颅神经嵴细胞三维培养 体外 多重检测的分化方案

我们致力于研究特定决策在发育过程中是如何被调控的。类器官模型和单细胞组学技术使我们能够提出以往无法探究的问题。利用体外类器官模型，我们可以获得更大量的数据，尤其是针对神经嵴等短暂存在的细胞群体。

模型输出的显著变异性仍然是一个主要的实验挑战。我们已证明颅嵴细胞会重新表达多能性基因，以扩展其分化潜能。首先，在DMEM敲除培养基中配制浓度为2毫克/毫升的新鲜胶原酶溶液。

从含有70%至80%融合度mESC的孔板中吸出ESC培养基。然后，沿孔壁轻轻加入一毫升PBS。轻轻摇动孔板以确保充分洗涤。

用移液器吸出 PBS，替换为两毫升胶原酶溶液。在 37 摄氏度孵育 30 至 45 分钟。孵育 20 分钟后，在光学显微镜下以 10 倍放大倍数观察培养板，之后每 5 分钟观察一次。

当菌落出现卷边时，用力敲击平板侧面以使菌落脱落。使用5毫升血清学移液管收集脱落的菌落，并将其转移至15毫升锥形管中。在室温下以16 ×g离心3分钟。

尽可能吸出锥形管中的培养基，注意不要扰动管底的细胞克隆。接着，向细胞沉淀中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶溶液并进行孵育。使用P1000和P200微量移液器剧烈吹打悬浮液，以解离细胞克隆，然后加入2 mL mESC培养基以中和胰蛋白酶活性。

将离心管在室温下以 160 G 离心三分钟。用移液器吸出上清液，然后加入一毫升 CNCC 分化培养基。使用自动细胞计数仪或在显微镜下对细胞进行计数，随后用 CNCC 分化培养基稀释细胞，使细胞浓度达到每 50 微升含 3,000 个活细胞。

使用 P200 移液器，将 50 微升细胞悬液接种到未经 TC 处理的 U 型底 96 孔板的每个孔中。每孔用 CNCC 分化培养基补足至 200 微升，然后进行培养。在光学显微镜下观察已培养 24 小时的分化细胞板，确保每个孔底部可见边界清晰的小细胞簇。

将培养板放回培养箱中过夜。第二天，缓慢从每个孔中移除100微升培养基。然后，使用P200微量移液器，将其吸头末端剪去3至4毫米，吸取神经球及剩余的培养基。

将神经球及剩余培养基转移至未经TC处理的平底96孔板中。在光学显微镜下确认转移情况。每孔加入预热的CNCC分化培养基，使终体积为200微升。

第4天，从每个孔中吸出100微升培养基，加入100微升预热的CNCC分化培养基，然后再次孵育。在第5天和第6天，于光学显微镜下观察神经球的贴壁情况。

确保从神经球脱落的较轻细胞开始围绕其主体。根据给定的成分配制CNCC维持培养基。在将牛血清白蛋白加入培养基前，需通过0.22微米滤器过滤。

添加生长因子后，将培养基置于 4 摄氏度避光保存，最多可保存三周。向未经 TC 处理的 96 孔板的每个孔中加入 100 微升纤连蛋白溶液。在板静置的同时，尽可能吸除未经 TC 处理的平底 96 孔板各孔中的 CNCC 分化培养基。

加入 50 微升 Accutase 溶液以替换原有培养基。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。随后，每孔加入 100 微升 CNCC 维持培养基以中和 Accutase。

从接收板的包被孔中移除纤连蛋白。然后将脱离的迁移后颅神经嵴细胞（CNCC）通过40微米滤膜过滤至接收板的孔中。在预定的时间点，使用剪去尖端的P200移液器将神经球从96孔板转移至DNA低吸附的2毫升离心管中。

在室温下静置神经球3分钟使其沉降后，用移液器尽可能吸除全部培养基，然后用1毫升预冷的PBS洗涤。为制备封片腔室，将三层双面透明无纤维胶带贴于载玻片上，用刀片在双面胶带上切出一个3毫米×8毫米的窗口。

在体视显微镜下，使用P200剪切尖端的移液枪，小心地将神经球转移至封片剂中的载样腔室。采用2X至4X的放大倍数，以获得整个腔室的视野并识别神经球。将盖玻片置于腔室表面，并轻轻按压其两侧，使其贴附固定。

在非组织培养板中培养的神经球从第5天开始表现出均匀的贴壁，而培养皿中的神经球则显示出可变的贴壁和融合现象，尤其在第4天时尤为明显。在第4天和第7天，96孔板培养中的神经球大小变异性显著低于培养皿培养。第4天时，96孔板中神经球的直径范围为139微米至295微米，第7天时为383微米至552微米，而培养皿培养的神经球直径范围更广。

神经球的细胞数量呈指数增长，从第2天平均1,082个细胞增加到第9天平均48,352个细胞。直径增长呈线性，从第2天平均136微米增加到第9天平均570微米。免疫荧光分析证实，神经球及去黏附细胞在第9天和第13天表达神经嵴来源的细胞（CNCC）标志物AP2 alpha和SOX9，以及上皮-间质转化（EMT）标志物TWIST1。

PAX7 仅存在于神经球中。