用于空间转录组学分析的斑马鱼幼鱼切片空间紧凑排列

在 Morhardt 实验室，我们使用斑马鱼作为动物模型来研究膀胱发育和功能。我们已经确定了一种功能性膀胱，它可以在斑马鱼中填充和排空。虽然斑马鱼很小，但我们试图利用它的大小来经济地利用空间转录组技术和我们对脊椎动物膀胱的理解。

如果试剂和设备没有得到优化，空间转录组学技术很快就会变得昂贵。该协议提供了一种经过验证的技术来使用 zebrafish 来实现这一目标，并提供了对预期结果和缓解该技术可能出现的问题的见解。除了经济地利用昂贵的空间转录组学技术外，这项工作还使我们能够对几个年龄的基本上整个器官进行大规模的空间转录组学分析，同时最大限度地减少批次效应。

首先，将低温恒温器冷却至 22 摄氏度并收集所有需要的物品。准备用于样品对齐的一次性塑料模具。在基模内侧放置一块实验室胶带，并用永久性记号笔作为参考点在其上画一条直线。

标记基模内部，以确保在冷冻切片过程中样品方向正确。灌注冷冻培养基瓶的喷嘴后，将必要的量分配到基模的一个角落中。慢慢倾斜基模以均匀分布介质。

现在，将带有冷冻培养基的基模放入冰浴中，孵育至少 10 分钟以冷却培养基。接下来，将一份 100% 乙醇添加到通风橱下冰桶中的一份干冰中。将一次性铝盘或铝船放入冰浴中，盖上桶盖 5 到 10 分钟。

将安乐死的鱼浸入 4 摄氏度的水中 10 分钟后收集。使用细尖镊子抓住尾鳍以取出鱼，然后将其轻轻压在吸水无绒湿巾上以使其干燥。将准备好的基模放在放大 10 倍的立体显微镜下。

将样品沿参考点以正确的方向放置在模具中。用另一层薄薄的冷冻介质轻轻覆盖样品。使用解剖参考点将鱼精确对准基模内的标记线，并使用细尖镊子调整方向，避免气泡。

将一块干冰涂在样品下方的基模底部，直到它局部冻结到位。在完全冻结之前，保持水平面以防止样品错位。现在将装有样品的基模放在干冰和乙醇浴中的铝船或盘子上。

确保船保持漂浮在水面上，并且基模保持干燥。盖上浴槽，让样品冷冻 10 分钟。接下来，用箔纸包裹冷冻的底模，并将其存放在 80 摄氏度的冰箱中，直到准备好切片。

将冷冻的底模带到预冷的低温恒温器中进行低温切片，然后将其放入低温恒温器室中。从仓库中取出空间成像载玻片后，将其放入预冷的载玻片架中。将载玻片架与空间成像载玻片一起存放在 22 摄氏度低温恒温器室中，直到准备好进行切片收集。

现在，从基模中取出冷冻样品，并将其放入装有新鲜冷冻介质的卡盘中，确保切割表面面向切片机刀片。然后将新鲜的精细切片机刀片放入低温恒温器中。将模具与刀片对齐后，用 20 到 50 微米的推荐厚度修剪感兴趣的区域。

确保模具内的标记转移到冻结块上，以便正确定位样品。在修整过程中调整模具，使切割表面保持与冷冻介质中的参考标记平行。从冷冻块中切片并收集到带正电荷的标准显微镜载玻片上。

在明场显微镜下检查切片，以确认修剪已完成。然后从低温恒温器中取出空间成像载玻片，将其放入 4 摄氏度的冰浴中，同时将其放在载玻片支架内。以推荐的 10 至 14 微米厚度开始冷冻切片。

将切片收集到带正电荷的玻片上，直到到达感兴趣的区域。现在从冰浴中取出单细胞空间成像载玻片，并从支架中取出载玻片。使用细尖画笔逐行收集部分，以防止滚动。

然后用画笔的背面将空冷冻介质的一角压在刀台上。使用滑轨的顶部作为枢轴点，慢慢地将滑轨降低到该部分上，让它粘附三秒钟，然后再抬起。将连续部分彼此平行排列，以最大限度地利用载玻片上的空间。

从感兴趣区域收集切片后，将玻片放回玻片支架中。如果不需要更多样品，请在分析前将玻片在 80 摄氏度下储存长达两周。将感兴趣区域前后的切片收集到带正电荷的标准显微镜载玻片上，并进行苏木精和伊红染色，以评估样品对齐和切片质量，然后再进行分析。

通过比较同一切割中不同截面的结构来验证多截面对齐。对包埋和收集步骤的调整使更多的切片能够适应空间转录组载玻片的成像区域。由于信号复杂性低，组织区域内的空间转录组信号质量较高，但在空载玻片区域内较低。