Name: 人肠道类器官的神经支配 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 了解人肠道类器官的神经支配技术，通过整合肠神经系统优化空间组织与细胞多样性，模拟天然肠道发育过程。该方法为短肠综合征患儿提供潜在治疗方案，推动组织工程与神经科学交叉领域发展。

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感谢众多合作者与导师，包括 Noah Shroyer、Michael Helmrath、James Wells 和 Faranak Fattahi，他们允许我们访问其实验室，并在多年间帮助我们不断完善本实验方案。我们还要感谢多能干细胞中心（Pluripotent Stem Cell Facility）和干细胞中心（Center for Stem Cell）的 Chris Mayhew 与 Amy Pitstick &amp;感谢辛辛那提儿童医院医学中心类器官医学中心（CuSTOM）为我们的实验室提供了人肠道类器官（HIO）培训、指导和建议。&#160;本研究由德克萨斯医学中心消化疾病中心试点/可行性研究资助项目（部分由美国国立卫生研究院糖尿病、消化及肾脏疾病研究所 NIH/NIDDK P30DK056338 资助）（Speer）、美国国立糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK，NIH 1K08DK131326-01A1）（Speer）、杰出人士奖（Men of Distinction award）（Speer）以及美国神经胃肠病学与动力学会（ANMS）职业过渡奖（Transition Award）（Speer）资助。

人胚胎干细胞（hESC）系H9购自WiCell（美国威斯康星州麦迪逊市），所有涉及hESC的实验均经休斯顿德克萨斯大学健康科学中心干细胞研究监督委员会（UTHealth Houston SCRO）批准（方案编号：SCRO-23-01）。本实验方案中提及的包被培养板或孔，均指使用经hESC验证的3D基底膜基质制备的培养板或孔。
1. 细胞培养准备
注意：本实验室使用 H9 hESCs，但其他实验室已成功使用多种 hPSC 细胞系生成 HIOs 和 ENCCs，包括 H9 hESCs9,10,12、H1 hESCs9、hESC 细胞系 UCSF412，以及多种 hiPSC 细胞系，如 WTC1112、WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9、WTC109,10、WTC10 PHOX2B 杂合子 (+/Y14X)9 和 WTC10 PHOX2B 纯合缺失 (Y14X/Y14X)9。
<ol>
	<li>通过将3D基底膜基质用适当的细胞培养基稀释后包被每个目标孔，准备6孔板（稀释倍数及制备说明详见材料数据表）。每孔加入1 mL，于37 °C孵育至少1小时或过夜，使基质凝固，之后再接种细胞。 
	注意：本方案可根据需要仅使用一个孔或按比例放大。我们建议至少包被三个孔，以便后续传代及维持未分化hPSCs的培养。 
	操作过程中应始终保持基底膜基质处于低温状态，因为大多数基质在室温下即开始聚合。包被后的孔板在37 °C储存条件下可使用长达2–3周。储存时应加入足够的稀释液覆盖整个孔表面，防止包被层干燥。</li>
	<li>将hPSCs（建议使用较低传代次数的细胞）在温水浴中轻轻摇动以快速解冻。在超净工作台内，将一管细胞重悬于2 mL干细胞培养基中（表1）。在接种细胞前，立即吸除6孔板中已包被孔内的稀释液，然后将全部2 mL重悬细胞转移至该包被孔中。对于维持未分化hPSCs（称为维持培养板），置于37 °C、5% CO2条件下培养，并每隔一天更换一次培养基，每孔加入2 mL干细胞培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到70–80%时进行传代。从孔的一侧吸除培养基，避免扰动细胞。向孔中加入1 mL室温干细胞解离试剂，1分钟内吸出，仅在细胞表面留下一层薄液。将培养板于37 °C孵育5分钟。 
	注意：若等待细胞融合度超过80%再传代，可能导致过早分化，从而降低后续步骤的细胞得率。</li>
	<li>每孔加入1 mL预热的干细胞培养基，轻敲培养板侧壁以使细胞集落脱落。使用P1000移液器配合宽口吸头（见材料表），轻柔吹打培养基以分散集落，同时尽量减少细胞损伤。 
	注意：在吹打细胞悬液时，建议打散较大的细胞团块，但保留较小的细胞簇完整。不建议获得单细胞悬液，而应以形成数量较少、体积较小且均匀分布于孔中的集落为目标。</li>
	<li>吸除6孔板中预先包被孔内的稀释液，每孔加入2 mL预热的干细胞培养基。将适量细胞悬液转移至该孔中以维持hPSC集落生长，每隔一天更换一次培养基，每孔加入2 mL干细胞培养基。 
	注意：本实验室通常转移50–150 µL细胞悬液，以实现hPSC维持培养板每周传代一次。具体体积可能因hPSC细胞系及传代次数不同而有所差异，需根据实际情况调整。剩余细胞可用于启动ENCC的生成（第2节）或HIO的生成（第3节）。新解冻的hPSCs在进入ENCC或HIO生成步骤前，应至少传代两次。</li>
</ol>
2. ENCC 的生成
注意：我们的肠神经嵴细胞（ENCC）生成方法 closely follows Fattahi 实验室所描述的方法，并采用 Schlieve 等人10使用的方法。我们在 Barber 等人10,12论文中的“&#34;肠神经嵴（ENC）诱导（第 0–12 天）&#34;”和“&#34;ENCC 类球体形成（第 12–15 天）&#34;”部分，采用的是对该方案选项 B 的略微修改版本。
<ol>
	<li>从新的6孔板中先前包被的孔中吸除稀释液，加入2 mL温热的干细胞培养基。将步骤1.5中获得的850 µL hPSC细胞悬液转移至同一孔中（通常为5:6的传代比例）。</li>
	<li>将细胞维持在37 °C、5% CO2条件下。每隔一天更换一次培养基，每孔加入2 mL干细胞培养基，直至细胞融合度达到60–80%。此后，培养板即可用于开始ENC诱导。</li>
	<li>ENC诱导
	<ol>
		<li>第0天：从孔壁一侧吸除培养基，加入2 mL温热的A混合培养基（表1）。放回培养箱中培养48小时。</li>
		<li>第2天：从孔壁一侧吸除A混合培养基，更换为2 mL温热的B混合培养基（表1）。放回培养箱中继续培养48小时。</li>
		<li>第4天：从孔壁一侧吸除B混合培养基，更换为2 mL新鲜温热的B混合培养基。放回培养箱中继续培养48小时。</li>
		<li>第6–12天：从孔壁一侧吸除B混合培养基，更换为2 mL温热的C混合培养基（表1）。放回培养箱中，并每隔48小时更换一次2 mL新鲜温热的C混合培养基，直至第12天完成ENC诱导。 
		注：在此阶段，可通过基因表达分析确认ENC谱系，方法如Barber等12所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ENCC类球体形成
	<ol>
		<li>第13天：从孔壁一侧吸除C混合培养基。加入1 mL温热的酶解细胞解离试剂，于37 °C孵育30分钟。轻敲培养板侧壁使细胞脱落，使用宽口移液吸头将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。用1 mL神经嵴细胞（NCC）培养基（表1）清洗孔壁，并将清洗液一并加入15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>将15 mL锥形离心管中的细胞悬液以300 × g离心1分钟。吸除上清液。用2 mL温热的NCC培养基轻柔重悬沉淀。</li>
		<li>将重悬的细胞加入一个新的未包被的超低吸附培养板孔中，于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
		<li>第15–21天：监测ENCC类球体的生长情况，并每隔48小时更换一次2 mL新鲜温热的NCC培养基。 
		注：换液操作应小心进行，避免损伤或吸除ENCC类球体。最佳操作方式是将培养板轻轻旋转晃动，使类球体集中于孔中央，然后从孔壁边缘吸除培养基。 
		ENCC类球体通常在第15天形成完成，但也可继续培养至第21天，以便与中后肠类球体共培养的时间安排更为理想。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HIO 生成（中后肠类球体阶段）
注意：我们生成 HIO 的方法与 McCracken 等人以及 Spence 和 Wells 实验室先前详细描述的原始方案基本相同6,7。该过程分为两个阶段：定型内胚层（DE）诱导和中后肠类球体形成。
<ol>
	<li>类器官生成前的准备
	<ol>
		<li>通过将三维基底膜基质用适当的细胞培养基稀释后包被于24孔板中每个目标孔内，进行孔板的预处理（稀释倍数及制备说明详见材料数据表）。每孔加入500 µL，于37 °C孵育至少1小时或过夜，以使基质凝固，之后方可接种细胞。 
		注意：操作过程中应始终保持基底膜基质处于低温状态，因为大多数基质在室温下会开始聚合。包被后的孔板若储存在37 °C环境下，可在2-3周内使用。储存时应加入足量稀释液以完全覆盖孔底，防止包被层干燥。 
		&#8203;每处理1个上述6孔板中的hPSC维持孔，需预先包被24孔板中的6个孔。此比例可根据需要按比例放大。</li>
		<li>吸除24孔板中所有预先包被孔内的稀释液。向第1.5步所得的hPSC细胞悬液中加入足量预热的干细胞培养基，并将500 µL混合液分配至每个孔中（例如，若在传代hPSC维持板后剩余850 µL hPSC细胞悬液，则对于24孔板的6个孔，应将2,150 µL预热的干细胞培养基与850 µL第1.5步的hPSC细胞悬液混合，然后每孔分配500 µL）。 
		注意：由于我们通常以50–150 µL体积传代hPSC维持板，因此本步骤通常可获得850–950 µL的细胞悬液。因此，24孔板中每孔的hPSC体积约为150 µL/孔。 
		&#8203;将新制备的24孔板放入培养箱后，轻轻前后（南北方向）和左右（东西方向）晃动孔板，使细胞尽可能均匀地分布在孔底。</li>
		<li>将细胞维持在37 °C、5% CO2条件下培养。每隔一天更换一次培养基，每孔加入500 µL干细胞培养基，直至细胞融合度达到50–70%。此时，孔板即可进入定型内胚层（DE）诱导阶段。 
		注意：在进行DE诱导前，细胞融合度绝不可超过&#62;70%，因为过高的融合度会对后续阶段的内胚层密度及后肠形态发生产生不利影响。理想情况下，在指定的传代比例下培养24–48小时后，细胞融合度应达到约50–70%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定型内胚层（DE）诱导
	<ol>
		<li>第1天：当hPSC达到50–70%融合度时，彻底吸除每孔中的干细胞培养基，并更换为每孔500 µL预热的第1天DE培养基（表1）。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
		<li>第2天：吸除第1天的DE培养基，更换为每孔500 µL预热的第2天DE培养基（表1）。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
		<li>第3天：吸除第2天的DE培养基，更换为每孔500 µL预热的第3天DE培养基（表1）。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中后肠类球体形成
	<ol>
		<li>第4–8天：彻底吸除每孔中的培养基，并更换为每孔500 µL预热的中后肠培养基（MHGM，表1）。于37 °C、5% CO2条件下继续培养。每日重复此操作，直至第8天，此时中后肠类球体已准备好用于收集和共培养（第4节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 中肠-后肠类球体与肠神经嵴细胞的共培养
注意：本节的图示摘要见图1。
<ol>
	<li>ENCC 悬液的制备
	<ol>
		<li>通过小心移除步骤 2.4.4 中的培养基收集第 15–21 天的 ENCC 类球体，避免使用该步骤注释中所述的涡旋法吸取类球体。</li>
		<li>向孔中加入 1 mL 预热的酶解细胞解离试剂，在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>轻敲培养板侧面以继续解离类球体，并使用带宽口吸头的 P1000 移液器轻轻吹打，上下反复抽吸以打散细胞团块，直至混合物均匀。</li>
		<li>将 ENCC 悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。用 1 mL 预热的 NCC 培养基（见表 1）冲洗孔内残留细胞，并将冲洗液加入 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>在 300 × g 条件下离心细胞悬液 1 分钟，用无菌移液吸头吸除上清液。</li>
		<li>使用宽口移液吸头将细胞沉淀重悬于 1 mL 预热的 NCC 培养基中。使用血细胞计数板或细胞计数仪测定 ENCC 悬液的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ENCC 悬液与中后肠类球体的混合
	<ol>
		<li>使用宽口移液吸头收集 HIO 培养板所有孔中的中后肠类球体，并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>确定将在 24 孔板中用于共培养的孔数。每孔共培养建议接种 10–30 个中后肠类球体和 50,000–100,000 个 ENCC。 
		注：实际操作中，健康类球体的孔数通常与最终所需共培养孔数呈一对一关系。也可使用血细胞计数板计算所收集中后肠类球体的浓度。</li>
		<li>向含中后肠类球体的离心管中加入计算体积的 ENCC 悬液，使每孔共培养体系含有 50,000–100,000 个 ENCC。使用宽口移液吸头轻轻吹打，使中后肠类球体与 ENCC 均匀混合。</li>
		<li>在 300 × g 条件下离心 1 分钟，用无菌移液吸头小心吸除上清液。使用宽口移液吸头将细胞沉淀重悬于适量冰冷、无酚（透明）、生长因子减少型基底膜基质中，每孔最终共培养体系使用 30 µL。 
		注：重悬过程中应避免在透明基底&#160;膜基质中产生气泡，因为气泡难以去除，会阻碍 HIO+ENCC 共培养物对培养基的正常吸收，并影响其生长过程中的观察。</li>
		<li>向每个干燥孔的中央加入 30 µL 重悬的中后肠类球体 + ENCC 混合物（溶于透明基底膜基质中），周围不加培养基。所有液滴加样完成后，盖上盖子并将培养板倒置。在 37 °C、5% CO2 条件下倒置孵育 30 分钟。 
		注：此步骤可使中后肠类球体和 ENCC 在透明三维基底&#160;膜基质聚合过程中远离孔底并悬浮其中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 HIO+ENS 共培养
	<ol>
		<li>第 0 天：待透明基底膜基质聚合后，向每个液滴覆盖 500 µL 预热的第 0–3 天 HIO 培养基（见表 1）。</li>
		<li>第 3 天：从孔壁侧边小心吸除第 0–3 天 HIO 培养基，避免扰动透明基底膜基质液滴。更换为 500 µL 预热的第 3–14 天 HIO 培养基（见表 1），并将培养板放回培养箱。此后每 3–4 天更换一次培养基。</li>
		<li>第 7–14 天：根据需要每 3–4 天继续更换第 3–14 天 HIO 培养基，并监测生长情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HIO 的传代
	<ol>
		<li>第 14 天：在显微镜下仔细观察每个孔，评估每个透明三维基底膜基质液滴中发育中的 HIO + ENS 数量。</li>
		<li>准备含 30 µL 透明基底膜基质的 2 mL 微量离心管，并置于冰上保存。</li>
		<li>在超净工作台内，使用精细镊子小心取出悬浮有 HIO+ENS 的透明三维基底膜基质液滴，轻轻分离单个 HIO+ENS。 
		注：此阶段使用手术放大镜或解剖显微镜可能非常有帮助，但并非绝对必要，因为 HIO 通常肉眼可见。</li>
		<li>使用镊子或宽口移液吸头将每个分离的 HIO + ENS 放入预先准备的含 30 µL 透明基底膜基质的微量离心管中。 
		注：此阶段无需将旧的透明三维基底膜基质液化或溶解。应尽量避免破坏 HIO，但即使发生损伤，其仍可能继续发育至后续阶段。</li>
		<li>对传代并重新接种的 HIO+ENS 重复步骤 4.2.5。待透明三维基底膜液滴聚合后，向每孔加入 500 µL 预热的新鲜第 3–14 天 HIO&#160;培养基，过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HIO+ENS 共培养的持续进行
	<ol>
		<li>第 15 天：从孔壁侧边小心吸除第 3–14 天 HIO 培养基，更换为 500 µL 预热的第 15–28 天 HIO&#160;培养基（见表 1）。</li>
		<li>第 15–40 天：根据需要每 3–4 天继续更换第 15–28 天 HIO 培养基，并监测 HIO + ENCC 的生长情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

自2010年代初以来，人源类肠器官（HIOs）已被用作研究人类肠道发育的模型系统，并且其复杂性日益增加。目前，已可为这些类器官提供肠神经系统（ENS），从而为研究正常发育过程提供了新的机遇，并有望应用于理解和更好治疗多种临床胃肠道疾病。
在体 移植 
ENCCs 整合至中后肠类球体中，并在过程中形成肠神经系统 体外 共培养阶段。然而，包括我们实验室在内的多个研究团队选择在第28天后将HIO + ENS移植到活体宿主体内，以借助宿主的血管系统促进其进一步生长和成熟。我们通常在第28天后移植HIO + ENS 体内 第28天至第40天之间 体外 生长。然而，也有其他实验室将HIO培养超过40天 体外. 由于这些较长片段中的转录组 体外 培养物保持胎儿样状态，未发生进一步成熟13，共培养 体外 超过40天并无进一步优势。多种优化移植操作的方...

人类小肠是一个复杂的多层器官，执行多种重要功能，如消化、营养吸收、液体调节、免疫屏障功能以及运动功能。许多临床疾病，例如短肠综合征、肠病或运动功能障碍，其特征是肠组织量显著减少或正常生理功能受到破坏，从而导致严重的发病率和死亡率1,2,3,4。目前的治疗手段通常包括手术切除功能异常的肠段，但会因此减少肠道长度，进而降低残余肠段的功能能力5。临床上亟需具有增补性质的再生疗法，以增加功能性肠道容量，并以现有治疗模式无法实现的方式恢复肠道功能。
生物工程小肠是应对这些挑战的有前景的解决方案。由人多能干细胞（hPSCs）衍生而来的人肠类器官（HIOs）是构建生物工程小肠的一种起始材料。2011年，Spence 等首次报道了从包括H1和H9在内的人胚胎干细胞（hESC）系以及多种人诱导性多能干细胞（hiPSC）系成功构建现代HIOs6,7。该方案包括一系列精确控制时间的培养步骤，并使用特定生长因子，以模拟人类胎儿肠道的发育过程。激活素A（Activin A）是一种TGFβ信号分子，可驱动hPSC向内胚层命运分化，随后通过Wnt/FGF信号通路进行定向后部模式形成。在此条件下，hPSC可自组织形成肠球状体，其中包含极化上皮和间充质。在基底膜基质中进行三维培养可进一步促进其发育，最终形成具有内部腔隙、类似绒毛的上皮内陷结构，以及在类似隐窝结构中具备自我更新能力的前体细胞微环境的类器官。
尽管采用2011年原始方案生成的人类类肠器官（HIOs）在结构上类似于天然肠道，但其缺乏生成肠神经系统（ENS）中神经元或胶质细胞的能力。2017年，两篇重要研究论文分别描述了相似但不同的HIOs神经支配方法。ENS前体细胞（即肠源性神经嵴细胞，ENCCs）可由人多能干细胞（hPSCs）衍生获得。在培养条件下，ENCCs可形成三维神经球，在适当条件下可进一步分化为肠神经元和胶质细胞。Workman和Mahe等人改进了现有的ENCCs衍生方案，从hPSCs中获得ENCCs后，使用富含FGF的培养基处理，随后加入维甲酸处理2天，以实现后部化并促进迷走神经命运的形成8,9第6天的神经球在无视黄酸条件下继续培养4天，随后经酶消化解离后收集迁移细胞。将约20,000至50,000个肠神经嵴细胞与早期中后肠类球体聚集，形成肠神经嵴细胞接种的肠类球体，并进行培养 体外 在透明的3D基底膜基质中培养28天，直至 体内 移植至免疫缺陷小鼠肾包膜下培养6–10周。所获得的HIO + ENS显示出上皮和间充质成分的显著成熟，以及类似神经节的神经胶质结构，但与天然肠道相比，其细胞体密度较低，缺乏某些临床相关神经元亚型（例如移植后HIO + ENS中缺失CHAT阳性神经元），整体呈现胎儿样特征。
同年，Schlieve 等人发表了一种替代方法，该方法涉及将 40–60 个完整的第 15 天 ENCC 神经球与更为成熟的 HIOs 在特定时间点共同混合 体内 移植到免疫缺陷小鼠的大网膜中，持续3个月，无需预先处理 体外 共培养10其构建物被称为ENCC-HIO-TESI（组织工程小肠），似乎比Workman和Mahe所构建的HIO + ENS具有更成熟的肠神经系统（ENS）表型，表现出更丰富的神经元亚型多样性以及在HIO + ENS中未观察到的神经上皮突触连接。重要的是，Schlieve实验中所用的ENCCs是通过Fattahi等人先前描述的不同方法获得的。11简而言之，人多能干细胞（包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞）在富含FGF2的培养基中进行神经嵴诱导。这些细胞还接受了视黄酸（RA）处理以建立肠源性迷走神经命运，但RA处理时间为5天（第6–11天），较Workman和Mahe所用的2天（第4–5天）有所延长。2019年，Barber等人发表了Fattahi方案的修订版本，其中更详细地描述了培养条件，并改用成分明确的基础培养基，以减少实验变异性，并反映当时细胞培养偏好的变化。12.
我们对人肠道类器官（HIOs）进行神经支配的方法（下文将详述）结合了Workman/Mahe法与Schlieve法的要素。尽管在Schlieve的ENCC-HIO-TESI模型中，肠神经系统（ENS）表现出更成熟的特征，具有更高的神经元多样性及神经胶质整合能力，但两种方法均成功地将功能性肠神经系统整合至HIOs中，并显示出胃肠道转录表达的显著变化。Workman和Mahe的HIO + ENS模型诱导了多个与肠道干细胞及上皮细胞发育相关基因的表达上调，而这些基因在ENCC-HIO-TESI模型中并未发生改变。造成这些差异的一个可能解释是两种方案中肠神经嵴细胞（ENCCs）与HIOs共培养的时间点不同。本实验室观察到，早期共培养可导致参与上皮和间充质分化的多个基因表达上调，且共培养时机影响上皮细胞的多样性（未发表数据）。因此，肠神经系统前体细胞更早地暴露于发育中的HIOs环境可能 反之亦然 为尚未明确的信号串扰提供时间，从而促进上皮多样性及其他早期发育过程。

<table><tbody><tr><td>100倍非必需氨基酸溶液（NEAA）</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>&quot;酶解细胞解离试剂&quot;</td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50倍浓度），不含维生素A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12587010</td><td>用于 ENCC</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（50 倍浓度），无血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>对于HIO</td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>豪斯科学</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低吸附微孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>康宁平底24孔板，TC处理</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 平底板 3516 6 孔</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 培养基</td><td>赛默飞世尔</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 培养基</td><td>赛默飞世尔</td><td>A2858501</td><td>用于 ENCC 培养板的替代干细胞培养基。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle i160</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50145522</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco HEPES 1 M</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutagro，200 mM，100倍浓缩液</td><td>康宁</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>H9 人 ESC</td><td>WiCell 国际干细胞库</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneTM FBS Defined</td><td>VWR</td><td>16777-002</td><td></td></tr><tr><td>LabGard 生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td>Nu-430-400</td><td></td></tr><tr><td>基质胶 GFR 基底膜基质，无酚红，无LDEV</td><td>康宁</td><td>356231</td><td>&quot;透明三维基底膜基质&quot;</td></tr><tr><td>基底膜基质（Matrigel hESC-Qualified Matrix，不含LDEV）</td><td>康宁</td><td>354277</td><td>&quot;3D基底膜基质&quot;</td></tr><tr><td>微量移液管</td><td>Eppendorf（100-1000、20-200、10-100、2-20、0.5-10、0.1-2.5 μL）</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>&quot;干细胞培养基&quot;&lt;br/&gt; 货号包含5倍浓缩补充剂，需提前大量加入。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍）</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>对于HIO</td></tr><tr><td>N-2 补充剂，CTS（细胞治疗系统）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1370701</td><td>用于ENCC。配方略有不同。</td></tr><tr><td>尼康 DS-Fi2 TS-100 显微镜</td><td>尼康</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Noggin 条件培养基</td><td>德克萨斯医学中心消化系统疾病中心 GEMS 核心，肠类器官/类器官子核心</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Activin A</td><td>细胞引导系统</td><td>GFH6-100</td><td></td></tr><tr><td>重组人 BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>314BP010</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF 蛋白，CF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF basic/FGF2（146 个氨基酸）蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>233-FB-010</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF-4</td><td>Peprotech</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5872</td><td>&quot;干细胞解离试剂&quot;</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>SIGMA</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的微量离心管，2 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM12425</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 条件培养基</td><td>德克萨斯医学中心消化疾病中心 GEMS 核心，肠类器官/类器官子核心</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542，Tocris Bioscience</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准宽口移液器吸头</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Chir99021 溶液</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤膜移液器吸头</td><td>VWR（1000 μL、200 μL、10 μL）</td><td>76322-154, 76322-150, 89174-520</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>干细胞技术</td><td>7180</td><td>用于 ENCC 培养板的替代性 3D 基底膜基质&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

人肠道类器官的神经支配

Innervation of Human Intestinal Organoids

肠道细胞结构和功能的复杂性为生物工程小肠的构建带来了重大挑战。此前已有研究报道了生成类似于人类小肠的人肠道类器官（HIOs）的技术。HIOs 包含上皮和间充质组织，但缺乏功能性肠道的其他关键组分，例如肠神经系统（ENS）、免疫细胞、血管系统和微生物组。两个独立的研究团队已分别发表了将肠神经系统（ENS）引入 HIOs 的不同方法。本文中，我们讨论一种将肠神经系统（ENS）整合到 HIO 来源的生物工程小肠中的独特方法，该方法结合了先前研究中的技术要素，以优化前体细胞的身份特征及发育时机。
人类多能干细胞（hPSCs）通过在数天内对分化标志物进行时间调控，按照已发表的实验方案分别独立分化为人肠道类器官（HIOs）和肠神经嵴细胞（ENCCs）。当HIOs发育至中后肠球状体阶段（约第8天）时，将第15至21天的ENCC球状体解离，与HIOs共培养，并悬浮于透明的三维（3D）基底膜基质液滴中。HIO + ENCC共培养物被维持培养 体外 移植前28-40天 &#62;9周龄的免疫缺陷小鼠中以进行进一步发育和成熟。移植后的人类肠道类器官（tHIOs）可在4至20周后收获。该方法整合了两种先前发表技术的关键要素，利用由人多能干细胞（hPSCs）衍生的肠神经嵴细胞（ENCCs），并在肠道类器官发育早期阶段与其共培养，以最大程度地暴露于早期发育信号，这些信号可能有助于形成更成熟的肠道形态。

肠神经系统（ENS）调控成熟小肠的基本功能，包括蠕动、营养吸收、液体转运以及上皮屏障的维持。因此，对人源类器官（HIOs）进行神经支配的目标是为这些类器官提供发育所需的各种要素，以实现更成熟、更高级的功能。为此，本实验室重点研究肠神经系统在HIOs中的发育过程，以及在不同发育阶段所实现的功能性结果。
持续监测细胞的生长、分化及形态发生过程至关重要，以确保每个步骤均按预期进展后再进入下一阶段。肠神经嵴细胞（ENCC）的分化及类球体形成过程最长可持续3周，图2展示了ENCC分化完成后及ENCC类球体形成不同阶段的代表性明场显微图像。ENCC应在第12天左右开始在细胞单层中形成可见的聚集体，随后在重铺至超低吸附培养板后自发形成类球体。此阶段ENCC类球体通常生长迅速，肉眼即可清晰观察到。
在HIO生成过程中，DE诱导第1天后出现部分细胞死亡是正常现象。细胞增殖应在第2天和第3天恢复，最终到第3天结束时融合度应接近100%。DE诱导结束时，细胞应呈现较大、扁平的形态，边界清晰...

为了更好地模拟人体肠道的结构和功能，必须对人肠道类器官进行神经支配。本文介绍了一种将肠神经系统整合到这些类器官结构中的方法。

肠道复杂的细胞结构与功能为小肠组织工程的构建带来了重大挑战。技术……

我们的研究致力于开发组织工程肠道，以解决短肠综合征问题。本实验室专注于优化肠神经系统整合以及空间结构、细胞多样性和功能的优化。我们希望有朝一日能够通过构建生物工程化肠道，为患有肠道功能衰竭的儿童带来改变生命的治疗方案。支配人肠道类器官需要模拟人类肠道的发育过程，这可能具有挑战性。肠神经系统的发展既需要生化信号，也需要生物力学力。本实验室未来的研究重点是优化人肠道类器官中肠神经系统的发育。我们正在研究空间组织以及细胞多样性，近期采用了由Dr. Herath开发的一种新型3D成像技术，该技术能够对肠道类器官中的肠神经系统（ENS）进行稳健的表征与定量分析。这将有助于我们优化模型，以更好地模拟人类肠道的发育与功能。首先，取培养15至21天的肠神经嵴细胞（ENCC）类球体培养板，小心地从孔中移除培养基。向孔中加入1毫升预热的酶法细胞解离试剂，在37摄氏度孵育30分钟。然后轻敲培养板侧壁以促进类球体解离。使用带有宽口吸头的P1000移液器，轻轻吹打混合液，直至细胞呈均一状态。将ENCC悬液转移至15毫升锥形管中。用1毫升预热的神经嵴细胞培养基洗涤孔板，以收集残留的细胞，然后将此洗液加入锥形管中。随后以300 ×g离心1分钟。然后使用无菌移液器吸头吸除上清液。随后，用宽口移液器吸头将细胞沉淀重悬于1毫升温热的神经嵴细胞培养基中。使用宽口移液器吸头收集人肠类器官板中所有孔的培养中后肠类球体，并将其转移至15毫升锥形管中。将计算好的 ENCC 悬液体积加入含有中后肠类球体的锥形管中。使用宽口移液器吸头，轻轻吹打混合物，使类球体与 ENCC 均匀混合。将混合后的细胞悬液在 300 G 条件下离心一分钟。使用无菌移液器吸头小心吸除上清液。然后将所得的细胞沉淀重悬于冰冷的无酚生长因子减少型基底膜基质中。接着，将重悬后的中后肠类球体和肠神经嵴细胞在透明基底膜基质中形成的30微升液滴转移至每个干燥孔板的中央。所有液滴接种完成后，盖上培养板，倒置，并置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。第0天，待透明的基底膜基质聚合后，向每个液滴中加入500微升预热的第0至第3天HIO培养基。第3天，小心地从每个孔的边缘吸除第0至第3天HIO培养基，注意不要扰动透明的基底膜基质液滴。加入 500 微升温热的第 3 至 14 天 HIO 培养基，替换原有培养基，并将培养板放回培养箱。在第 14 天，在显微镜下观察每个孔，评估每滴透明三维基底膜基质中发育中的 HIO+ENS 结构的数量。向 2 毫升微量离心管中加入 30 微升透明基底膜基质，并将其置于冰上保存。在层流罩下，使用精细镊子小心移除含有悬浮 HIO+ENS 的透明 3D 基底膜基质液滴。用镊子轻轻分离单个 HIO+ENS 结构。使用精细镊子或宽口移液器吸头，将每个分离的 HIO+ENS 结构放入含有 30 µL 透明基底膜基质的微量离心管中。然后将重悬的HIO+ENS在透明基底膜基质中30微升的液滴加入每个干燥孔的中心。待液滴聚合后，向每孔加入500微升温热的新鲜第3至14天HIO+ENS培养基，并将培养板过夜孵育。第15天时，小心从每孔侧边吸除第3至14天的培养基，注意不要扰动已聚合的液滴。更换为500微升预热的第15至28天HIO+ENS培养基。HIO-ENS共培养在第30天显示出显著生长，伴随间充质结构的发育，形成细而模糊的突起，在上皮内陷周围形成类似晕轮的边界。神经嵴来源的肠神经嵴细胞（ENCCs）向HIOs迁移，整合至间充质内，并在体外存活，HIOs内GFP荧光显示其存活良好，证实间充质提供了充足的存活与分化信号。移植后的HIO+ENS共培养物在体内生长后表达神经元标志物（包括HuCD）和胶质细胞标志物（如S100β），证实其已分化为神经元和胶质细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

本视频展示了通过以下步骤创建运动神经类器官的方法：首先将人诱导多能干细胞在特定培养基中培养形成球状体，然后利用特定抑制剂将其分化为运动神经元，最后在微流控芯片中进行培养，以促进轴突延伸并形成运动神经类器官。...

利用微流控芯片开发人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本文详细描述了人多能干细胞来源的小肠和结肠类器官的生成、维持及表征方法。这些方法旨在提高实验可重复性，扩大可扩展性，并减少类器官接种和传代所需的工作时间。...

人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持与表征

本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。...

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

该方案结合了人类肠道类器官技术与单细胞转录组学分析，为此前尚未深入探索的肠道生物学提供了重要见解。...

利用人肠道类器官在单细胞转录水平研究小肠上皮

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。...

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

了解人肠道类器官的神经支配技术，通过整合肠神经系统优化空间组织与细胞多样性，模拟天然肠道发育过程。该方法为短肠综合征患儿提供潜在治疗方案，推动组织工程与神经科学交叉领域发展。

人肠道类器官的神经支配

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