细胞壁和细胞膜蛋白质的分离与分级 结核分枝杆菌 用于下游蛋白质分析

本研究致力于开发一种简化的分离方法，将结核分枝杆菌不溶性的细胞壁和细胞膜蛋白分离为简单的组分，以便直接进行蛋白质组学和免疫学检测。电泳技术的进步使得复杂的蛋白质能够被分离为更少的蛋白组分，从而促进基于质谱的高效分离，适用于功能性的蛋白质组学和免疫学应用。主要挑战包括疏水性蛋白在百毫克以上浓度时溶解性差，以及SDS-PAGE引起的变性问题，这会阻碍需要天然构象的下游应用，例如酶活性检测。

目前尚无现有方案能够将不溶性疏水细胞壁和细胞膜蛋白系统性地分离为明确的水溶性组分，以用于直接的蛋白质组学和免疫学分析，而这一点对于理解蛋白功能并指导干预措施至关重要。我们未来的研究将致力于开发基于T细胞抗原的诊断方法，并评估其在结核病人群中的敏感性、特异性和检测性能，旨在实现结核病的早期、准确检测，从而支持更有效的疾病防控。首先，从结核分枝杆菌全细胞裂解液中获取细胞壁、细胞膜及胞质蛋白样品。

在等电聚焦缓冲液中溶解细胞壁和细胞膜蛋白。在pH 3至10和pH 4至6的两性电解质中，按1:4的比例加入2%的两性电解质。随后，在4°C的冷却水浴条件下，使用液相等电聚焦系统对溶解的蛋白质进行分级分离。

按照制造商的说明，采用12瓦的恒定功率进行等电聚焦分离。使用真空泵收集各个等电聚焦组分。测定每份组分的pH值。

将分离的组分各取50微克进行SDS-PAGE，并使用考马斯亮蓝或银染法显色观察蛋白质。首先将等电聚焦分离得到的细胞壁和细胞膜组分与SDS凝胶电泳上样缓冲液混合，然后在95摄氏度下加热5分钟。

使用16厘米×20厘米的聚丙烯酰胺凝胶进行第二维蛋白质组分分离，凝胶包含12.5%的分离胶和4%的浓缩胶。然后使用一个13厘米长的加样孔将样品加样至凝胶上。以每块凝胶50毫安的恒定电流进行电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。

电泳结束后，将凝胶置于洗脱缓冲液中平衡10分钟。根据仪器制造商的说明，将凝胶转移至全胶洗脱装置中。以250毫安的恒定电流运行洗脱装置1小时，从凝胶中洗脱蛋白质，然后使用真空泵从凝胶中收集约30份蛋白组分，每份体积为3毫升。

使用二喹啉甲酸蛋白测定法对洗脱组分中的蛋白浓度进行定量。取10微克洗脱的蛋白组分进行SDS-PAGE分析，并通过考马斯亮蓝染色观察条带。在结核分枝杆菌的第一上清液：细胞壁、细胞膜和细胞质组分中观察到明显的蛋白质条带模式，证实亚细胞分级分离成功。

细胞壁蛋白的等电聚焦显示，pH 低于 2.5 的组分中蛋白浓度最高。细胞壁 IEF 组分的 SDS-PAGE 分析揭示了明显的蛋白条带，主要集中在第 1 至第 8 组分。通过 IEF 分离细胞膜蛋白，发现主要的蛋白浓度峰位于 pH 4 至 pH 10 之间，其中最高浓度出现在 pH 10 左右。

细胞膜 IEF 组分的 SDS-PAGE 显示出多样的蛋白质谱型，其中第 1 至第 9 组分的条带更为清晰。对 IEF 分离的细胞壁蛋白质进行制备型 SDS-PAGE 分离，所得组分浓度主要低于每毫升 100 微克。洗脱的细胞壁蛋白质组分的 SDS-PAGE 显示出广泛的蛋白质分子量分布，其中第 6 至第 10 组分的条带更为集中。

细胞膜蛋白组分的制备型SDS-PAGE结果显示，超过一半的组分蛋白浓度介于50至199微克/毫升之间。洗脱的细胞膜蛋白组分的SDS-PAGE结果显示，在第1至8泳道以及第13至16泳道中出现浓集的蛋白条带。