原位 分离与培养难培养土壤细菌的分离芯片（iChip）方法

在土壤、水体和极端环境等不同的自然环境中存在着丰富的微生物资源库。然而，由于实验室培养方法和培养基的限制，获取这些丰富的生物多样性在很大程度上受到制约。若能突破这一培养障碍并充分挖掘这些生物多样性，将有望满足多种生物技术需求，并应对全球性挑战。

例如，抗微生物耐药性的发展已成为全球公共卫生的重大威胁。在实验室中难以培养的土壤细菌可能产生具有强效抗微生物活性的新型生物活性化合物，这些化合物在应对抗微生物系统全球性挑战方面具有重要价值。由于传统的基于实验室培养的技术往往只能分离出相似的已知微生物，环境中微生物及其产物的巨大多样性尚未得到充分探索。本实验的目的是展示利用IChip技术在原位高通量培养难培养土壤细菌的方法。在本方案中，我们将演示IChip技术的构建与使用，该技术可用于难培养细菌的高通量原位培养，并以分离产抗微生物物质的细菌作为该技术的应用实例。

[Presenter] 首先，在演示文稿软件中创建分离芯片（IChip）顶板、底板和中层板的初步设计。使用演示文稿软件中的“插入形状”功能，插入具有必要尺寸的圆形，作为IChip的轮廓。在大圆内插入较小的圆形，代表IChip的通道。将这些小圆按所需排列方式布置，完成IChip顶板、底板和中层板的初步设计。选中设计后，通过右键菜单将其另存为图片。以该初步设计为模板，开始使用计算机辅助设计软件创建二维设计。在草图菜单中插入预设形状，主要为圆形，以构建IChip板及通道区域的基本结构。使用尺寸标注功能设定板和通道的实际尺寸。点击“确定”完成设计，然后使用拉伸功能将二维设计转换为具有指定厚度的三维模型。最后，通过文件菜单将三维模型另存为适用于3D打印的立体光刻文件格式（STL格式）。

[Presenter] 准备好土壤样品采集所需的所有必要物品，并前往待采样的地点。打开地理编码移动应用程序，查找采样点唯一的三词地址并记录下来。接下来，记录相关的样品元数据，例如温度、日期、时间、采样深度、天气状况以及采样点暴露于外界环境的情况。用70%乙醇喷洒将用于种植IChip的铁铲和聚苯乙烯盒。用纸巾擦拭干净后，让乙醇自然完全挥发。然后使用已去污染的铁铲清除地表杂物，例如落叶或石块，以暴露表层土壤。再次如前所述对铁铲进行去污染处理。使用铁铲挖掘地下3至6英寸的土壤，从均匀深度转移约4至5 kg土壤至聚苯乙烯盒中。盒子应填充至约75%满。立即将采集的土壤运回实验室。从采集的土壤样品中，称取1克无杂物、石块和落叶的土壤，放入含有10 ml无菌生理盐水的无菌50 ml离心管中。将土壤与生理盐水混合，涡旋振荡约10秒，制成土壤悬液。将离心管静置5分钟，使管中较大的土壤颗粒沉降。然后小心地将上清液土壤悬液转移至标记为S的新试管中。以该土壤悬液作为未稀释样品，通过将1 ml样品转移至另一新试管中的9 ml无菌生理盐水中，进行零稀释操作。依次制备10⁻¹至10⁻⁵梯度的稀释液。在生物安全柜内，将IChip的上板、下板和中板浸泡于70%乙醇中10分钟，进行表面去污染处理。用无菌去离子水清洗IChip组件以去除多余乙醇，并将其置于无菌培养皿中自然晾干。将IChip的中板放入无菌培养皿中，准备接种。在微波炉中融化SMS琼脂培养基，待其冷却后，将22.5 ml 45°C的SMS琼脂转移至无菌50 ml离心管中。向其中加入2.5 ml适当稀释度的土壤样品，轻轻颠倒混匀，避免引入气泡。缓慢倾倒约3至4 ml接种后的SMS琼脂培养基至IChip中板表面，使其完全覆盖。静置约5至10分钟，使SMS琼脂凝固。检查SMS琼脂是否已完全凝固。然后用无菌刀片刮去IChip金属板表面多余的SMS琼脂，仅保留各个扩散室内的琼脂塞。使用无菌镊子，从一张0.03微米聚碳酸酯膜滤膜上移除保护膜后，小心地将其放置于IChip上板内侧。再使用无菌镊子将另一张0.03微米聚碳酸酯膜滤膜放置于已接种的金属板暴露面。将IChip的上板和下板与中板及聚碳酸酯膜一起组装，注意对齐各板上的螺丝孔，完成IChip的组装。拧紧螺母和螺栓以固定IChip组件。使用无菌铁铲在聚苯乙烯盒的土壤收集区挖出一个大于IChip尺寸的凹坑。将IChip组件垂直植入凹坑中，并用土壤紧密填实，确保IChip所有表面均被完全覆盖。随后在原位培养2至4周所需时间。在培养期间，定期使用无菌蒸馏水润湿种植区域周围的土壤及IChip，防止扩散室内的接种SMS琼脂塞干燥。在完成所需培养时间后，轻轻松动IChip周围的土壤以回收装置。随后用无菌生理盐水清洗IChip，去除附着的土壤颗粒，并将其转移至生物安全柜中进行后续处理。松开IChip组件上的螺母和螺栓，小心拆解IChip。使用无菌镊子取下聚碳酸酯膜，并将IChip中板转移至已准备好的培养皿中。使用无菌木制涂布棒回收每个扩散室内的单个琼脂塞。将琼脂塞接种至适当的培养基中，如SMS琼脂或0.1X胰蛋白胨大豆肉汤琼脂，尝试在实验室条件下进行培养。培养获得的分离株可通过常规方法筛选其抗菌活性，例如使用测试菌株进行琼脂覆盖法。此处展示的是从IChip琼脂塞中获得的12个培养物（IC-1至IC-12）对金黄色葡萄球菌ATCC 29213和鲍曼不动杆菌B8342的代表性筛选结果。请注意，培养物IC-6和IC-8分别对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌测试菌株表现出抑菌活性。或者，可对含有原位培养难培养土壤细菌的回收琼脂塞进行染色和成像，以确认在原位条件下微生物微菌落的生长情况。通过该方法，可高通量地在原位回收难培养的土壤细菌。3D打印的IChip可容纳156个琼脂塞。然而，在接种时必须选择合适的稀释度，以确保每个IChip通道中仅接种一个细菌细胞。随后可在实验室条件下筛选目标细菌是否具有所需的生物活性，例如代谢物、酶或生物聚合物的产生等。然而，也可能存在部分细菌在实验室条件下无法生长，在此类情况下，需采用宏基因组学方法以确认微生物的存在并挖掘其生物合成潜力。该方法操作简便，稍作修改即可广泛应用于不同环境条件下的微生物生物勘探。