Name: 使用 ARL13B-CENTRIN-2 小鼠模型对肌肉骨骼组织中原代纤毛进行体积成像和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解利用ARL13B-CENTRIN-2转基因小鼠模型对生长板中原代纤毛进行三维体积成像和分析的实验方法。该技术可精确绘制纤毛空间分布与组织形态发生的关系。

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我们感谢肯尼迪风湿病学研究所BSU工作人员的所有成员，特别是Albertino Bonifacio，在动物饲养方面提供的支持。我们感谢牛津-蔡司生物医学成像卓越中心在显微镜使用方面提供的帮助，特别是Dr. Jacky (Ka Long) Ko在图像分析流程开发中的协助。本工作得到了风湿病学研究肯尼迪基金会研究生奖学金（Johnson）以及生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC, BB/X007049/1）的资助。

动物饲养和实验均按照牛津大学伦理框架进行，并在英国政府内政部颁发的项目许可证下实施。本方案适用于2至10周龄小鼠，但也可用于此年龄范围以外小鼠的软骨组织。
1. 组织采集
<ol>
	<li>将小鼠置于密闭盒内，通入二氧化碳至体积浓度达80%，维持该浓度5分钟，以实施安乐死。随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>取出目标组织。 
	注意：以下为后肢膝关节的解剖方案，包括胫骨和股骨生长板以及关节软骨。
	<ol>
		<li>从足部开始沿腿部纵向切开皮肤，直至大腿顶端。用镊子从切口处剥离皮肤。</li>
		<li>剔除腿部的肌肉和脂肪组织。</li>
		<li>在髋部顶端干净利落地切断股骨，以将后肢与身体分离；在胫骨下端切断足部。</li>
		<li>清除腿部残留的多余肌肉和脂肪组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织固定与包埋
注意：在整个实验过程中，需将组织置于避光条件下，以避免荧光信号丢失。
<ol>
	<li>在室温下用 10% 甲醛固定组织 4 小时。</li>
	<li>将组织转移至 2.5% 甲醛中，于 4 °C 过夜。</li>
	<li>将组织转移至含 30% 蔗糖的蒸馏水（dH2O）中，室温下轻轻旋转过夜，或在 4 °C 下旋转 3 天。将试管装满液体，以确保旋转过程中组织完全浸没。孵育完成后，组织会沉入试管底部。</li>
	<li>在另一个盒子中放置少量干冰，并将冷冻模具置于其上。沿模具表面涂一条超低温冷冻包埋介质（SCEM），然后将肢体沿该线放置，髌骨朝下，并将胫骨和股骨分开，使腿部尽可能平展。用镊子固定肢体，直至 SCEM 开始凝固，且肢体在松开后不再移动。</li>
	<li>用 SCEM 完全覆盖组织，将模具填满至顶部。将样本放入干冰盒中，保持样本水平，防止组织移动，直至 SCEM 完全凝固。</li>
	<li>转移至 -20 °C 保存。</li>
</ol>
3. 切片
<ol>
	<li>从模具中取出包埋块，并修整至适合固定在冷冻切片机载物台上的大小。在载物台上涂抹SCEM，将包埋块置于其上并固定。</li>
	<li>在冷冻切片机内 -20 °C 条件下静置至少 5 分钟，使其充分固化。</li>
	<li>将载物台安装到样品架上，并将刀片固定于刀片架中。</li>
	<li>修切包埋块直至暴露胫骨生长板区域。理想情况下，切片时应使胫骨朝上。</li>
	<li>将冷冻切片支持膜（cryofilm tape）裁剪至合适尺寸，确保其能覆盖样品并留有足够边缘空间。将支持膜贴附于切面上，使用贴合工具确保其紧密粘附。切取厚度为 40–60 µm 的切片，以获得约两个细胞厚度的组织切片。用镊子取下贴有切片的膜，放置于载玻片上，样品面朝上，且使胫骨生长板与载玻片的短边对齐。</li>
	<li>将载有样品的载玻片置于 -20 °C 环境中保存。</li>
</ol>
4. 载玻片制备与封片
<ol>
	<li>将载玻片水平放置于室温下解冻。</li>
	<li>用一滴 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次，以去除 SCEM。</li>
	<li>用 10 µM DAPI 染色 1 分钟。</li>
	<li>用一滴 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 2 次。</li>
	<li>封片，盖上盖玻片，室温放置过夜。用盖玻片封固剂密封盖玻片边缘。</li>
	<li>次日进行成像。</li>
</ol>
5. 共聚焦显微镜成像
注意：所用共聚焦显微镜上40倍/1.4数值孔径物镜的分辨率为240 nm。
<ol>
	<li>设置显微镜。
	<ol>
		<li>打开显微镜并启动软件。点击 系统 按钮</li>
		<li>在……之下 采集 标签，单击 智能设置 设置通道。选择并添加 GFP、mCherry 和 DAPI 通道。选择 Airyscan 选项和 SR8Y Airyscan 三角形中的功能（分辨率与速度-多路复用 8Y 之间）。单击 最佳信号 | 正常 (补充图 S1A).</li>
		<li>在 定位 标签，位于下方 显微镜控制，选择 40倍/1.4数值孔径油镜物镜.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位目标区域。
	<ol>
		<li>将载玻片放入载物台夹持器中，并升起物镜，直至油滴接触盖玻片。</li>
		<li>将生长板或其他感兴趣区域置于光路下方。</li>
		<li>在 定位 标签，点击 荧光，选择 DAPI,&#160;使用目镜，通过操纵杆移动载物台，将生长板或感兴趣区域置于视野下方。</li>
		<li>在 采集 标签，首先选择 DAPI 通道 仅。</li>
		<li>点击 连续的 在屏幕上查看该通道的图像，并确保生长板可见。</li>
		<li>打开 平铺视图器 通过点击 显示查看器 在 瓷砖 添加所需的瓦片数量（通常 x 方向 1 块，y 方向 3-5 块），然后单击 预览 和 开始 (补充图 S1B).</li>
		<li>检查切片是否覆盖生长板的三个区域：静止区、增殖区和肥大区。调整 瓷砖位置 和 数量 根据需要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置成像参数。
	<ol>
		<li>点击 连续的 在 采集 表。在 通道 标签，调节 增益（主控） 和 激光功率 以在屏幕上清晰地观察细胞核。等待Airyscan探测器完成校准。打开 Airyscan探测器调节 通过点击窗口底部的平铺花形符号来激活窗口；对齐完成后，所有图块将变为绿色补充图 S1C).</li>
		<li>选择 GFP 和 mCherry 分别对各个通道执行上述步骤并重复这些操作——设置 增益（主控），激光功率，并对齐 Airyscan检测器.</li>
		<li>同时选择所有三个通道，然后点击“连续”。等待Airyscan探测器完成校准。</li>
		<li>在 采集模式 标签，定义 图像尺寸、像素、尺寸、帧大小、速度，以及 平均值计算参见 补充图 S1D,E 对于……的值 采集模式 设置, 增益（主控），以及 激光功率 用于通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取图像。
	<ol>
		<li>在 采集 标签，单击 Z轴层扫 复选框</li>
		<li>仅选择 DAPI 通道后，单击 连续的 在屏幕上查看图像。将物镜移至最接近待成像平面的位置。在 Z轴层扫 标签，点击 设置初始值 平面，将焦点移至最后一个要观察的平面，然后单击 设置为最后 平面。采集30-40 µm的z轴层扫图像。</li>
		<li>设置 间隔 到 0.15 µm.</li>
		<li>移动到z轴堆栈的中心。在 瓷砖 标签，位于下方 平铺区域，点击 验证 并点击 设置 Z &amp;#38; 移至下一步.</li>
		<li>在……之下 聚焦策略 标签，检查对焦策略是否已设置为 使用在图块设置中定义的Z值/焦平面.</li>
		<li>点击 开始实验 开始图像采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像处理
	<ol>
		<li>在“处理”选项卡中，选择 单个 或 批次 模式。选择 Airyscan 处理蜱虫 3D 处理 并选择 标准自动过滤器. 选择&#160;原始图像采集并开始处理（补充图 S2A).</li>
		<li>Airyscan 处理完成后，选择 拼接 在加工方法中。选择 新输出，拼接图块，校正着色，以及 全部通过引用，以 DAPI 为参照。选择 Airyscan 处理后的图像并开始处理（补充图 S2B).</li>
		<li>保存原始图像和双重处理后的图像。后者将自动保存 批次 模式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 图像分析
注意：此处使用的分析流程是根据本研究的目的定制的。该流程操作的详细信息见补充图S3。
<ol>
	<li>将 czi 图像文件导入软件。打开分析面板，在下拉菜单中选择 新建流程…</li>
	<li>要创建细胞检测流程，请将 Cellpose Python 分割器导入流程中12。将 Model_Name 设置为 cyto2，Input_channel 设置为 2，Second_channel 设置为 3，Diameter_in_µm 设置为 10，Flow_threshold 设置为 0.4，Cellprob_threshold 设置为 0。在流程前添加一个 导入文档对象（重命名为 导入&#160;手动标签），并在流程后添加一个 对象特征过滤器（重命名为大小过滤器）操作符，方法是点击 + 添加操作。流程设置参数值见 补充图 S3A。
	<ol>
		<li>将视图移动到第一个感兴趣平面</li>
		<li>点击 绘制对象工具 图标</li>
		<li>点击 多边形模式 图标</li>
		<li>绘制待分析区域</li>
		<li>将视图移动到最后一个感兴趣平面</li>
		<li>绘制待分析区域</li>
		<li>点击绿色对勾 应用更改</li>
		<li>点击 显示对象表 图标</li>
		<li>右键单击所创建的对象，选择 重命名对象 以将其重命名为合适的名称。再次右键单击该对象，点击 添加标签，并添加名为“分析区域”的标签。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过点击 分析 面板顶部的 向前蓝色箭头 运行此流程。</li>
	<li>要创建初级纤毛和中心粒检测流程，请打开分析面板，在下拉菜单中选择 新建流程…。向流程中添加以下操作符：导入文档对象（重命名为 导入手动标签）、两个 强度阈值分割器&#160;操作符（分别重命名为 纤毛阈值 和 中心粒阈值）、分裂 （重命名为 中心粒分裂）、对象特征过滤器（重命名为 中心粒分裂大小过滤器）以及 区室 （重命名为 区室 - 细胞）。流程设置参数值见 补充图 S3B。</li>
	<li>通过点击 分析面板 顶部的 向前蓝色箭头 运行此流程。</li>
	<li>打开 对象 窗口。点击 导入/导出…，选择 Excel 导出…。选择以下特征进行保存：# 子对象数、名称、父对象名称、三维定向边界短边、中边、长边、角度 XY、角度 XZ、角度 YZ、包围盒 X1、X2、Y1、Y2、Z1、Z2、SizeX、SizeY、SizeZ、几何中心 X、Y、Z、起始平面、终止平面、计数、球形度（网格）、体积（网格）、表面积（网格）。</li>
</ol>

<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本实验方案中，组织样本采集后必须立即进行组织处理和包埋步骤。然而，组织块和组织切片可在 -20 °C 下保存至少 3 个月。本方案中的多个步骤可根据不同应用进行调整，特别是切片厚度、放大倍数和 z 轴层扫参数。这些调整将影响成像深度和获得的分辨率。通过改变数值孔径和分辨率模式，可以获得更高的分辨率，并减小 z 轴层扫的间隔尺寸。然而，这将增加成像时间，或减小可成像的视野范围。文中所述成像参数是进行初级纤毛方向三维分析所确定的最低要求。
选择封片介质对于获得高分辨率图像至关重要。封片介质的折射率必须与浸油介质的折射率相近，以尽量减少z轴堆叠成像中的图像退化。本实验所用封片介质和浸油的折射率分别为1.52和1.518。本实验所用共聚焦显微镜的Airyscan功能可提供超分辨率图像。虽然也可使用其他超分辨率显微镜，但我们发现仅使用共聚焦模式无法满足所成像区域尺寸所需的分辨率。Multiplex SR-8Y Airyscan模式在x/y方向上的最高分辨率为120/160 nm，z方向为450 nm，最大帧速率为每秒47.5帧。我们发现Multiplex SR-4Y Airyscan模式（x/y方向最高分辨率为140 nm，z方向为450 nm）虽然在空间分辨率上略有降低，但成像速度减半，最大帧速率为每秒25帧，对于三维成像观察初级纤毛并未表现出显著优势。同样，Airyscan超分辨率（SR）模式虽为该显微镜上分辨率最高的模式（x/y方向120 nm，z方向350 nm），但其最大帧速率仅为每秒4.7帧，成像耗时更长13。
在其他组织（如肌肉）中可观察到背景 GFP 信号。为尽量减少此现象，可缩小激光的波长范围，以减少与其他波长的重叠。该品系此前已被用于胚胎、原代细胞培养、肌纤维以及视网膜色素上皮中初级纤毛的成像9,14,15。我们已成功对肾脏、软骨和骨组织中的初级纤毛进行成像。不同组织可能需要对成像参数进行一定程度的优化；然而，本冷冻切片方案应能确保信号的有效保存。
厚度为两层细胞（40–60 µm）的切片足以获取生长板中细胞的三维取向信息，因为该厚度允许对完整细胞及其初级纤毛进行成像。对于细胞体积大于软骨细胞的其他组织（例如脂肪细胞），可能需要更厚的切片以收集细胞群体数据。根据所用显微镜的深度分辨率，可能无法对较厚切片的深层区域进行有效成像。组织透明化技术可能因耗时较长而导致内源性mCherry和GFP信号丢失。尽管在肢体其他成像实验中曾尝试使用透明化方法，但本研究中发现其并非必要。我们对内源性CD31-RFP的实验经验表明，透明化技术需要针对样本进行细致且定制化的优化。
该 ARL13B-CENTRIN-2 小鼠品系可与其他小鼠品系杂交，以进一步研究组织中初级纤毛的结构组织。例如，我们已将其与 aggrecan-Cre IFT88fl/fl 小鼠品系杂交，从而在表达聚集蛋白聚糖的细胞（出生后软骨细胞）中条件性敲除 IFT88——一种初级纤毛蛋白，其缺失会阻止纤毛的形成5,6。随后可利用这些 ARL13B 和 CENTRIN-2 的荧光信号，在组织水平上评估基因干扰对纤毛结构的影响效率，以及纤毛组织相关的任何变化。目前正在进行的研究正是采用这一策略。我们的首要目标是利用这种更为可靠的方法，定量分析 IFT88 缺失对纤毛存在率的影响。此前，我们通过免疫荧光方法估算该影响约为减少 20%6。该方法还可与免疫组织化学结合使用，以同时成像初级纤毛及其他蛋白（例如细胞膜蛋白）的表达情况。
ARL13B 上的转基因可能影响 ARL13B 的表达以及初级纤毛的长度。先前的研究发现，在小鼠大脑某些区域，ARL13B-CENTRIN-2 品系与非转基因 ARL13B 相比，初级纤毛长度存在差异，而在其他区域则无显著差异16。另一项研究观察到，在表达 GFP 标签的 ARL13B 小鼠品系中，小鼠胚胎成纤维细胞的初级纤毛长度与未标记 ARL13B 存在差异10。目前正在进行的研究正通过比较 ARL13B-CENTRIN-2 小鼠品系与针对非转基因 ARL13B 的抗体染色结果，验证生长板及其他组织中初级纤毛长度是否发生变化。
本方案中的图像分析流程旨在依次测量生长板中初级纤毛的纤毛化百分比、长度和三维方向，以及中心粒的数量和位置。图像分析软件允许通过更改步骤来创建自定义流程。该流程的输出结果为一个电子表格，其中包含所检测到的细胞、纤毛和中心粒的选定特征的测量数据。后续分析可根据研究目的在 R 或其他软件中进行。与成像参数一样，该流程的步骤和具体设置也可根据不同的图像和研究目标进行调整。总体而言，该方法实现了比以往在生长板中发表的更高通量的初级纤毛分析，可研究的细胞及其相关纤毛数量更多，从而获得更大量且更可靠的测量结果。

初级纤毛是多种组织和器官（包括骨骼）发育和稳态维持所必需的细胞器。在出生后生长过程中，初级纤毛调控软骨内成骨过程中的软骨矿化1。在人类中，影响纤毛相关蛋白的基因突变会导致一系列疾病和发育障碍，统称为纤毛病2,3,4。了解初级纤毛在组织内部的结构组织对于理解其在器官水平上如何调控细胞行为具有重要意义。研究表明，初级纤毛的发生频率、长度和取向在不同组织之间以及同一组织内部均存在差异，提示组织结构可能影响其功能。生长板是长骨末端的一层软骨，是自幼年至青春期大部分出生后骨骼生长发生的部位，属于高度有序的组织，其中软骨细胞呈柱状排列。在生长板中，软骨细胞经历从静止期到增殖期再到肥大期的分化过程。
这种细胞排列结构在某些纤毛病变中会丧失，这提示初级纤毛可能在协调该细胞排列结构中发挥作用，和/或至少与细胞极性相关。此外，初级纤毛的方向似乎影响其机械感受功能，在关节软骨的承重区与非承重区之间已观察到差异4。我们近期的研究进一步提示，初级纤毛在关节软骨不同区域以及生长板中可能具有不同的功能5,6。以往对生长板中初级纤毛的成像研究仅限于二维（2D）层面，导致纤毛在组织中的空间排列信息丢失；或仅限于三维（3D）中少量细胞的分析，从而降低了研究的规模和统计效力7,8。
成像初级纤毛的主要挑战包括其微米级的尺寸以及免疫组织化学抗体的非特异性。利用内源性荧光信号可确保良好的定位性和特异性。然而，在矿化组织中成像内源性荧光信号可能较为困难，因为将组织包埋于石蜡所需的长时间脱钙过程可能导致信号丢失。将处于天然状态的样本进行速冻并进行冷冻切片，可通过加快包埋和切片过程来避免这种信号损失。
成像初级纤毛 原位由 Bangs 等人构建了一种双转基因小鼠品系，该品系表达与 mCherry 融合的ADP核糖基化因子样蛋白（ARL13B）以及与GFP融合的CENTRIN-29ARL13B 是一种定位于初级纤毛膜的小分子GTP酶，CENTRIN-2 是一种定位于纤毛基部两个中心粒的中心粒蛋白10,11因此，该小鼠品系无需免疫组织化学染色即可实现荧光标记的初级纤毛成像。
本方案利用该转基因品系，结合共聚焦显微镜对小鼠出生后生长板中的初级纤毛进行三维成像，仅需额外进行4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。可在组织背景下对数百个细胞中的数百条初级纤毛进行成像并集体分析。随后的图像分析流程可测量生长板不同区域中初级纤毛的发生率、长度和取向。该流程还可对中心粒的这些特征进行定量分析。本方案各步骤概要见图1。

<table><tbody><tr><td>22 x 50 mm 盖玻片</td><td>fisherscientific&amp;nbsp;</td><td>12373128</td><td></td></tr><tr><td>arivis Vision4D 软件</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>图像分析软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip 盖玻片封片剂&amp;nbsp;</td><td>Biotium&amp;nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm 3C型(16UF)（片状）2.0 cm 宽度</td><td>Section-lab</td><td>C-FUF303</td><td>需直接从 Section-lab 购买</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模&amp;nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件&amp;nbsp;</td><td>Oxford Instruments&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>用于三维重建的图像分析软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>浸油 518F</td><td>Zeiss</td><td>ISO 8036&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>切片刀片（一次性）</td><td>Feather</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass 抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>超低温包埋介质（SCEM）</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>需直接从 Section-lab 购买</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen 软件</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>共聚焦激光扫描显微镜免费软件</td></tr></tbody></table>

利用arl13b-centrin-2小鼠模型对肌肉骨骼组织中初级纤毛的三维成像与分析

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

初级纤毛是一种非运动性的单一细胞器，由大多数细胞类型组装而成。它在骨骼的发育与稳态维持中起关键作用，并参与协调细胞对周围环境中生化和机械信号的响应。由于其尺寸仅为微米级，初级纤毛的成像具有较大挑战性 原位 以高通量方式且无光学偏差地在组织中进行表征。理解其在三维环境中的结构组织 体内 对于理解纤毛在生理和疾病中的作用至关重要。ARL13B-CENTRIN-2 小鼠品系在纤毛轴丝蛋白 ARL13B 上带有 mCherry 标签，同时在定位于纤毛基部的中心粒蛋白 CENTRIN-2 上带有绿色荧光蛋白（GFP）标签。该小鼠品系无需染色即可实现初级纤毛的成像，从而减少了图像采集的步骤，并避免了信噪比相关的问题。本文介绍了一种在保持荧光信号完整的前提下，对肌肉骨骼组织中初级纤毛进行成像的逐步操作方案。同时描述了一种具有普适性的图像分析流程，可实现对纤毛特征（如长度和三维取向）的无偏定量分析。

采用所述方案对6周龄小鼠的生长板进行成像，并绘制了组织中初级纤毛的排列图。获取了生长板全部三个区域——静止区、增殖区和肥大区——的图像，并通过分析流程进行处理（图2A）。通过DAPI染色可识别单个细胞，其中纤毛轴丝显示为红色，中心粒显示为绿色。该方法的分辨率足以区分单个中心粒（图2B）。在此分辨率下，可在其三维环境中观察纤毛，并可见其指向不同方向（视频1）。
使用更高倍数的物镜拍摄较低分辨率的图像，也可以用于观察组织较大区域内的初级纤毛；然而，这些图像不适合进行三维方向上的纤毛取向分析。例如，使用20倍物镜对关节软骨中的初级纤毛进行成像，表明该方法同样适用于其他组织（图2C）。在此分辨率下，可以识别出呈红色的纤毛轴丝，但中心粒更难以分辨。软骨下骨组织通常存在较强的GFP背景信号，使得该组织中中心粒的识别较为困难。
该流程能够检测单个细胞、初级纤毛和中心粒，适用于高度有序的年轻生长板以及细胞柱排列较不明显的较老生长板，例如10周龄小鼠的生长板（图3）。细胞和纤毛可在三维空间中被检测，可通过z轴层扫描图像进行观察。
<img alt="组织处理工作流程：采集、固定、切片、显微镜成像、分析；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：实验工作流程。 从组织采集到图像分析的实验方案各步骤流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞核分布和蛋白质表达分析的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：ARL13B-CENTRIN-2 小鼠中多种小鼠组织中的初级纤毛。（A）6 周龄小鼠生长板组织，DAPI 染色显示为白色，CENTRIN-2 显示为绿色，ARL13B 显示为红色，使用 40 倍物镜成像。（B）单个初级纤毛及其两个中心粒的放大图像。（C）4 周龄小鼠的关节软骨和软骨下骨组织，使用 20 倍物镜成像。（D）6 周龄小鼠肾脏组织，采用与肌肉骨骼组织相同的成像流程进行成像。（E）图 D 中白色方框区域的放大图像，显示肾脏中单个初级纤毛及其中心粒。比例尺 = 20 µm（A,D），4 µm（B），60 µm（C），6 µm（E）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞与纤毛检测示意图；细胞分割与纤毛方向性分析的显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：细胞与纤毛检测流程。在10周龄生长板上应用图像分析流程的示例。(A) 在软件中打开的图像。(B) 细胞检测流程的结果。(C) 纤毛与中心粒检测流程的结果。纤毛显示为粉红色，中心粒为绿色。侧面视图表明，分辨率足够高，能够在三维空间中区分不同方向的纤毛。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：ARL13B-CENTRIN-2 小鼠 6 周龄生长板的三维重建。 三维重建在 Imaris 软件中完成，并以动画视频形式记录。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充图 S1：显微镜系统上的图像采集设置。（A）Smart Setup 窗口，用于添加通道并选择 Airyscan 模式。（B）瓷砖视图，用于选择并预览待成像的图像区域。（C）Airyscan Detector Adjustment 窗口，在所有瓷砖变为绿色后确认 Airyscan 探测器的对齐状态。（D）三个通道的激光设置。（E）采集模式 和 Z 轴层叠设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2：显微镜系统的图像处理设置。（A）Airyscan 处理设置。（B）图像拼接设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S3：自定义图像分析流程。（A）使用 GFP 和 DAPI 通道进行细胞检测的流程。（B）分别使用 mCherry 和 GFP 通道进行初级纤毛和中心粒检测的流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

该方法描述了利用ARL13B-CENTRIN-2转基因小鼠模型中的内源性信号对初级纤毛进行成像的技术 原位，可在大范围矿化组织中从组织采集到纤毛排列的分析，进行三维观察。该方案也可应用于其他类型的组织。

利用ARL13B-CENTRIN-2小鼠模型对肌肉骨骼组织中初级纤毛的三维成像与分析

初级纤毛是一种非运动性的单一细胞器，由大多数细胞类型组装而成。它在骨骼的发育和稳态维持中起着至关重要的作用……

为了更好地理解肢体的生长过程，我们研究了初级纤毛——一种在调控细胞对环境响应中起关键作用的细胞器。为了探究初级纤毛在生长过程中的作用，我们正在对生长板内的纤毛进行成像，生长板是新骨组织生长的软骨层。初级纤毛极其微小，长度不足五微米，这使得对其成像具有挑战性，尤其是在三维成像方面。在富含基质且部分钙化的组织（如软骨和骨）中对其进行成像，使得准确探究其存在，更不用说其位置、方向和大小，变得更加困难。我们能够绘制出生长板内所有细胞中初级纤毛的三维结构，进而探究患病细胞是否组装了初级纤毛，以及其组装位置和方向相对于组织形态发生如何。此前，初级纤毛在生长板中的研究仅限于二维层面，或仅针对极少数细胞进行。纤毛和中心粒的内源性荧光信号具有高信噪比，可确保纤毛鉴定的可靠性，并避免了免疫组织化学染色的需要。该方案还允许对组织中数百根纤毛进行高通量集体成像，使我们能够将纤毛在空间上与正在研究的形态发生事件相关联。这种成像与分析方法可应用于其他组织，以绘制原纤毛在不同组织和器官中的分布图谱。这将有助于更深入地理解初级纤毛结构与功能之间的关联。首先，取准备好的小鼠组织冷冻切片，将载玻片水平放置于室温下使其解冻。用一滴 PBS 清洗载玻片，每次五分钟，共洗三次，以去除包埋剂。将10微摩尔的DAPI溶液滴加到载玻片上，染色1分钟。然后将样品封片，盖上盖玻片，并在室温下放置过夜。使用盖玻片封片剂密封盖玻片的边缘。设置共聚焦显微镜时，先打开显微镜，启动软件，然后点击系统按钮。在采集选项卡下，点击智能设置以配置通道，并添加 GFP、mCherry 和 DAPI 通道。然后从分辨率与速度之间的 ARI 扫描三角中选择 ARI 扫描选项和 sR8-Y 函数。单击“最佳信号”，然后单击“确定”以确认。在显微镜控制下的“定位”选项卡中，选择40倍、数值孔径1.4的油浸物镜。接下来，将玻片放入玻片架中，并升起物镜，直至油接触盖玻片。然后将生长板或其他感兴趣区域置于光路下方。在“定位”选项卡中，点击“荧光”并选择 DAPI。通过目镜观察，使用操纵杆移动载玻片架，使生长板或感兴趣区域位于视野范围内。在“采集”选项卡中，仅选择 DAPI 通道。单击“连续采集”以在屏幕上查看 DAPI 通道的图像，并确保生长板可见。要打开拼接图像查看器，请在“拼接”选项卡中单击“显示查看器”。添加所需数量的图块，通常在 X 方向添加一个图块，在 Y 方向添加三至五个图块。然后点击“预览”和“开始”。现在检查图块是否覆盖了生长板的三个区域：静止区、增殖区和肥大区。如有必要，调整图块位置和数量。要设置图像参数，请在采集选项卡中点击连续。为对齐 ARI 扫描探测器，请点击底部的平铺玫瑰符号，打开 ARI 扫描探测器调整窗口。等待所有方块均变为绿色。在“通道”选项卡中，调节增益主控和激光功率，以在屏幕上清晰地观察到细胞核。接着，选择所有三个通道，然后单击“连续”以开始成像。等待 ARI 扫描检测器完成对齐。在采集模式选项卡中，设置图像大小、像素大小、帧大小、扫描速度和平均值。在采集选项卡中，选中 Z-Stack 复选框以启用 Z 轴层扫成像。然后仅选择 DAPI 通道，点击连续以在屏幕上查看图像。将物镜向下移动至最接近待成像的焦平面。在 Z-栈选项卡中，点击设置第一平面，然后调焦至待观察的最末平面，再点击设置最后一平面，以设定成像范围。将Z轴层间间距设置为0.15微米。移动至Z轴堆叠成像范围的中心位置。在“Tile Regions”下的“Tiles”选项卡中，依次点击“Verify”和“Set Z and Move to Next”。现在，在“对焦策略”选项卡中，确认对焦策略设置为使用在图块设置中定义的Z值和对焦平面。然后点击“开始实验”以开始图像采集。要处理图像，请转到“图像处理”选项卡，选择单次或批量模式，选择ARI扫描处理，勾选3D处理选项，并选择标准自动滤波器。选择获取的原始图像并开始处理。完成ARI扫描处理后，在处理方法中选择拼接。选择新建输出、融合图块、校正明暗不均，并以DAPI为参考选择全部参考校正。选择经过 ARI 扫描处理的图像，并开始拼接过程。首先，将获取的 CZI 图像文件导入软件并打开分析面板。在下拉菜单中，选择新建流程。使用“添加操作”按钮将运算符添加到流程中。要创建细胞检测流程，请将细胞后处理 Python 分割器导入流程。将模型名称设置为 Cyto 2，输入通道设置为 2，第二通道设置为 3，直径设置为 10 微米。将流阈值设为 0.4，细胞概率阈值设为 0。接着，在管道前添加一个导入文档对象操作符，并将其重命名为“导入手动标签”。然后在管道后添加一个对象特征筛选操作符，并将其重命名为“大小筛选”。使用多边形工具在第一平面和最后一个平面上绘制感兴趣区域。重命名所创建的对象并添加标签。单击分析面板顶部的向前蓝色箭头以运行流程。要创建初级纤毛和中心粒检测流程，请打开分析面板，从下拉菜单中选择新建流程。将导入文档对象、两个阈值操作、分割、对象、特征、过滤和区室等算子添加到流程中并进行调整。然后点击分析面板顶部的蓝色前进箭头以运行该流程。打开“对象”窗口，选择包含细胞、初级纤毛和中心粒的对象（此处命名为 compartment cell），然后点击“导入/导出”。选择“导出至 Excel”。选择要保存的特征，包括子代数量、名称、父代名称、三维定向包围盒短边、中边、长边、XY 角度、XZ 角度、YZ 角度、包围盒 X1、X2、Y1、Y2、Z1、Z2、X 尺寸、Y 尺寸、Z 尺寸、几何中心 X、Y、Z、平面起始、终止、计数、网格、体积网格和表面积网格。成功绘制了六周龄小鼠生长板中初级纤毛的组织结构。高分辨率成像展示了在三维环境中可视化单个中心粒和初级纤毛的能力。通过图像分析流程在三维空间中检测细胞和初级纤毛，该流程能够区分侧向与向后指向的初级纤毛。

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科研

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生物学

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