表征生物体液中的细胞外囊泡
2025年2月28日
在这里，我们展示了从人类受试者的生物体液（如眼泪和唾液）中收集的细胞外囊泡 （EV） 的表征方法。该方法中使用的扫描仪能够从 1 μL 样品中检测 EV 的表型、大小和总颗粒数。
细胞外囊泡作为疾病生物标志物，反映生理状态。我们的方法可以从微小的泪液量中提取丰富的数据，从而推进生物体液中的 EV 研究。关键的实验挑战包括从小样品中获得足够的细胞外囊泡浓度，最大限度地减少分离过程中的样品损失，以及优化分析以防止芯片过饱和或弱信号检测。
该方案绕过了分离步骤，缩短了处理时间，并允许从少量样品中分析细胞外囊泡，使其成为有限生物样品（如泪液）的理想选择。非侵入性生物标志物对于角膜疾病的早期检测和管理至关重要。细胞外囊泡生物标志物可实现疾病监测、个性化治疗、提高患者依从性并提高生活质量。
我们的实验室率先分析了 KC 受试者泪液样本中的细胞外囊泡，确定了独特的 tEV 特征。这为未来的诊断和以 EV 为重点的治疗靶点铺平了道路。首先，在工作区放置生物样品和跨膜四蛋白芯片。
将 70 微升与人跨膜四联试剂盒的溶液 B 预混合的人生物样品移液到芯片上。将薄膜放在芯片清洗板上，以防止样品蒸发。16 小时后，将板放入切屑垫圈中。
将其锁定到位并合上盖子。按洗片机上的 CW-TETRA v0 选项。清洗芯片时，每个芯片准备 300 微升封闭溶液。
每个芯片向封闭溶液中加入 0.6 μL 的每种抗体。用抗体混合物涡旋封闭溶液，以确保充分混合。芯片洗涤完成后，在每个芯片顶部加入 250 微升封闭溶液和抗体混合物。
然后合上盖子并按 Continue（继续）。当洗屑器发出啁啾声时，拆下洗屑板。将筹码向上移动斜坡。
将板放回切屑垫圈中，确保其牢固锁定到位。合上盖子，然后按 Continue（继续）。首先，打开纳米粒子分析仪。
在连接到纳米粒子分析仪的桌面上启动扫描软件程序。选择芯片文件夹以选择每个 tetraspanin 芯片，并在卡盘上的 Chip Position （芯片位置） 中找到它。单击 Chip Position （芯片位置） 下方的三个方块以打开荧光。
方块将变为黄色、蓝色和红色。按下卡盘盖并拉动以将其取下。然后将加载样品的 tetraspanin 芯片牢固地固定在卡盘上。
将卡盘盖的钉子与孔对齐并向下按压。滑动盖子以将其锁定到位。然后将卡盘放在载物台上并将其锁定到位。
接下来，单击软件界面中的扫描芯片，然后单击 OK。一旦载物台完全进入机器，请关闭门。扫描完成后，打开门以弹出载物台并验证结果。如果扫描成功，则丢弃芯片。
将下一组筹码放在卡盘上。或者，将空卡盘放回载物台。完成后退出软件并关闭本机。
在 CD63 、 CD81 和 CD9 通道中观察到细胞外囊泡的最佳荧光水平，而 MIgG 对照通道保持黑色，证实了对照特异性。生物体液的 CD81 降低。CD63、CD81 和 CD9 通道无荧光表明没有细胞外囊泡。
荧光过度饱和很明显，由于过度标记，特别是在 CD63、CD81 和 CD9 通道中，很难辨别有意义的数据。
概述
本研究提出了一种新颖的方法，用于表征从人体生物液体（如眼泪和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）。通过利用四跨膜蛋白芯片，该方法可以从极少量的样本中分析EVs，推进了疾病监测的非侵入性生物标志物研究。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞外囊泡
- 非侵入性生物标志物
- 眼部疾病
背景
- EVs可作为生理状态和疾病的指标
- 挑战包括小样本中低浓度和样本处理时间
- 早期检测角膜疾病的重要性
所用方法
- 使用四跨膜蛋白芯片进行EV分析
- 人体生物样本（眼泪）
- 基于荧光的EV标志物CD63、CD81和CD9的检测
主要结果
- 样本制备和分析步骤的集成减少了处理时间
- EV标志物的荧光水平确认了特异性和存在性
- 在尖角角膜变薄患者的泪液样本中识别出tEV特征
结论
- 该方法提供了一种从小生物样本进行EV分析的简化方法
- 研究结果支持未来的眼部健康诊断和治疗靶点
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
