解冻至少1小时，或在4 °C的冰上过夜解冻。在锥形管中，将基底膜与预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）按1:40（v/v）的比例混合。</li>
	<li>从包装中取出带有插件的无菌培养板。向每个插件的顶端室中加入200 µL基底膜混合液。</li>
	<li>盖上培养板盖，于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育至少1.5小时。</li>
	<li>接种细胞前小心吸除溶液。吸液时确保吸头不接触膜表面。</li>
</ol>
2. 二维类器官单层的生成
注意：猪结肠类器官的生成和培养方法与猪空肠类器官所述方法相同25。在生成三维类器官后，应进行至少3-4周的培养，并每周传代一次，以确保稳定生长。每个含有三维类器官的半球形结构中的细胞数量足以覆盖一个单独的跨膜滤膜。在生成单层细胞前，需对三维类器官进行光学质量检查，以评估前期生长情况及是否存在污染（图1）。
<img alt="冷冻保存中的细胞形态；显微镜图像比较结构完整性，比例尺 100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：代表性三维类器官。 在构建单层细胞前，需在显微镜下仔细检查三维（A）空肠和（B）结肠类器官。重点评估其既往生长模式、结构完整性以及是否存在杂质或污染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>从含有3D隐窝类器官的孔中移除类器官培养基（表1）。每孔加入1 mL冰上预冷的PBS，使用p1000枪头轻轻吹打，使基底膜溶解。</li>
	<li>将所有溶解后的类器官收集至一个预先加入10 mL冰上预冷PBS的15 mL离心管中。在4 °C条件下，以250 × g离心10分钟，吸除上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL预热（37 °C）的0.05 %（v/v）胰蛋白酶/EDTA溶液中（此步骤可合并两个管的样品）。在37 °C水浴中孵育5分钟，随后立即置于冰上以终止反应。</li>
	<li>在冰上使用p1000枪头吹打20次，再联合使用p1000和p200枪头吹打15次。加入10 mL冰上预冷的DMEM培养基，其中添加10%（v/v）胎牛血清（FCS）。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL单层培养基中（表1）。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用血球计数板（Neubauer计数室）测定每毫升活细胞数量。</li>
	<li>此时从顶端室中移除包被溶液，并替换为500 µL预热（37 °C）的单层培养基。向基底外侧室加入3 mL单层培养基。</li>
	<li>按照步骤3中的详细说明，测定每个空Transwell小室的空白电阻（TEER）。应尽可能缩短顶端室无培养基的时间，以防止细胞干燥。</li>
	<li>移除顶端的单层培养基，并在每个Transwell的顶端室中加入500 µL单层培养基，接种空肠2D培养所需的2 × 105个上皮细胞，或结肠2D培养所需的1.5 × 105个上皮细胞。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基并测量TEER。每次更换培养基前进行TEER测量。小心吸除顶端和基底室的培养基，分别替换为500 µL或3 mL新鲜的、预热（37 °C）的培养基。
	<ol>
		<li>对于空肠类器官：接种后第16天，将单层培养基更换为分化培养基（表1）。对于结肠类器官：接种后第7天更换为分化培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天更换分化培养基，并在每次换液时进行TEER测量。在接种后第18天（空肠类器官）或第9天（结肠类器官），开始进行功能性实验。</li>
</ol>
3. 跨上皮电阻（TEER）的测量
注意：所有测量均在安全柜内进行，以避免污染。在接种细胞之前，需对每个未接种细胞的包被Transwell小室进行测量，以获得各自的空白值。电压-电阻计将数值存储在插入的USB设备中。
<ol>
	<li>用70% (v/v) 乙醇清洁筷子电极，并让电极完全干燥。同时，将培养板从培养箱中取出并置于超净台内。</li>
	<li>将筷子电极的短臂插入小室的顶端腔室，长臂插入小室的基底外侧腔室。避免短臂接触细胞层。</li>
	<li>测量每个Transwell的跨上皮电阻值。等待电压-欧姆表达到平衡，以确保读数稳定。通过点击“存储”按钮记录TEER值。</li>
	<li>对剩余的孔继续执行步骤3.2和3.3。完成最后一个孔的测量后，电压-欧姆表将提示将数据保存至USB设备。点击保存。</li>
	<li>每次测量完一块板后以及测量结束后，均需清洁电极，并在存放前使其完全干燥。</li>
	<li>从测得的细胞值中减去接种细胞前测定的空白值。</li>
</ol>
4. 使用Ussing腔室技术进行电生理转运研究
注意：电生理转运研究的测定采用尤斯室（Ussing chamber）进行，该装置包含两个由上皮组织分隔的腔室。该腔室通过银/氯化银（Ag/AgCl）电极与电压钳系统相连。该技术可通过电压钳诱导的短路电流（Isc）变化以及根据欧姆定律计算得到的组织电阻（Rt），来追踪上皮组织的主动生电转运过程。在整个实验过程中，每6秒记录一次Isc和Rt。实验期间，所研究的组织用碳氧混合气（carbogen）进行通气，并孵育于改良的克雷布斯-亨塞莱特（Krebs-Henseleit）溶液中，以维持组织活性。在缓冲液中添加吲哚美辛（10 µM）以抑制前列腺素的合成26。
<ol>
	<li>将黏膜和浆膜缓冲液预热至 37 °C，并用碳氧混合气（carbogen）进行充气。使用空白插入物组装单个腔室，确保每个Transwell的顶侧（apical side）均朝向同一方向。</li>
	<li>向所有腔室中加入 5 mL 预热的黏膜缓冲液（表 2）。根据制造商说明，将电压钳的电极连接至各个腔室。确保电极周围无气泡干扰，以保证测量准确。</li>
	<li>在电压钳软件中点击 Rf/dpI 按钮，使用上述条件校准Ussing腔室软件。所有使用的空白插入物的电阻应相等（约 70 欧姆），电流应接近 0 mV（± 5 mV）。若某些腔室不符合该标准，请检查电极位置或系统中是否存在气泡。</li>
	<li>移除所有电极并弃去已使用的缓冲液。打开各个腔室，取出空白插入物。注意保持各腔室的顺序不变。</li>
	<li>将含有插入物的培养板从培养箱转移至生物安全柜中。小心吸除基底外侧和顶侧的培养基。</li>
	<li>向顶侧腔室加入 500 µL 温热（37 °C）的黏膜缓冲液，向基底外侧腔室加入 3 mL 浆膜缓冲液进行细胞清洗。吸除缓冲液后重复洗涤 2 次。</li>
	<li>从培养板中取出插入物，轻轻移除插入物的支撑结构。将插入物放入Ussing腔室中，确保其方向与校准阶段一致。按照 图 2 所示方式组装各个腔室。</li>
	<li>向面向细胞基底外侧的腔室加入 5 mL 浆膜缓冲液（表 2），向面向顶侧的腔室加入 5 mL 黏膜缓冲液。</li>
	<li>将电极和通气管连接至各个腔室。在Ussing软件中开始测量，平衡 15 分钟。</li>
	<li>将条件由开路状态切换为短路状态，平衡 5 至 10 分钟。向浆膜侧腔室中加入 10 µM 福斯科林（forskolin）。 
	注意：根据不同的肠段及研究问题，福斯科林的添加可替换为其他试剂或物质。</li>
	<li>15 分钟后，可按照与福斯科林相同的方式添加其他试剂，或停止测量。从各个腔室中移除通气管和电极，将两腔室中的缓冲液倒入废液容器中。</li>
	<li>拆卸腔室，插入物可弃去或用于后续分析（如免疫组织化学或表达分析）。</li>
</ol>
<img alt="电压钳实验示意图；二维单层膜；μA/mV 测量；黏膜/浆膜侧装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：Ussing 室的示意图结构。 图示为被生长有二维单层膜的膜分隔的两个腔室。两个腔室均用碳氧混合气体（carbogen）进行通气；每个腔室通过两个电极监测电压和电流。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. Ussing室装置生成数据的分析
<ol>
	<li>将电压钳软件生成的数据导入合适的电子表格编辑器中。</li>
	<li>为确定基础短路电流（Isc）和跨上皮电阻（Rt）值，计算初始化短路条件后10分钟时连续10个数据点的平均值。每个独立的腔室作为技术重复，而每个类器官传代作为生物学重复。</li>
	<li>为评估施加试剂的作用，计算试剂添加前立即记录的连续10个数据点的平均值。将该平均值与试剂施加后观察到的最大值（或最小值）进行比较。所得数据以均值 ± 标准差（SD）表示。</li>
</ol>

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</ol>

我们声明不存在任何利益冲突。

本方案描述了一种将已建立的猪源三维类器官消化为单细胞，并将其接种到Transwell膜上以形成完整单层的方法。该构型可暴露细胞的顶膜侧，便于利用Ussing室监测吸收和分泌过程。
在这一多步过程中，初始且关键的步骤是精确地解离三维类器官。实现单细胞的均匀接种对于功能性单层细胞的形成至关重要27。因此，必须仔细监测解离过程。应根据实际情况调整胰蛋白酶/EDTA溶液的孵育时间——若观察到细胞团块，则应延长孵育时间；若在细胞计数过程中发现细胞死亡过多，则应缩短孵育时间。需要注意的是，类器官大小的差异（可能源于操作者操作方式的不同）会影响解离过程，应予以充分考虑。
TEER 值逐渐升高，在结肠类器官中于第 9 天达到平台期，而在空肠类器官中则于第 18 天达到平台期，这表明形成了完整的单层细胞28，这一点已在成熟的肠道人类细胞培养系统29,<sup class="xref...

胃肠道（GIT）在消化、营养吸收以及通过粪便排泄废物方面起着核心作用1。此外，胃肠道还作为抵御病原体的屏障，这一功能依赖于其复杂的细胞组成，包括干细胞、分泌黏液的杯状细胞、肠内分泌细胞和吸收性肠上皮细胞2。肠道稳态可能受到多种因素的干扰，例如细菌感染3或炎症过程4，从而对机体造成严重后果，如营养吸收障碍、腹泻甚至死亡5。研究此类病理生理状况通常采用实验动物模型，或根据“3R原则”6使用来自不同物种的细胞培养系统。在使用物种特异性模型时，结果的准确预测性和可转化性至关重要7。尽管存在这一需求，目前仍明显缺乏能够充分模拟肠道复杂结构与功能的猪源性细胞培养模型。
为应对这一挑战（该挑战同样存在于其他物种中），研究人员已开发出三维（3D）类器官，以期模拟胃肠道（GIT）的生理复杂性8。最初，类器官由人和小鼠的肠道组织构建而成；迄今为止，来自幼龄和成年猪的猪类器官也已成功建立并实现培养9,10。自问世以来，这些猪类器官已被应用于多项研究，主要集中在肠道感染方面11,12,13,14。然而，针对其生理特性（如营养物质转运或分泌过程）的表征研究仍较为有限15。这可能与肠道类器官的结构取向有关：其顶膜朝向内侧，而基底外侧朝向外侧，导致顶膜难以接触。该局限性已通过将猪类器官以二维形式成功培养而得到解决16，并且该方法进一步通过使用冷冻组织作为起始材料而得到优化和推进17。
猪源类器官的二维培养可使上皮细胞层的两侧均暴露可及，从而能够应用已建立的方法来研究跨上皮层的转运过程。其中一种方法便是尤斯 chamber18，可实时观察上皮细胞跨膜的生电性吸收和分泌过程。该系统的广泛应用已使人们对猪肠道功能有了全面深入的理解 体内，涵盖整个肠轴。这包括对单糖转运、短链脂肪酸转运或对白藜芦醇等植物次生代谢产物的反应研究，这些物质会影响肠道转运特性19,20,21,22,23,24这些研究产生的大量数据有助于在特征明确的 体内 条件和 体外 猪类器官的微环境，加深了我们对其生理相关性的理解。
本研究中，我们介绍了一种从三维猪源类器官生成并培养二维单层细胞的方案。此外，我们详细阐述了利用尤斯室（Ussing chamber）技术定量分析肠道转运过程的方法学步骤。该方案为研究吸收和分泌特性提供了有效工具。 体外 在空肠和结肠类器官中，可实现与已有明确特征的样本进行直接比较 体内 条件。该方案未来的应用可能包括研究药理学或毒理学物质的影响，以及探索上皮细胞与病原体之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>SARSTEDT AG &amp; Co. KG</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10432</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>accujet S</td><td>Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany</td><td>26351</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>12634010</td><td>储存于4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>17504044</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2.&lt;/sub&gt;2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>C3306</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖（无水）</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.08337</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-13027</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>M4125</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>154938</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>电极组（AgCl/PtIr/标准）</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>#1316</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburg, Gemany</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburg, Gemany</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>EVOM3手动上皮细胞伏特-欧姆计</td><td>World precision instruments, Sarasota, USA</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>F7524</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>福斯科林（Forskolin）</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>F6886</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>gasprofi 1 SCS micro</td><td>WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany</td><td>60,04,000</td><td></td></tr><tr><td>胃泌素1（Gastrin 1）</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-P1097</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>35050061</td><td>储存于4 &amp;deg;C。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>1090571000</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>H0887</td><td>储存于4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Herasafe 2025 II级生物安全柜</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>51033316</td><td></td></tr><tr><td>ICO105培养箱</td><td>Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany</td><td>62,20,143</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛（Indomethacin）</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>I7378</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.04936</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（L-Glutamin）</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>G7513</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>LWRN上清液</td><td>自制&amp;nbsp;</td><td></td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需在冰上小心解冻。LWRN添加剂根据Miyoshi等（2012）方法制备</td></tr><tr><td>Matrigel基底膜基质，无LDEV，10 mL</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>354234</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需在冰上小心解冻</td></tr><tr><td>Megafuge 1.OR</td><td>Heraeus Instruments, Osterode, Germany</td><td>75003060</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2.&lt;/sub&gt;6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.05833</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4.&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.06580</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine）</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>A7250</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.06404</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4.H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.06346</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.06329</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>改进型Neubauer计数板</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rh&amp;ouml;n, Germany</td><td>40442712</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70倒置显微镜</td><td>Olympus Corporation, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>15140122</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>多粘菌素B（PolymyxinB）</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>P4932-1MU</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>Primovert显微镜支架，带双目摄影管</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠表皮生长因子（rm EGF）</td><td>Prepotech, New Jersey, USA</td><td>315-09</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10295</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr><tr><td>Snapwell 3801</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Ussing基础系统</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>#1317</td><td></td></tr><tr><td>Ussing扩散室</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>SKU 1307</td><td></td></tr><tr><td>电压/电流钳制系统VCC6</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>SKU 1310</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10583</td><td>储存于-20 &amp;deg;C。按需解冻</td></tr></tbody></table>

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids Reflecting the Physiological Properties of Native Gut

胃肠道（GIT）不仅参与食物的消化和营养物质的吸收，还起到抵御病原体的保护屏障作用。传统上，该领域的研究依赖于动物实验，但目前对遵循“3R原则”（替代、减少、优化）的替代方法的需求日益增加。猪源类器官作为一种极具前景的工具应运而生，可提供更为准确的 体外 复制 体内 相较于传统细胞模型，肠道类器官具有更多生理相关条件。肠道类器官的一个主要挑战在于其顶膜朝内、基底侧膜朝外的结构方向。这一局限性可通过在transwell小室（以下简称“小室”）上构建二维（2D）类器官单层来克服，从而实现对两层膜表面的可及性。在本研究中，我们成功建立了猪空肠和结肠类器官的二维培养体系。该培养过程包含两个关键阶段：首先形成细胞单层，随后使用定制培养基诱导细胞分化。通过测量跨上皮电阻来监测细胞生长情况，结肠类器官在第8天、空肠类器官在第16天电阻趋于稳定。经过2天的分化阶段后，上皮层即可用于分析。为定量并追踪如氯离子分泌等主动电活性转运过程，我们采用Ussing室技术。该方法可实现实时测量，并对上皮转运过程进行详细表征。这一创新性 体外 模型结合Ussing chamber等既定技术，为在3R框架内对猪胃肠道进行生理学表征提供了强有力的平台，同时也为研究病理生理机制及开发潜在治疗策略开辟了新的途径。

本方案通过解离猪空肠和结肠来源的三维类器官，可靠地生成猪源二维单层细胞。空肠类器官培养16天，结肠类器官培养9天后，可形成完整的单层细胞。这些单层细胞随后可用于通过尤斯 chamber 技术评估其生电性及生理转运特性。
将三维类器官解离后，将单个细胞接种到包被的插入式培养小室中。每次更换培养基时，通过测量跨上皮电阻（TEER）值来监测细胞生长情况。该方法可同时追踪细胞增殖以及完整单层的形成，这对于构建功能性上皮层至关重要。初始时，TEER值接近基线水平，随着培养时间的延长逐渐升高，空肠类器官在培养18天后达到约150 Ω·cm2的平台期（图3A），而结肠类器官在培养9天后达到约200 Ω·cm2（图3B）。
<img alt="显示培养时间与上皮细胞电阻随天数变化的TEER分析图"...

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。

胃肠道（GIT）不仅在食物消化和营养吸收中发挥作用，还作为抵御病原体的保护屏障。

我们的目标是开发并表征一种基于类器官的模型，以模拟胃肠道，并将其与活体猪进行比较，重点关注其转运特性。这标志着我们胃肠道生理学领域从传统的动物实验向类器官模型的转变。基于类器官的体外模型，可模拟体内环境。我们将小肠和大肠类器官模型相结合，可用于实时研究其转运特性，从而实现该模型与活体猪生理状况的比较。在畜牧业相关研究领域，替代经典动物实验的模型尤为罕见。我们通过使用基于类器官的猪肠道模型克服了这一局限。我们计划利用该基于类器官的肠道模型，研究猪致病菌的影响。目的是了解这些细菌的致病机制。首先，在锥形管中将新解冻的基底膜以1:40的比例与冰上预冷的无菌PBS混合。将200 µL该混合液加入无菌板中每个小室的顶端腔室。盖上孔板盖，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少1.5小时。孵育结束后，小心吸除溶液，避免接触膜表面。移除含有三维隐窝类器官的孔中的类器官培养基。为了溶解基底膜，向孔中加入一毫升冰冷的 PBS，使用 P1000 枪头反复吹打。将所有溶解的类器官收集到预先加入 10 毫升冰冷 PBS 的 15 毫升离心管中。在 4 摄氏度下以 250 ×g 离心 10 分钟。吸去上清液后，将沉淀物重悬于1毫升预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中。将离心管置于37摄氏度水浴中孵育5分钟，随后置于冰上以终止反应。使用P1000枪头，上下吹打20次，充分重悬类器官，然后换用连接了P200枪头的P1000枪头，再重复吹打15次。现在，加入10毫升预冷的DMEM，其中添加10%胎牛血清（FCS）。在4°C条件下，以1000 ×g离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于1毫升单层培养基中。使用血细胞计数板，按照制造商的说明测定每毫升中活细胞的数量。现在，将顶端室中的包被液更换为500微升、预热至37摄氏度的单层培养基，并向基底侧室加入3毫升单层培养基。移除顶端的单层培养基。对于二维培养，向每个Transwell的顶端室中加入含有适量细胞的500微升单层培养基，并将细胞进行培养。对于跨上皮电阻（TEER）测量，先用70%乙醇清洁双电极探头，并使其完全干燥。将双电极探头的短臂插入插入物的顶端室，长臂插入基底侧室。接下来，打开并启动仪器，待读数稳定后进行测量，然后点击存储按钮以记录 TEAR 值。测量完最后一个孔后，单击保存，将数据存储到 USB 设备中。每次测量完一块培养板后以及测量结束后，均需清洁电极。电极在储存前应彻底干燥。从测得的细胞值中减去接种细胞前测定的空白TEAR值。每两到三天更换一次培养基，并在更换培养基前测定TEAR。小心地向顶端和基底区室分别加入500微升或3毫升新鲜的、预热的分化培养基。在空肠类器官接种后第18天，或结肠类器官接种后第9天，开始进行功能实验。将黏膜缓冲液和浆膜缓冲液加热至 37 摄氏度，并用碳氧混合气（carbogen）进行通气。使用空白插入物组装单个腔室，确保每个 transwell 的顶端朝向一致。向所有腔室中加入 5 毫升预热的黏膜缓冲液。根据制造商的说明，将电压钳的所有电极连接到各个腔室。为校准Ussing腔室软件，请点击电压钳软件中的RFDPI按钮。确认所有空插件的电阻约为70欧姆，电流接近零毫伏。移除所有电极并丢弃已使用的缓冲液。打开各个腔室，取出空的插入式培养小室，并保持腔室的顺序不变。现在，在生物安全柜中，小心地从培养板中吸除基底外侧和顶侧的培养基。在顶端室中用 500 微升温热的黏膜缓冲液洗涤细胞，在基底外侧室中用 3 毫升浆膜缓冲液洗涤。从培养板中取出小室并轻轻移除其支撑物。将小室放入尤斯室装置中，确保其方向与校准阶段一致。组装好各个腔室后，向面向细胞基底外侧的腔室中加入5 mL浆膜侧缓冲液，向面向细胞顶侧的腔室中加入5 mL黏膜侧缓冲液。将电极和通气管连接至每个独立腔室，并在Ussing软件中开始测量。在软件中将条件从开路状态切换至短路模式。平衡5到10分钟后，向浆膜侧室中加入10微摩尔的佛司可林。15分钟后停止测量，从室中移除通气管和电极，并拆卸 chambers。在培养过程中，跨上皮电阻值逐渐升高，在培养18天后空肠达到峰值，为150欧姆·平方厘米，结肠类器官在培养9天后达到200欧姆·平方厘米。空肠类器官的基础短路电流值显著低于结肠类器官，而基础电阻值在两者之间无显著差异。佛司可林处理使空肠类器官的基础短路电流值从 0.86 显著增加至 27.78 微安/平方厘米，结肠类器官则从 3.83 增加至 28.78 微安/平方厘米。

two-dimensional-porcine-intestinal-organoids-reflecting-physiological

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

反映天然肠道生理特性的二维猪肠道类器官

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。...

体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。...

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

将犬类肠道类器官与“肠芯片”微流控系统相结合，为人类肠道疾病提供了具有相关性的转化研究模型。所介绍的方案支持三维形态发生和动态培养 体外 肠道建模，助力犬类和人类肠道疾病的治疗开发，推动同一健康（One...

利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

类肠体作为一种新型模型，正在被用于研究组织生理学与病理生理学、药物开发以及再生医学。本文中，我们描述了一种牛源原代细胞二维类肠体衍生培养系统，该系统允许与相关组织细胞类型进行共培养。该模型为胃肠道研究的建模提供了转化应用优势。...

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

本研究介绍了一种从类器官生成牛肠道二维单层细胞的实验方案，为研究宿主与病原体相互作用提供了更便捷的途径。方案包括评估膜完整性和功能性的方法，推动了 体外...

利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

本视频展示了从白蚁后肠中栖居的微生物物种提取DNA的技术。同时演示了湿封片的制备方法，该方法有助于观察肠道微生物群落，并带领观众了解这一物种丰富的肠道环境。...

从木白蚁（Zootermopsis angusticollis）肠道微生物中提取DNA并观察肠道微生物

了解利用猪肠道类器官构建二维单层模型的方法，通过跨上皮电阻和Ussing室实验评估转运特性。该模型为研究胃肠道生理提供了可靠的体外替代方案。

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

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