改进的小鼠肺部液体递送方法：使用民用耳镜进行插管

[旁白] 改进的小鼠肺部液体递送方法。使用市售耳镜进行插管。所有动物实验操作及本内容均已通过杜兰大学比较医学系审查，并获方案1810批准。在继续操作前，请寻求贵机构IACUC的批准并咨询兽医人员。新型肺部治疗药物的开发依赖于对小鼠肺部可靠且可重复的递送，但传统方法依赖鼻内给药、舌拉法经口咽吸引或手术切开。以下方法相较于舌拉法降低了变异性，从而允许使用更少的动物数量；同时，该方法也远比手术切开侵入性小。操作步骤一：准备。最初使用的啮齿类动物插管套件配备有插管安全楔。这些是小型圆锥形套管，可套在20号、一英寸长的柔性导管上，用于防止导管损伤气管隆突。使用前，用异丙醇消毒垫清洁安全楔。将清洁后的安全楔（此处为绿色）滑至20号柔性套管上。收集其他所需工具，包括商用耳镜、手机、带鼻罩的小鼠支架、弯曲且细齿的镊子、气管插管管以及光纤光源（如使用）。使用前均需用异丙醇消毒垫清洁。取一段约20厘米长的柔性管，将其弯成U形，并在一端连接一个鲁尔锁接头。用扭线固定U形结构。向管内加入2至300微升无菌过滤水或印度墨水。此后，此装置称为“气泡管”。制作缝合环：将13厘米长的0号丝线打结成环状。将此环置于小鼠支架顶部，并确保缝合线两侧牢固固定。将小鼠支架放置在金属放大光源底座上。将辅助手装置放置在小鼠口腔所在位置周围。将小鼠放入诱导室中，使用0.8升/分钟的恒定氧气流速和2%异氟烷进行麻醉。需充分麻醉小鼠，以确保在安装鼻罩过程中不会苏醒，但不应显著抑制其呼吸频率。规律呼吸有助于观察声门结构。将耳镜与手机连接，并确保视频信号稳定。注意：为尽量减少研究人员在操作过程中接触异氟烷，若需进行多次插管或方法培训，应使用化学防护呼吸器。或者，可在通风橱内进行操作。步骤二：动物体位固定。当小鼠在诱导室中入睡后，立即取出。抓住其颈部皮肤，将其上门齿置于缝合线上。施加轻度张力以维持缝合线位置，同时将小鼠平放于支架上。轻微后仰调整颈部角度，使颈部轻度伸展5至15度。轻轻将鼻罩推至鼻孔处。切勿用力下压鼻罩，以免干扰悬吊小鼠的缝合线。使用大号、细齿、弯曲镊子，尽可能靠近下唇牢固夹住舌头，然后用力向下并向侧方牵拉，使其远离上门齿并移至下门齿一侧。注意：长时间牵拉、过度张力或压伤舌头可能损害动物健康。请密切监测舌头是否出现创伤迹象，如瘀伤、出血、肿胀或干燥。若发现任何异常，应立即终止操作并通知兽医人员。若使用辅助手装置，请在此位置固定镊子。如使用光纤光源，请将其通过已安装安全楔的柔性导管插入。步骤三：声门可视化与插管。用非优势手持耳镜，轻轻按压舌头，然后调整摄像头及其光源角度，以观察舌根附近的声门结构。由于解剖结构和组织颜色存在轻微差异，应通过呼吸运动来确认结构识别。初学者在视频画面中定位可能较困难。此处为假声带；此处为真声带；此处为口腔组织反光；此处为探头与光纤光源；此处为会厌；此处为软腭；此处为声门裂，即插管目标区域；此处为耳镜唇部，用于下压舌头；此区域为禁止进入区。开启光纤光源（如使用），沿耳镜旁送入套管，使其轻微接触舌根或耳镜的唇部。作为参考，调整导管进针角度，使其非常平缓。导管插入声门后立即推进不超过1毫米，随即抬高导管尖端，使其几乎与实验台面平行。此举可防止会厌将导管推向背侧进入食管。注意：推进导管时应几乎无阻力。若遇阻力，应立即撤出导管，待呼吸恢复正常后再尝试。若观察到出血，请咨询兽医人员。步骤四：确认气管插管位置。除通过耳镜目视确认导管位于正确位置外，气管在插管过程中提供的阻力小于食管。光学插入深度约为声门下方5毫米。可通过颈部透光作为第二种方法，确认插入深度是否合适。注意：插管安全楔应防止气管插管过深。安全楔可避免对气管隆突造成损伤，但不应阻碍导管正常推进。在保持气管插管位置的同时，撤出光纤光源。使用气泡管法确认套管位置是否正确。用鲁尔锁将气泡管固定到位。潮气量应立即显现。若未见气泡波动，则表明气管插管位置错误，应迅速撤出导管，待小鼠呼吸恢复正常。步骤五：经气管递送。与舌拉法进行口咽递送类似，插管递送也存在使动物“溺液”的风险。在青春期及成年小鼠中，50微升通常是安全的液体递送体积，足以在肺内广泛分布。若使用移液器给药，可将所需体积直接注入导管，让小鼠自主吸入溶液。为确保液体在肺内均匀分布，可在递送液体后推送最多500微升空气进入肺部。如有需要，可多次按压移液器，而不会导致已递送液体被反向吸入。注意：当用空气冲洗接种物时，可能需要超过潮气量（约200微升）的空气量。然而，使用500微升空气不会造成损伤，因其仅约为肺活量的一半。步骤六：递送效果评估。手持式光纤光源可由廉价易得的组件自制。本视频中使用了商用光纤组件（如图所示），但也可使用50毫升锥形管盖，在其中用20号针头打孔，并穿入一根0.75毫米塑料光纤电缆即可满足需求。本视频中同时使用了商用和自制设备。代表性结果：与舌拉法口咽吸引相比，采用插管进行经气管递送可提高递送效率并减少变异性。对舌拉法与引导插管法的直接比较：三位经验水平不同的研究人员被要求独立地通过舌拉法向10至12周龄的C57BL/6J小鼠（两性）口咽递送50微升稀释印度墨水。其中两位研究人员还按照上述方法通过插管将相同浓度和体积的墨水递送至肺部。给药后立即取出肺组织，在2倍放大下拍照。由独立且不知分组情况的研究人员使用ImageJ软件评估染色面积。结果显示，使用插管法染色的肺组织面积更大。此外，以均值百分偏差表示的变异性在采用插管后经气管递送时显著降低，优于舌拉法。用于引导插管的工作站配置如图所示：从左至右依次为：用于递送的移液器、用于确认气管插管位置的气泡管、镊子、刮匙、小儿鼻窥器、辅助手装置、放大光源、带鼻罩的小鼠支架、光纤探头及麻醉诱导室。插管法相较于口咽吸引（OP aspiration）可实现更高效率的肺部递送且变异性更低。10周龄雌性Valve C小鼠经剂量为1×10¹¹ vg的AIV 6.2 luciferase处理，七天后进行活体生物发光成像评估。成像前10分钟，皮下注射荧光素酶底物Luciferin。图中显示了通过舌拉法口咽吸引或插管法经气管接种AIV 6.2 luciferase的小鼠代表性活体成像（a-vis）图像。舌拉法口咽吸引导致信号分布在上呼吸道多个区域，而插管法则使信号集中于肺部。各图像中感兴趣区域面积相同，区域内平均辐射强度已在图中标注。对荧光素酶信号的定量分析表明，插管法显著提高了向肺部的递送效率，并进一步凸显了该方法在递送一致性方面的优势。结论：如前所示，采用传统舌拉法进行肺内接种表现出斑片状、不一致的接种物分布，且到达肺部的剂量变异性较大。相比之下，插管法实现了左右肺更一致的递送，且变异性更低。该插管方法已稳健证明的积极成果包括：一、可重复地向小鼠肺部递送最多50微升液体；二、灌注液体在肺内广泛分布；三、减少接种物向肺外扩散。该方法快速、安全，无需昂贵设备或耗时培训，可轻松整合至实验室常规操作中。