Name: 液体输送到小鼠肺的改进方法：使用消费类耳镜插管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 了解使用消费类耳镜对小鼠进行插管以输送液体的方法。该技术可减少组织损伤，实现可视化操作，并确保药物稳定递送至肺部，提高实验重复性。

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Abagail Boyd（南阿拉巴马大学）根据她的经验，为调整我们的插管方案提供了关键指导。Larkin Kolls 使作者接触到家用耳镜技术。Penn Vector-Core 提供了实验中使用的病毒载体。Candice Fisher 是我们的实验室管理员；她对我们所开展的工作至关重要。Madison Robin 在整个实验过程中维持了动物房的正常运行、无菌环境和有序管理。

在开展实验前，必须由机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查并批准这些操作规程，列入方案，并咨询兽医人员。我们机构的 IACUC 在实验开始前已批准该方案，并在提交前审查了视频内容。通过杜兰大学比较医学系提供的支持与培训，确保了所有实验动物得到最高标准的护理。
1. 设置
注意：实验装置参见图2。
<img alt="实验室移液工作站设置；用于生化实验准备的移液器、试管和试管架。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67676/67676fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于引导插管的操作台准备如图所示。 从左至右：用于给药的移液器、用于确认气管插管位置是否正确的气泡管、镊子、刮勺、小儿鼻镜（文中提及但本操作无需使用）、辅助固定手具、放大照明灯、带鼻罩的小鼠固定架、光纤探头、麻醉诱导舱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/67676fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>用异丙醇消毒垫清洁插管包中提供的安全楔形块。将清洁后的安全楔形块（视频中为绿色）滑入20 G柔性导管，并安全丢弃配套的针头。 
	注意：啮齿类动物插管套件（材料表使用的器械包括气管插管安全楔。这些是微小的圆锥形套筒，可套在20 G × 1英寸的柔性导管上，用于防止导管损伤隆嵴。</li>
	<li>准备其他所需工具，包括手机、商用耳镜、带鼻罩的鼠用站台、细齿弯镊、已准备好的气管插管（见步骤 1.1）以及光纤光源（若使用）。使用前，用异丙醇清洁垫对所有工具进行清洁。</li>
	<li>取约20 cm长的软管，将其弯成U形，在一端安装鲁尔锁接头，并用扎带固定。加入200-300 µL 无菌过滤水或印度墨水加入试管中。此后，该装置称为“气泡管”。</li>
	<li>用约13厘米长的0号编织丝线缝合线打成环形结，制成缝合环。将此环置于支架顶部，确保缝合线两端固定牢固，且支架清洁。将小鼠支架放置在金属放大照明灯底座上。在小鼠口腔所在位置周围放置辅助固定手具。 
	注意：许多供应商生产可互换的支架（参见 材料表），且可在实验室中以低成本自行制备4,7,14使用0号编织丝线缝合线悬挂动物。然而，已有文献描述使用其他材料达到相同目的。4,13.</li>
	<li>将一只小鼠放入麻醉诱导室。使用恒定流速的O2 以0.8 L/min的流速和2%异氟烷进行麻醉。充分麻醉动物（参见注释），确保其在放置鼻罩期间不会苏醒。切勿显著抑制小鼠的呼吸频率。规律的呼吸有助于观察声带。 
	注意：小鼠的呼吸频率应保持正常。此标准用于判断麻醉深度是否合适。呼吸频率因个体差异可能有所不同，且可能超过每分钟200次。因此，无需实际计数呼吸次数或使用足趾夹捏测试。 
	注意：必要时可中止此操作。然而，动物在诱导室内的停留时间不应超过绝对必要的时间。</li>
	<li>将耳镜连接至手机，并确保视频信号稳定。 
	注意：为尽量减少研究人员在此操作过程中接触异氟烷，请在进行多次插管或该方法培训时使用化学防护口罩。或者，可在通风橱内进行此操作。</li>
</ol>
2. 动物分期
<ol>
	<li>一旦第一只动物进入睡眠状态，立即将其从诱导室中取出，抓住其颈背部皮肤，将其上齿置于缝合线的一段上。在将小鼠放回支架的同时，轻轻施加拉力以保持缝合线的位置。 
	注意：通常情况下，包括诱导在内，动物麻醉总时长约2分钟。这显著降低了动物的风险，无需使用眼科润滑剂，并可防止唾液积聚。应尽量缩短动物镇静的时间。</li>
	<li>轻微向后调整颈部角度（使颈部处于轻度伸展状态，5°–15°）。轻轻地将鼻罩推至鼻孔处。切勿用力下压鼻罩，以免干扰缝合线，影响小鼠的悬挂状态。</li>
	<li>使用较大的细齿弯头镊子，尽可能靠近下唇处牢固夹住舌头，并将其向下并向一侧下齿方向拉开。 
	警告：长时间牵拉、过度施加张力或压伤舌头可能损害动物健康。请密切观察舌头是否有创伤迹象（如瘀伤、出血、肿胀或干燥），一旦发现，应立即终止操作并通知兽医人员。</li>
	<li>若使用辅助固定装置，请将镊子保持在此位置。根据研究人员的经验和视力情况，使用带光源的放大镜可能有助于准确调整动物体位。</li>
	<li>若使用光纤光源，请在气管插管安全楔（视频中为绿色）就位的情况下，将光纤通过柔性导管导入。 
	注意：切勿将光纤电缆过紧地固定在光源上。用力过猛会导致在保留气管导管的同时难以取出光源。</li>
</ol>
3. 声带的可视化观察与插管
<ol>
	<li>用非优势手持握耳镜，轻轻按压在舌头上。然后调整摄像头及其光源的角度，以观察舌根附近的声带。 
	注意：解剖结构和组织颜色的微小差异可能导致定位困难。可通过观察呼吸运动来确认结构的识别。</li>
	<li>若使用光纤光源，打开光源后将套管沿耳镜顶部送入，轻轻接触舌根部或耳镜的唇状边缘作为定位参考。随后将其推进至小鼠口腔内，位于软腭与耳镜唇状边缘之间。 
	注意：如果未使用光纤光源，可在本阶段将步骤4中所述的“气泡管”连接至导管。此操作步骤的修改需要对小鼠口腔提供明亮且集中的照明。</li>
	<li>调整进管角度，使导管接近水平。插入导管至声门后约1 mm内后，立即上抬导管尖端，使其几乎与台面平行。此举可防止会厌将导管推向背侧进入食管。尤其在培训过程中、操作困难时或初学者经验不足时，利用视频反馈将气管导管准确置于声门之间具有重要价值。 
	注意：在完成此操作过程中，唾液分泌不会妨碍声带的观察。然而，既往文献报道，在对大鼠进行插管时，可使用尖头棉签清除妨碍视野的唾液。19如果唾液成为问题，该方法可能具有实用价值。
	<ol>
		<li>若遇到阻力，应立即撤出导管，并使呼吸恢复正常。若观察到出血现象，请咨询兽医人员。 
		注意：推进导管时应几乎无阻力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 确认气管插管位置
<ol>
	<li>使用检耳镜目视确认气管插管位于正确位置。此外，通过感受插入过程中气管的阻力小于食管，进一步确保插管位置正确。观察到在合适的位置时，气管插管应超过声门约 5 mm。观察光纤光源发出的光是否透过颈部皮肤透出，以再次验证插管位置正确。 
	注意：气管插管安全限位楔可防止插管插入过深。该安全限位楔可避免对隆突造成损伤；但不应妨碍插管的正常推进。应将其作为安全装置使用，而最佳插管深度通常比限位楔允许的深度更浅。</li>
	<li>然后，在固定气管插管位置的同时，移除光纤光源。使用“气泡法”（如下所述）而非通过观察镜片起雾来确认导管位置是否恰当。</li>
	<li>取用步骤 1.3 中预先准备的气泡管。应在操作前预先准备好，并在所有动物实验中重复使用。 
	注意：气泡管中的 200–300 µL 水或墨水绝不可被抽吸。为避免此情况，确保液体远离鲁尔锁接口。</li>
	<li>在气管插管就位后，使用鲁尔锁将气泡管固定。此时应立即可见潮气量。若无明显气泡，则表明气管插管位置错误。应迅速拔出插管，并让小鼠恢复正常呼吸频率。 
	注意：若导管误入食管，会压迫气管，导致通气不足。错位常表现为费力呼吸（包括明显的肋间肌参与）和/或呼吸频率显著降低。此外，食管插管可能引发肌肉痉挛，使后续插管更加困难；因此，我们建议在训练阶段使用多只动物进行练习。</li>
</ol>
5. 气管内给药
注意：与用于口咽部给药的舌拉法类似，给药 通过 插管可能导致动物溺水。在青少年和成年小鼠中， 50 µL 是一种相对安全的输注液体量，足以扩散至整个肺部。
<ol>
	<li>若使用注射器给药：将导管上的气泡管和鲁尔锁接头拆下，连接装有液体的鲁尔滑动注射器，推动推杆以输送所需体积（最大50 µL）。</li>
	<li>若使用移液器给药：直接将所需体积（最大50 µL）的液体移入导管中，并让小鼠自行吸入溶液。 
	注意：若进行操作训练，可考虑使用稀释并过滤的印度墨水或亚甲蓝等指示剂。</li>
	<li>为确保液体在肺部均匀分布，可用最多500 µL空气将已输送的液体进一步推入肺内20。此步骤可使用预先装填的0.5 mL鲁尔锁注射器，或配备滤芯吸头的P1000移液器完成，两者均已被证实可靠。如需要，可多次按压移液器，而不会导致已输送液体的反向吸入。 
	警告：若采用此方法对动物接种，由于该法相对于口咽吸入或鼻内给药具有更高的递送效率，建议降低接种物浓度。 
	注意：用空气冲洗接种物时，可能需要使用超过潮气量（约200 µL）的空气体积。然而，使用500 µL空气不会造成气压伤，因其仅约为肺活量的一半21。成年小鼠的吸气储备容积约为800 µL，因此即使小鼠在冲洗前已立即吸气，也不会发生气压伤21。可根据接种物分布需求，考虑是否采用较低的空气冲洗体积（建议100–200 µL）。</li>
</ol>
6. 递送效果的评估
注意：仅在培训或练习该操作时进行此步骤。
<ol>
	<li>根据批准的IACUC方案人道处死动物。CO2 此处采用窒息作为安乐死的主要方法，颈椎脱位作为安乐死的确认方法。</li>
	<li>打开胸壁并取出肺脏。操作时先切开腹膜，从尾侧暴露膈肌，并用小剪刀在可见心脏的位置刺穿膈肌。这将导致肺脏回缩，从而为剪开肋骨、扩大胸腔空间提供操作余地。 
	注意：如果需要通过灌注减少肺部血液，此时应通过心脏的右心室进行该操作。</li>
	<li>取出后，用 1 mL 无菌 PBS 简单冲洗肺组织。将其平铺在白色表面（如外科海绵）上，以充分暴露最大面积，同时保持各肺叶的相对位置。</li>
	<li>拍摄肺部照片 离体 （我们使用了一部手机），在 ImageJ 中打开图像，通过勾画染料前沿的轮廓来量化染色与未染色区域。由一名独立的、不知分组信息的研究人员对染色区域进行量化，以避免偏倚。 
	注意：如果使用发光检测和IVIS，如图所示 图3, 体内 应以活体成像替代第6步。</li>
</ol>

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</ol>

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气管插管和经气管灌注是向肺部输送液体的最佳方法，但小鼠解剖结构带来的诸多挑战阻碍了这些技术在肺部研究实验室中的广泛应用15。尽管该方法可确保接种物高效递送至肺部，但通过此类插管技术进行经气管给药的潜在缺点是绕过了上呼吸道。鼻内给药是一种经验证的有效方法，不会绕过上呼吸道。虽然鼻内给药在肺病毒学实验室中常被使用，并在某些情况下可能更有效22，但它并不能模拟某些吸入性物质的自然暴露途径23，导致肺部接种剂量变异较大24，且在使用异氟烷作为麻醉剂时效果较差5。因此，已有大量研究致力于气溶胶装置的开发，并将其与其他肺部给药技术进行比较25，但这些方法存在气溶胶相关危害，且通常成本较高。上述种种困难促使许多实验室转而采用经口咽灌注结合舌牵引法作为肺部液体递送的首选方法26。正如我们所展示的，该方法相较于插管后经气管灌注具有更大的变异性。此外，在给药过程中无法实时评估舌牵引法的递送效果，且为防止动物吞咽而施加的张力可能对小鼠舌头造成不必要的损伤。在引导式插管和经气管灌注技术中，舌头同样会被固定。然而，由于视频反馈可显示声门，研究人员使用我们的方法时无需通过对舌头施加过大张力来强制调整喉部位置。这种较小的牵引力可减少组织创伤。然而，尽管插管与经气管灌注具有显著优势，一些技术难题仍阻碍了其在部分实验室的应用。例如：误将导管插入食管可能导致气管受压，影响呼吸并增加死亡率；气管导管插入过深可能损伤隆突或主支气管；最后，传统方法进行小鼠插管耗时较长，对于大多数需要可靠肺内递送的研究人员而言并不实用。我们的方法解决了小鼠插管相关的各种困难，甚至克服了小鼠解剖结构对插管操作的阻碍。
已有多种方法通过使用视觉辅助工具来克服小鼠插管的解剖学困难。例如，有研究提出使用传统内窥镜6，但该仪器的长焦距并不适合用于小鼠插管（图S1）。这一点在视频1中也明显可见：虽然能够看到声带，但图像模糊。临床耳镜也曾被用于直接喉镜检查12，但其价格较高，且缺乏视频输出功能，导致大多数实验室难以获取，也不利于教学培训。而使用一种广泛可得的消费级耳镜则显著提高了引导插管的实用性。这种耳镜具有更短的焦距、更小的机身以及更长的压舌板边缘，可提供更清晰的视频图像，改善操作的灵活性和定位效果；同时，其耳镜边缘还可用于对舌根部施加压力，从而更好地暴露声门裂。除上述视觉辅助手段外，透射照明法也被成功用于观察小鼠声门并完成插管7,13,14。然而，基于透照的方法可能需要在小鼠颈部表面使用脱毛剂、将热光源紧贴皮肤、利用导管内的针头、将锐利器械插入小鼠口腔，和/或在气管上方做小切口以确认导管位置。本文所述方法避免了这些风险，并整合了上述已发表方法中的各项优势。此外，本方法在克服插管解剖障碍的同时，也充分考虑了成本因素。
综合使用辅助手、小鼠固定架、耳镜和光纤光源，可使插管操作更易于学习且操作速度显著加快，同时降低实验室的开支。通过自制设备可避免购买 commercially available 插管架的费用27。光纤光源组件的成本可通过单独购买光纤导管来降低（价格远低于整套设备，撰写本文时约为 9 美元，而 Kent Scientific 的整套设备为 218 美元）。为完成光纤光源的组装，可使用带小孔的 50 mL 锥形管盖和胶带，收集手机手电筒的光线（见图 S3和材料表）。Das 等人描述了类似装置11。对于部分实验室而言，该方案的成本降低可能使我们的方法成为更易获取的操作流程。除成本因素外，确认气管内导管位置的困难性一直是小鼠插管操作的主要挑战。
过去，为了确认气管插管位置是否正确，研究人员通常通过将牙科镜置于气管插管上方，观察镜面是否起雾来判断18。然而，由于潮气量较小以及室温变化的影响，镜面往往无法起雾，从而导致判断错误。在小鼠插管的情况下，这种方法存在造成严重损伤的风险。其他方法则通过阻塞气管插管以诱发呼吸窘迫10，但这种方法会给动物带来极大的应激反应，且提供的信息少于&#34;气泡法&#34;。此外，若未能充分确认气管插管位置，可能导致肺部治疗药物和空气进入胃部，不仅引起动物不适，还会影响给药效果。采用&#34;气泡法&#34;可实现更快、更可靠的视觉确认，是对先前描述的类似方法的一种改进28。该&#34;气泡法&#34;还可使研究人员大致估算动物的呼吸频率和潮气量。
动物体位的摆放以及声带的可视化是该技术的关键。我们发现，儿科用鼻窥器在插管过程中因体积过大且操作不便，难以有效撑开口腔并推开颊部；但在培训过程中非常有用，因为它可帮助研究人员演示耳镜的放置位置。指导受训者识别相关解剖结构较为困难，而改善小鼠口腔内的视野清晰度至关重要，商用耳镜的使用显著提升了可视性。使用带光源的放大镜并配合“辅助手”装置，对于帮助缺乏经验的操作者完成插管具有重要作用，尽管对于经验丰富的操作者而言，这些辅助工具可能并非必不可少。
在训练此方法的过程中，可能需要进行故障排除。如果气管插管反复进入食管，可能是声门发生痉挛，或软腭存在炎症，导致正确插管更加困难。此时，应让动物恢复数分钟后再尝试插管。重复尝试的次数应在IACUC方案中明确规定，并始终严格遵守。如果难以观察到声带，可能是由于麻醉过深导致呼吸频率受到抑制，或小鼠体位不当（最常见的是头部后仰过度）。此时应重新调整动物体位，并让其从麻醉状态中恢复后再进行尝试。气泡管应能清晰显示动物的潮气量。如果气泡移动幅度很小，可能是由于插管位置不当对气管造成压迫，引起喘息动作所致。在此情况下，请参考时间戳 8:25 以及图 S3，了解当气管插管位置正确时，使用&#34;气泡管&#34;所显示的潮气量应如何明显可见。如果气管插管位置错误，应立即拔出，并让动物恢复后再重新尝试操作。
尽管插管和经气管滴注技术远优于其他方法，但由于技术难度较高，尚未得到广泛应用。本文所述方法使经气管滴注和小鼠插管变得易于操作且具有实用性。虽然该技术未来的应用前景在很大程度上取决于向肺部递送的物质及其给药环境，但一种简便且可靠的方法无疑将为肺生物学领域的诸多进展铺平道路。

全球范围内，呼吸系统疾病是5岁以下儿童死亡的首要原因，也是成人发病和死亡的重要原因1。2021年，SARS-CoV2感染是美国第三大死因2。小鼠模型常用于研究肺部疾病，包括哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺病以及肺纤维化。这些模型几乎都需要将液体试剂递送至肺部。该操作可通过气管直接插管（通常在手术暴露法直视下进行）、经鼻给药，或采用成熟的拉舌法经口咽吸引实现3,4,5。然而，这些技术均存在局限性。手术暴露法可能导致瘢痕组织形成，因此不适用于需多次向肺部给药的研究；而后两种方法可能导致肺部递送量不一致。此外，使用拉舌法时可能造成明显的舌部组织损伤，且递送效率依赖于操作人员的技术水平，参见图1。
<img alt="肺部染料分布；印度墨水实验结果；柱状图分析；技术比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67676/67676fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：与拉舌法相比，引导插管及气管内滴注可实现更优的肺部递送效果且变异性更小。（A）三名不同的研究人员通过拉舌法（即已建立的口咽部（OP）给药方法）递送50 µL稀释的印度墨水。另外两名研究人员也按照所述方法使用插管技术将墨水递送至肺部。（B）给药后1–4小时取出肺组织，在2倍放大倍数下拍摄照片，并使用ImageJ软件评估染色面积。（n=6（插管）或9（OP给药），数据来自2至3名不同研究人员进行的2或3次独立重复实验，p&lt;0.0001，Welch's T检验）（C）肺部给药的变异性也以相对于均值的百分比偏差进行计算。结果显示OP给药的变异性显著更高。（p = 0.0317，Welch's T检验，GraphPad Prism 10.2.3 进行所有统计分析与作图）（实验使用C57BL/6J雄性和雌性小鼠，年龄约为10周。） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/67676fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
小鼠的解剖结构使得插管操作困难且耗时。其口腔狭小，颊部组织可能遮挡研究人员对声门裂的观察6。此外，声带非常细小，且紧邻舌根，因此观察起来颇具挑战性。最后，由于潮气量较小，通常无法使镜面起雾，从而难以确认气管插管位置是否正确7。这些困难促使研究人员开发出多种创新的小鼠插管技术。这些改进方法包括使用新生儿喉镜并借助导丝将导管送入气管8,9，利用光纤光源引导并增强导管的刚性10,11，以及采用实时视频反馈6。最近，临床用耳镜也被用于辅助经口气管插管12。另有研究者采用透射照明法来观察声门并完成小鼠插管7,13,14。然而，这些方法存在诸多缺点。在小鼠颈部使用脱毛剂以及动物靠近高温光源进行透照，使其并非理想选择。将针插入导管内或使用锐利器械进入口腔的操作，意味着某些增强导管硬度的方法会给动物带来不必要的风险。最后，通过在气管上方做切口以确认导管位置，也存在明显弊端，包括需要无菌操作以及可能形成瘢痕组织。迄今为止，经插管途径的气管内灌注因操作难度过大而未能被广泛采用15，且方法学上的进展仍局限于少数实验室，未被广泛应用15。此外，一些研究关注给药过程中麻醉剂的选择，发现氯胺酮相比异氟烷可能更具优势5。然而，由于异氟烷不属于管制药品，且在操作结束后可迅速代谢，具有明显的应用优势，因此我们在优化该方法其他环节时选择了此种麻醉方式16,17。
本文所述方法克服了其他研究试图解决的可视化难题，降低了实验动物的风险，缩短了通过气管插管向气管内注入小体积液体所需的时间，增加了到达肺部的液体量，并提供了更优的气管插管位置确认方法。利用支架、磁性辅助手（固定在底座上的带鳄鱼夹的柔性臂）以及更明亮的照明，单名研究人员即可高效完成气管内给药操作。使用一款具备 WIFI 连接功能的家用耳镜可更方便地实现可视化观察，该设备比商用插管器械更经济实惠。此外，WIFI 连接功能可在便携设备（如手机）上同步传输视频流，便于教学培训。插管操作可采用两种方式：将光纤光源穿过一根20 g × 1" 的柔性聚四氟乙烯（PTFE）导管（已去除针头），或仅使用导管而不加光源。插管深度通过两种方式控制：一是在导管上加装插管安全楔（导管上的锥形保护装置），二是在视频画面中观察插入深度。通过“气泡法”确认气管插管位置，可比传统的镜面起雾法更清晰地观察潮气量18。该方法相比依赖气管阻塞以改变呼吸急迫性来确认插管位置的方式，对动物造成的应激更小10。结合使用连接导管的延长管以确认插管成功（下文简称“气泡法”）——该法简化自 Watanabe 等人7——以及消费级视频耳镜，在单一操作流程中使插管成为向肺部递送治疗制剂的实用方法，并显著优于传统的拉舌法（见 图1）。若需一种可靠、稳定且经济的非手术方式将液体递送至小鼠肺部，尤其希望避免使用管制类药物（如氯胺酮）或昂贵设备，则本方法可能是理想选择。

<table><tbody><tr><td>光纤照明 光纤照明套件，小鼠</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>ETI-12ETI-MSE-02</td><td>光纤组件的一部分，可与其他光源及下方的替换光纤电缆兼容</td></tr><tr><td>替代性光纤组件</td><td>Braintree Scientific</td><td>RW-A37 47</td><td>一种替代方法，虽未讨论，但我们认为其同样可行</td></tr><tr><td>替代性光纤组件</td><td>哈佛仪器</td><td>72-9075</td><td>一种替代方法，虽未讨论，但我们认为其同样可行</td></tr><tr><td>替代性光纤组件</td><td>实验室手工制作</td><td>N/A</td><td>此处使用橡胶塞的说明：DOI 10.3791/50318</td></tr><tr><td>替代性光纤组件</td><td>实验室手工制作</td><td>N/A（以下所列材料）</td><td>由50 mL锥形瓶盖、胶带和0.75 mm光纤纤维制成</td></tr><tr><td>小鼠插管支架</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>ETI-MSE-01</td><td>可调节的插管支架，有多种自制版本可供选择，可使用吸头架和木制平台，另有多种合适的替代方案可供选择。</td></tr><tr><td>替代性插管支架</td><td>布雷恩特里科学</td><td>RIS 100</td><td>一种替代方法，虽未讨论，但我们认为其同样可行</td></tr><tr><td>替代性插管支架</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1014</td><td>一种替代方法，虽未讨论，但我们认为其同样可行</td></tr><tr><td>替代性插管支架</td><td>维特兰</td><td>000A3467</td><td>一种替代方法，未在文中讨论（但我们认为其可行）</td></tr><tr><td>替代性插管支架</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td>由三环活页夹制成，详见：DOI 10.3791/60844（已有多种替代方法发表）</td></tr><tr><td>不可吸收编织丝线缝合线，0号</td><td>精细科学工具&amp;nbsp;</td><td>18020-00</td><td>超过1英寸将损伤隆嵴&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Safelet IV 导管 20G x 1&quot;</td><td>Nipro</td><td>NPRCI+2025</td><td>或类似</td></tr><tr><td>RS-5358 微型解剖镊</td><td>Fisher</td><td>RS-5358</td><td>或类似装置，包括辅助手具&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带光源和支架的放大镜，EOOKU 柔性磁性辅助手，5倍放大&amp;amp;10倍 12V 108颗LED珠放大灯，3种模式可调旋转鹅颈臂 &amp;amp; 重型底板</td><td>亚马逊</td><td>https://www.amazon.com/Magnifying-&lt;br/&gt; EOOKU-柔性可调-鹅颈管&lt;br/&gt; /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4&lt;br/&gt; PZY6UOCEE9&amp;amp;dib=eyJ2IjoiMSJ9&lt;br/&gt; gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl&lt;br/&gt; JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH&lt;br/&gt; ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM&lt;br/&gt; SJxpz1MPP0&lt;br/&gt; q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB&lt;br/&gt; J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X&lt;br/&gt; eo0LQfygaSMgW58XO2bbasOfaw&lt;br/&gt; cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_&lt;br/&gt; cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x&lt;br/&gt; fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm&lt;br/&gt; TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w&lt;br/&gt; 17T0c_rRhh-Mrew&lt;br/&gt; .TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK&lt;br/&gt; zMMVSg5op4U5eyvA&amp;amp;dib_标签=&lt;br/&gt; se&amp;amp;关键词=带放大镜&lt;br/&gt; +light+EOOKU+3+in+1&amp;amp;qid=1709661&lt;br/&gt; 709&amp;amp;sprefix=放大镜+带+&lt;br/&gt; 光+eooku+3+合1%2C气管插管,98&amp;amp;sr=8-5</td><td>或类似工具，任何带细锯齿的弯头镊子均可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>耳垢清除 - 带8件套耳部工具的耳垢清除器 - 带摄像头的耳道清洁器 - 带照明的耳垢清除套装 - 带6个耳勺的耳内摄像头 - 适用于iOS的耳道清洁器 &amp;amp; 安卓（黑色）</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Ear-Wax-&lt;br/&gt; 移除-移除器-Android%EF%&lt;br/&gt; BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0&lt;br/&gt; 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147&lt;br/&gt; -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8&lt;br/&gt; Ta&amp;amp;内容编号=amzn1.sym.1ad20&lt;br/&gt; 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae&lt;br/&gt; 04&amp;amp;pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731&lt;br/&gt; -9356-36b3edf1ae04&amp;amp;pf_rd_r=&lt;br/&gt; MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE&amp;amp;&lt;br/&gt; pd_rd_wg=ja4H2&amp;amp;pd_rd_r=52d9&lt;br/&gt; 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96&lt;br/&gt; 3d9&amp;amp;pd_rd_i=B09KZ8TS7L&amp;amp;psc=1</td><td>或类似产品，有多个品牌可供选择&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AZIMOM PMMA 塑料端发光光纤电缆 0.75 mm（0.02 英寸）100 m（328 英尺）/卷，适用于星空天花板各类 LED 光源引擎驱动器</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/AZIMOM&lt;br/&gt; -塑料可切割天花板-1片0-00&lt;br/&gt; 98英寸328英尺/直径B07WC9JV5N/参考编号sr&lt;br/&gt; _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB&lt;br/&gt; hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS&lt;br/&gt; F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ&lt;br/&gt; cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM&lt;br/&gt; vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN&lt;br/&gt; H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB&lt;br/&gt; Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW&lt;br/&gt; b2U4fNN0upQKgyD1vE&lt;br/&gt; eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC&lt;br/&gt; D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df&lt;br/&gt; bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j&lt;br/&gt; NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T&lt;br/&gt; JVRnNElEzUzjx0rY.AMHl3h-jIz&lt;br/&gt; GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ&lt;br/&gt; UDPz_U6ctI0&amp;amp;dib_标签=se&amp;amp;&lt;br/&gt; 关键词=光纤光源&lt;br/&gt; +strands&amp;amp;qid=1722619884&amp;amp;sr&lt;br/&gt; =8-9&amp;amp;th=1</td><td>或类似的光纤用于在线7中构建装置</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>细胞治疗</td><td>229421</td><td>任何不透明的塑料50 mL螺口锥形盖均可使用。不会与动物接触或接近动物，因此无需无菌处理。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VetOne</td><td>咨询兽医人员</td><td></td></tr><tr><td>接种物&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>与您的实验相关</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（带滤芯）</td><td>N/A</td><td>无菌滤芯 p100 和 p1000 吸头已使用</td><td>品牌/供应商无关&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>N/A</td><td>如贵机构可提供</td><td>品牌/供应商无关&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异丙醇消毒垫</td><td>N/A</td><td>用于仪器清洁</td><td>品牌/供应商无关&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>导管&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>小直径柔性导管即可使用&amp;nbsp;</td><td>用于构建 &quot;气泡管&quot;&amp;nbsp; （我们的约为3 mm直径，取自静脉输液管）</td></tr><tr><td>鲁尔锁</td><td>N/A</td><td>以适配您上方的导管</td><td>用于构建 &quot;气泡管&quot;</td></tr><tr><td>3M 半面罩式呼吸器</td><td>3M</td><td>17-986-9B</td><td>以限制气体暴露</td></tr><tr><td>扭结扎带</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>保持气泡管的 U 形结构</td></tr></tbody></table>

改进的小鼠肺部液体递送方法：使用民用耳镜进行插管

Improved Methodology for Liquid Delivery to the Mouse Lung: Intubation using a Consumer Otoscope

向肺部稳定递送液体（包括潜在治疗剂）对于肺部疾病建模和临床前治疗开发至关重要。然而，目前在小鼠中常用的方法——例如通过拉舌法进行的经口咽部吸入——可能导致递送量的不一致。本文介绍一种经济实惠、可连接手机并带有照明功能的耳镜，用于可视化声门，从而实现对气道的直接接种。我们详细描述了一种经过优化的固定技术，配备充足的照明和体位辅助装置。同时阐述了如何使用20 G柔性导管，无论是否结合光纤光源，均可可靠地进行插管操作。该技术显著降低了肺内递送的变异程度，并提高了到达肺部的液体体积。由于变异减少，在采用此方法时可使用更少的实验动物数量，相较于传统的拉舌法经口咽滴注更具优势。下文所述方法可实现高效、快速且稳定的对小鼠进行气管插管及肺部递送，并包含对气管导管位置的可靠确认手段。通过这一改进的方法，稳定、安全的插管操作以及可重复、高效的肺部递送已成为可实现的目标。

如图所示 图1 和 图3，采用传统的拉舌法（经口咽递送）进行肺内接种时，墨汁分布不均，且不同操作者之间的差异较大。相比之下，经气管插管后的气管内灌注可使双侧肺叶（左右肺）的递送更为一致，且操作者间变异较小图1C 和 图3D）。通过舌拉法经口咽部吸入墨水后，在动物肺部中，墨水痕迹较微弱，仅出现在动物大呼吸道附近 (图1A). 相比之下，采用引导插管法递送墨水时，墨水在组织中的扩散范围更广，标记出的肺部区域远大于舌牵拉法。当比较两种方法所染色的肺表面面积时，插管法明显优于舌牵拉法。 (图1B). 插管条件下的墨水量输送变异度也显著降低 (图1C). 染色肺组织面积增加以及到达肺部的液体量变异程度降低，强烈表明气管内给药优于舌牵拉法。
如视频1所示，传统的内窥镜（如先前发表的研究所述）焦距过长，难以清晰观察声带并引导气管插管6,19。相比之下，使用消费级耳镜获取的视频图像（图S1以及视频时间戳：6:34和7:05）具有更高的分辨率，从而显著改善了声门的可视化效果。
该插管方法包含对导管在气管内位置的多重验证。使用气泡法时，可明显观察到小鼠的潮气量（图S2 和时间戳：8:25），并以此最终确认所给予的任何液体均会进入肺部。
为进一步评估两种递送方法的差异，我们在小鼠接种 1 x 1011 通过两种不同方法（舌拉法经口咽滴注或经引导气管插管后气管内递送）给予 AAV6.2-Luciferase 病毒颗粒。在载体给药后第7天，使用活体成像系统进行生物发光检测 体内 成像系统（IVIS）（图 3A）。然后，我们计算了双肺的平均辐射强度。成像前10分钟（曝光30秒），通过皮下注射给予 200 µL 荧光素（15 mg/mL）。如图所示 图3B经口咽滴注给予载体的动物，其胸部和鼻部区域均显示出广泛分布的生物发光信号。相比之下，通过引导插管进行气管内递送载体的动物，其发光信号主要集中于肺部。插管动物的平均辐射强度显著高于口咽递送组，表明气管插管法在将载体递送至肺部时效率更高，且递送的变异性更低，该结论基于与均值的差异计算得出图3C 和 图 3D).
插管方法的成功结果包括可重复地将最多50µL液体注入小鼠肺部（见图1和图3），液体在肺内呈弥散性分布（如图1所示），而未出现在其他区域（如图3所示的上呼吸道/鼻腔等部位）。
任何对动物造成的伤害、过度的应激、到达肺部的液体体积减少、接种物在肺内分布不均或需要长时间训练等情况均被视为不良结果，但这些情况均未发生。
视频1：传统内窥镜下观察小鼠口咽部和声带时视野模糊，难以有效使用。 该内窥镜3 cm的焦距导致声带结构和空间方位难以辨认。左下方为舌体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/Video1%20T.%20Parks%20Remcho%20(1).mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="小鼠AAV6.2-Luc给药：IVIS成像；OP与IT递送方式比较；辐射通量数据及变异分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67676/67676fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3插管给药相较于经口吸入能实现更高效且更稳定的肺部药物递送。 (A6-10周龄雌性BALB/c小鼠以1×10⁶个细胞进行给药11 vg 的 AAV6.2-Luciferase（Penn Vector Core），随后进行评估 体内 7 天后进行生物发光成像（IVIS）。成像前 10 分钟（曝光 30 秒），经皮下注射 200 µL 荧光素（GoldBio，15 mg/mL）。（使用 biorender.com 创建）B) 通过口腔吸引（拉舌法，左）或气管内给药（插管法，右）接受 AAV6.2-Luciferase 处理的小鼠代表性 IVIS 图像。感兴趣区域大小相同，图像中显示的是该区域内平均辐射通量。C) 吸入OP（n=7）与插管（n=5）小鼠中荧光素酶信号的定量分析。p&lt;0.0001，经Welch's t检验（对原始荧光素酶数据进行对数转换后）得出。D) 偏离均值，表示为平均辐射亮度均值的百分比。（p=0.0381，Welch's T检验） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/67676fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
图S1：所示为在所述引导插管方案中使用的消费级耳镜（左）和类似价格与可及性的内窥镜（右）拍摄的示例图像。 注意图像之间在对焦效果上的明显差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/FigureS1.jpeg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
图S2：显示气泡管使用情况的示例图像。 潮气量可使气泡管中的液滴迅速移动数厘米。若导管位于食管内，则液滴移动幅度极小。通过该方法可估算呼吸频率和潮气量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/FigureS2.jpeg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
图S3：一种基本的照明装置，可避免购买昂贵的光纤照明套件。 将一根20 G针头穿过一个50 mL的锥形管，廉价（且批量）采购的0.75 mm光纤电缆用剃刀切割至适当长度（约1 m），并用胶带固定。由于光纤电缆与针头之间贴合紧密，无需额外固定导管。将锥形管盖固定在移动电话的闪光灯上，即可实现足够的光传导，从而在黑暗房间内完成插管操作。该装置进一步降低了实验室采用此技术所需承担的成本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/FigureS3.jpeg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了如何通过优化小鼠体位并经口插入基于摄像头的耳镜，实现对声门的清晰观察，以最小的组织损伤快速进行气管插管，并稳定地将液体输送至肺部。

向肺部持续输送液体（包括潜在治疗剂）对于肺部疾病建模和临床前治疗研究至关重要……

[旁白] 改进的小鼠肺部液体递送方法。使用市售耳镜进行插管。所有动物实验操作及本内容均已通过杜兰大学比较医学系审查，并获方案1810批准。在继续操作前，请寻求贵机构IACUC的批准并咨询兽医人员。新型肺部治疗药物的开发依赖于对小鼠肺部可靠且可重复的递送，但传统方法依赖鼻内给药、舌拉法经口咽吸引或手术切开。以下方法相较于舌拉法降低了变异性，从而允许使用更少的动物数量；同时，该方法也远比手术切开侵入性小。操作步骤一：准备。最初使用的啮齿类动物插管套件配备有插管安全楔。这些是小型圆锥形套管，可套在20号、一英寸长的柔性导管上，用于防止导管损伤气管隆突。使用前，用异丙醇消毒垫清洁安全楔。将清洁后的安全楔（此处为绿色）滑至20号柔性套管上。收集其他所需工具，包括商用耳镜、手机、带鼻罩的小鼠支架、弯曲且细齿的镊子、气管插管管以及光纤光源（如使用）。使用前均需用异丙醇消毒垫清洁。取一段约20厘米长的柔性管，将其弯成U形，并在一端连接一个鲁尔锁接头。用扭线固定U形结构。向管内加入2至300微升无菌过滤水或印度墨水。此后，此装置称为“气泡管”。制作缝合环：将13厘米长的0号丝线打结成环状。将此环置于小鼠支架顶部，并确保缝合线两侧牢固固定。将小鼠支架放置在金属放大光源底座上。将辅助手装置放置在小鼠口腔所在位置周围。将小鼠放入诱导室中，使用0.8升/分钟的恒定氧气流速和2%异氟烷进行麻醉。需充分麻醉小鼠，以确保在安装鼻罩过程中不会苏醒，但不应显著抑制其呼吸频率。规律呼吸有助于观察声门结构。将耳镜与手机连接，并确保视频信号稳定。注意：为尽量减少研究人员在操作过程中接触异氟烷，若需进行多次插管或方法培训，应使用化学防护呼吸器。或者，可在通风橱内进行操作。步骤二：动物体位固定。当小鼠在诱导室中入睡后，立即取出。抓住其颈部皮肤，将其上门齿置于缝合线上。施加轻度张力以维持缝合线位置，同时将小鼠平放于支架上。轻微后仰调整颈部角度，使颈部轻度伸展5至15度。轻轻将鼻罩推至鼻孔处。切勿用力下压鼻罩，以免干扰悬吊小鼠的缝合线。使用大号、细齿、弯曲镊子，尽可能靠近下唇牢固夹住舌头，然后用力向下并向侧方牵拉，使其远离上门齿并移至下门齿一侧。注意：长时间牵拉、过度张力或压伤舌头可能损害动物健康。请密切监测舌头是否出现创伤迹象，如瘀伤、出血、肿胀或干燥。若发现任何异常，应立即终止操作并通知兽医人员。若使用辅助手装置，请在此位置固定镊子。如使用光纤光源，请将其通过已安装安全楔的柔性导管插入。步骤三：声门可视化与插管。用非优势手持耳镜，轻轻按压舌头，然后调整摄像头及其光源角度，以观察舌根附近的声门结构。由于解剖结构和组织颜色存在轻微差异，应通过呼吸运动来确认结构识别。初学者在视频画面中定位可能较困难。此处为假声带；此处为真声带；此处为口腔组织反光；此处为探头与光纤光源；此处为会厌；此处为软腭；此处为声门裂，即插管目标区域；此处为耳镜唇部，用于下压舌头；此区域为禁止进入区。开启光纤光源（如使用），沿耳镜旁送入套管，使其轻微接触舌根或耳镜的唇部。作为参考，调整导管进针角度，使其非常平缓。导管插入声门后立即推进不超过1毫米，随即抬高导管尖端，使其几乎与实验台面平行。此举可防止会厌将导管推向背侧进入食管。注意：推进导管时应几乎无阻力。若遇阻力，应立即撤出导管，待呼吸恢复正常后再尝试。若观察到出血，请咨询兽医人员。步骤四：确认气管插管位置。除通过耳镜目视确认导管位于正确位置外，气管在插管过程中提供的阻力小于食管。光学插入深度约为声门下方5毫米。可通过颈部透光作为第二种方法，确认插入深度是否合适。注意：插管安全楔应防止气管插管过深。安全楔可避免对气管隆突造成损伤，但不应阻碍导管正常推进。在保持气管插管位置的同时，撤出光纤光源。使用气泡管法确认套管位置是否正确。用鲁尔锁将气泡管固定到位。潮气量应立即显现。若未见气泡波动，则表明气管插管位置错误，应迅速撤出导管，待小鼠呼吸恢复正常。步骤五：经气管递送。与舌拉法进行口咽递送类似，插管递送也存在使动物“溺液”的风险。在青春期及成年小鼠中，50微升通常是安全的液体递送体积，足以在肺内广泛分布。若使用移液器给药，可将所需体积直接注入导管，让小鼠自主吸入溶液。为确保液体在肺内均匀分布，可在递送液体后推送最多500微升空气进入肺部。如有需要，可多次按压移液器，而不会导致已递送液体被反向吸入。注意：当用空气冲洗接种物时，可能需要超过潮气量（约200微升）的空气量。然而，使用500微升空气不会造成损伤，因其仅约为肺活量的一半。步骤六：递送效果评估。手持式光纤光源可由廉价易得的组件自制。本视频中使用了商用光纤组件（如图所示），但也可使用50毫升锥形管盖，在其中用20号针头打孔，并穿入一根0.75毫米塑料光纤电缆即可满足需求。本视频中同时使用了商用和自制设备。代表性结果：与舌拉法口咽吸引相比，采用插管进行经气管递送可提高递送效率并减少变异性。对舌拉法与引导插管法的直接比较：三位经验水平不同的研究人员被要求独立地通过舌拉法向10至12周龄的C57BL/6J小鼠（两性）口咽递送50微升稀释印度墨水。其中两位研究人员还按照上述方法通过插管将相同浓度和体积的墨水递送至肺部。给药后立即取出肺组织，在2倍放大下拍照。由独立且不知分组情况的研究人员使用ImageJ软件评估染色面积。结果显示，使用插管法染色的肺组织面积更大。此外，以均值百分偏差表示的变异性在采用插管后经气管递送时显著降低，优于舌拉法。用于引导插管的工作站配置如图所示：从左至右依次为：用于递送的移液器、用于确认气管插管位置的气泡管、镊子、刮匙、小儿鼻窥器、辅助手装置、放大光源、带鼻罩的小鼠支架、光纤探头及麻醉诱导室。插管法相较于口咽吸引（OP aspiration）可实现更高效率的肺部递送且变异性更低。10周龄雌性Valve C小鼠经剂量为1×10¹¹ vg的AIV 6.2 luciferase处理，七天后进行活体生物发光成像评估。成像前10分钟，皮下注射荧光素酶底物Luciferin。图中显示了通过舌拉法口咽吸引或插管法经气管接种AIV 6.2 luciferase的小鼠代表性活体成像（a-vis）图像。舌拉法口咽吸引导致信号分布在上呼吸道多个区域，而插管法则使信号集中于肺部。各图像中感兴趣区域面积相同，区域内平均辐射强度已在图中标注。对荧光素酶信号的定量分析表明，插管法显著提高了向肺部的递送效率，并进一步凸显了该方法在递送一致性方面的优势。结论：如前所示，采用传统舌拉法进行肺内接种表现出斑片状、不一致的接种物分布，且到达肺部的剂量变异性较大。相比之下，插管法实现了左右肺更一致的递送，且变异性更低。该插管方法已稳健证明的积极成果包括：一、可重复地向小鼠肺部递送最多50微升液体；二、灌注液体在肺内广泛分布；三、减少接种物向肺外扩散。该方法快速、安全，无需昂贵设备或耗时培训，可轻松整合至实验室常规操作中。

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科研

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Immunology and Infection

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