可视化滨海湿地中甲烷循环微生物的动态变化

本研究通过可视化方法匹配了美国南得克萨斯州沿海湿地中关键甲烷循环微生物基因在空间和时间上的分布，探讨了环境因素如何调控甲烷动态。研究结果表明，南得克萨斯州沿海湿地中甲烷循环基因的丰度对环境条件（包括盐度和季节）具有敏感性。特别是甲烷单加氧酶基因 mmoX，在较冷的季节中丰度最高。

本方案通过提供新型工具来可视化受环境因素影响的微生物空间和季节性动态，解决了甲烷循环微生物基因检测领域的研究问题。通过将优化的PCR方法与GIS可视化技术相结合，本方案能够更高效地检测和进行甲烷循环基因的空间定位，同时捕捉受环境因素影响的微生物动态变化、空间分布及季节性规律。

[旁白] 首先，使用环境DNA（eDNA）和其他组分配制25微升的cPCR反应体系。将反应管放入PCR仪中，并按照适当的参数运行cPCR反应。cPCR完成后，配制含有Cyber Green但不含模板DNA的qPCR反应体系。将57微升配制好的反应体系分装至各PCR管中。向每根PCR管中加入3微升模板DNA、标准品或无核酸酶水，轻轻弹击管壁以混匀。从每根PCR管中取20微升反应体系，分装至96孔qPCR板中指定的孔位。使用加样器将粘性PCR密封膜覆盖在qPCR板上并密封。以1,000 × g离心1分钟，确保充分混匀并消除孔内气泡。将qPCR板放入热循环仪中。打开qPCR仪器并启动相关软件以设置实验程序。设置qPCR程序并开始运行。打开地理信息系统软件ArcGIS Pro，将项目文件保存为“研究区域”（Study Area），并存储在计算机的指定文件夹中。点击“地图”（Map），然后选择“底图”（Basemap），选择“带标签的地形图”（terrain with labels）作为底图。点击“定位”（Locate），再点击“搜索”（Search）。当搜索栏打开后，输入研究区域的名称，以在地图上定位该区域。为通过地理配准绘制特定区域，点击“视图”（View），然后从顶层菜单中选择“目录窗格”（Catalog Pane）。在目录中双击文件夹并选择所需的文件名。右键点击地理数据库（.gdb）文件，点击“新建”（New），然后选择“要素类”（Feature Class）。此时将弹出“创建要素类”（Create Feature Class）窗口。在“名称”（Name）和“别名”（Alias）框中输入相应名称，然后点击底部的“完成”（Finish）。现在，点击“视图”（View），然后点击“内容”（Contents）。别名将显示在“内容”窗格中。点击顶层菜单中的“编辑”（Edit），然后选择“创建”（Create）。“创建要素”（Create Features）窗格将打开。在“创建要素”窗格中双击该别名，将出现“配置工具反馈”（Configure Tool Feedback）选项。选择“线”（lines），然后在地图上绘制线条以创建研究区域边界。双击地图以结束绘制。最小化GIS软件并打开一个电子表格。在第一列输入样品名称，第二列输入纬度，第三列输入经度。接下来的四列用于输入pmoA1、pmoA2、mmoX和mcrA的qPCR数据。将文件以CSV格式保存在计算机的指定文件夹中。接着，重新打开GIS软件，点击“添加数据”（Add Data），然后选择“XY点数据”（XY Point Data）。在“输入表”（Input Table）框中选择之前保存的CSV文件。在“输出要素类”（Output Feature Class）框中重命名文件，然后点击“运行”（Run），以在地图上显示采样点。现在，点击顶部的搜索栏并搜索“Kriging”（克里金插值法）。选择采样站点文件，并选择pmoA1。然后点击“环境”（environment），在“图层”（layer）和“掩膜”（mask）中选择采样站点，点击“运行”（Run）。为创建地图布局，点击“插入”（Insert），选择“新建布局”（New Layout），然后选择ANSI-Landscape格式。点击“地图框”（Map Frame），选择带有克里金插值的地图，并通过绘制矩形将所有地图放入布局中。选择“指北针”（North Arrow）并将其放置在布局中以指示北方。然后选择“比例尺”（Scale Bar），以在地图上显示区域比例。点击“图例”（Legend），然后将其放置在布局中以显示地图图例。点击“网格”（Grid），然后选择任意黑色格网选项，以创建包含经纬度的网格。该网格将在“内容”窗格中以“黑色水平标签格网”（Black Horizontal Label Graticule）的标签显示。双击“黑色水平标签格网”，选择“组件”（Components），然后通过点击右侧的叉号删除“刻度1”（Ticks 1）和“格网”（Grid）。最后，点击顶层菜单中的“共享”（Share），然后点击“导出布局”（Export Layout）。将文件类型选择为PDF，在“名称”（Name）框中输入文件名并保存至计算机，将垂直分辨率为设置为500 DPI，点击“导出”（Export）以生成地图的PDF文件。cPCR分析揭示了甲烷循环相关基因检测的空间变异性：mcrA基因在所有LB和RV样品中均被检出，但在BC样品中未检出，表明盐度与产甲烷菌分布相关。使用A189-mb661引物对的cPCR结果显示pmoA1条带更亮，证实其在RV样品中虽含量较低但可被检测到，而在LB和BC样品中未检出。qPCR分析显示显著的季节性变化：mmoX基因在凉季丰度最高，而pmoA1基因在暖季丰度最高。