Name: 免疫荧光检测哺乳动物细胞中的核泡和 DNA 泄漏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学习使用免疫荧光技术在HeLa细胞中检测核泡和DNA泄漏，研究早衰综合征相关的DNA损伤修复机制。该方法有助于揭示核膜结构完整性对DNA修复效率的影响，为早衰症治疗提供潜在靶点。

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本研究工作获得了美国国家衰老研究所资助项目R03AG064525（资助对象：ASW）的支持。我们感谢Jason A. Stewart博士在技术指导方面的帮助，以及Hui Chen实验室提供本研究所使用的显微镜。同时，我们还要感谢Fabio Martinon提供了本实验所用的HeLa细胞系。

所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 材料准备
<ol>
	<li>在将细胞接种到盖玻片上之前，预先对至少十个 22 mm × 22 mm 的方形玻璃盖玻片和镊子进行高压灭菌。</li>
</ol>
2. 溶液的配制
<ol>
	<li>完全培养基：取500 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素，混匀。</li>
	<li>抗体稀释缓冲液（ADB）：将2 g牛血清白蛋白（BSA）和1 g鱼明胶溶于80 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，待BSA和鱼明胶完全溶解后，用PBS定容至100 mL。</li>
	<li>1×含吐温磷酸盐缓冲液（PBS-T）：取500 mL PBS和0.5 mL吐温，置于37 °C水浴中，直至吐温能充分混入溶液。</li>
</ol>
3. 培养目标细胞
注意：本方案中，HeLa 细胞在 T75 培养瓶中培养至完全汇合。
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒六片盖玻片，并将其放置在无绒布上自然晾干。使用镊子将盖玻片放入无菌的6孔板中，每孔一片。</li>
	<li>向6孔板的每个孔中加入2 mL含补充物的DMEM培养基。</li>
	<li>吸去细胞中的培养基，向培养瓶中加入15 mL PBS，轻轻晃动以洗涤细胞。随后吸去PBS，并加入2 mL胰蛋白酶-EDTA（胰蛋白酶）。
	<ol>
		<li>使胰蛋白酶充分覆盖细胞，然后将培养瓶放回37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育2分钟，以使细胞从瓶壁脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向培养瓶中加入8 mL含补充物的DMEM以收集已消化的细胞。反复吹打数次以分散成团的细胞。将收集的细胞悬液转移至15 mL聚苯乙烯离心管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将50万个细胞逐滴直接接种到6孔板中的每片盖玻片上。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养过夜。</li>
</ol>
4. 细胞固定与通透化
<ol>
	<li>使用前新鲜配制4%甲醛溶液：将2 mL 37.5%甲醛溶液加入18 mL PBS中，充分混匀。</li>
	<li>使用前新鲜配制通透化溶液：将100 µL Triton-X加入20 mL PBS中，置于37 °C水浴中孵育数分钟，直至Triton-X完全溶解，充分混匀。</li>
	<li>吸除培养板各孔中的培养基，每孔用2 mL PBS洗涤一次，吸净各孔中的PBS。</li>
	<li>每孔加入2 mL 4%甲醛溶液，室温（RT）静置10分钟，完全吸除各孔中的4%甲醛溶液。</li>
	<li>用2 mL PBS洗涤细胞3次，每次洗涤后彻底吸除孔内PBS。</li>
	<li>每孔加入2 mL通透化溶液，室温（RT）静置10分钟，完全吸除通透化溶液。</li>
	<li>用2 mL PBS洗涤细胞3次，前两次洗涤后完全吸除PBS，第三次洗涤后保留孔内PBS。 
	注意：此步骤后细胞可在含最后一次PBS洗涤液的条件下于4 °C保存数周，需用封口膜密封培养板以防止液体蒸发。若实验可继续进行，此步骤可省略。</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>从孔中移除所有 PBS。每孔加入 2 mL ADB 封闭细胞，在室温下振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 30 分钟封闭即将结束时，将一抗按 1:1,000 稀释比例溶于 ADB 中（Lamin B1 和 dsDNA 抗体均为此稀释比，表 1）。每个盖玻片需要 75 µL，因此六个盖玻片应混合 600 µL ADB、0.6 µL Lamin B 一抗和 0.6 µL dsDNA 抗体。充分涡旋混匀。</li>
	<li>移除孔中的 ADB。在平坦表面上，用胶带固定一张面积足够大的石蜡膜，用于放置所有待处理的盖玻片。</li>
	<li>对每个盖玻片，将 75 µL 一抗稀释液滴加到石蜡膜上，确保移液时 ADB 中无气泡。然后用镊子将盖玻片细胞面朝下放置于 ADB 液滴上。</li>
	<li>用培养板盖子盖住正在孵育的盖玻片，在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>用镊子将盖玻片从石蜡膜上取下，并放回 6 孔板中，细胞面朝上。</li>
	<li>用 2 mL PBS-T 洗涤盖玻片 3 次，每次振荡 3–5 分钟。每次洗涤后彻底移除孔中的 PBS-T。</li>
	<li>在最后一次洗涤期间，配制二抗稀释液（两种相应的二抗均为 1:1,000 稀释，表 1）。每个盖玻片需要 75 µL，因此六个盖玻片应混合 600 µL ADB 和每种 Alexa Fluor 标记的二抗各 0.6 µL。充分涡旋混匀。尽量避免二抗稀释液暴露于光照下。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">抗体</td>
			<td>来源</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">dsDNA 标记抗体 (HYB331-01)</td>
			<td>小鼠单克隆</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-58749</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>山羊</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A32723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 405</td>
			<td>山羊</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31553</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Lamin B1 多克隆抗体</td>
			<td>兔</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>12987-1-AP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594</td>
			<td>山羊</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：抗体。 本方案中使用的所有抗体列表。
<ol start="9">
	<li>移除最后一次洗涤中的全部 PBS-T。将盖玻片置于石蜡膜上，按步骤 5 的方法加入二抗稀释液，室温孵育 30 分钟。此步骤及后续所有步骤均需避光操作，可使用小盒子遮挡光线。在向孔中添加或移除溶液时，应迅速操作。</li>
	<li>用镊子将盖玻片从石蜡膜上取下，放回 6 孔板中，细胞面朝上。</li>
	<li>用 2 mL PBS-T 洗涤盖玻片 3 次，每次洗涤后彻底移除孔中的 PBS-T。</li>
	<li>用梯度乙醇（70%、90%、100%）对盖玻片进行脱水处理。首先向每孔加入 2 mL 70% 乙醇，静置 1–2 分钟后吸除全部乙醇，再依次用其余浓度的乙醇重复此步骤。</li>
	<li>用镊子将盖玻片从孔中取出，置于无绒擦拭纸上，避光自然晾干。</li>
	<li>每张盖玻片滴加 20 µL 封片剂，细胞面朝下封固于玻璃载玻片上，避光静置过夜使其完全干燥。</li>
</ol>
6. 图像采集
<ol>
	<li>成像前，用一层薄薄的透明指甲油（任何品牌或类型均可）涂抹盖玻片边缘。置于避光处自然晾干。 
	注意：使用显微镜进行成像的具体操作步骤因所用显微镜型号而异。本实验所用显微镜的相机分辨率为 1280 x 960 像素，类似或更高的分辨率均可满足要求。</li>
	<li>将载玻片放置于显微镜载物台前，必须先调整文件保存设置。打开显微镜并插入 U 盘。在显微镜设置中调整保存选项，确保所有通道（GFP 和 RFP）将被分别保存，并确认图像保存至 U 盘的正确位置。 
	注意：建议在 U 盘中创建一个文件夹，并为每张盖玻片命名，以便后续识别。</li>
	<li>成像前，将 70% 乙醇喷洒在无尘擦拭纸上，轻轻擦拭载玻片背面。随后小心清洁载玻片正面，确保施加的压力极小。</li>
	<li>将洁净的载玻片放置于显微镜上，盖玻片朝下。盖上遮光盒。</li>
	<li>使用 40 倍物镜，选择合适的通道（本实验中 lamin B1 抗体对应 RFP 通道），在显微镜屏幕上定位细胞核。初始光强调节至约 50%。</li>
	<li>为检查是否存在过饱和区域，请选择“Color Off”（关闭颜色）选项，并确认在黑白模式下盖玻片上无任何区域出现红色信号。若存在明显红色信号，应降低光强，直至红色信号最小化。 
	注意：红色信号表示信号过饱和。若细胞核几乎不可见，可每次增加 10% 光强，逐步调节至合适亮度，同时避免过饱和。</li>
	<li>使用相同光强检查其余所有盖玻片，确保均无过饱和现象。使用相同流程（本实验中 dsDNA 抗体对应 GFP 通道）检查另一通道下的所有盖玻片。</li>
	<li>记录每个通道的光强设置。在整个成像过程中，确保各通道的光强保持恒定。</li>
	<li>逐个对每张盖玻片进行成像。首先选择第一个通道，调焦至细胞核清晰，然后采集图像。</li>
	<li>小心切换通道，重新对细胞进行调焦。聚焦清晰后，采集图像。</li>
	<li>在所需通道（GFP 和 RFP）完成成像后，选择 Overlay（叠加）功能观察合并图像，确认成像过程中载玻片未发生移动。若通道图像未对齐，需重新采集相应通道图像，直至图像完全重合。</li>
	<li>点击 flash drive（U 盘）图标保存图像。移动至盖玻片的另一区域继续成像。 
	注意：每次成像应选择盖玻片的不同区域，避免重复采集同一区域。建议从盖玻片的左上角开始，按 &#34;S&#34; 形路径移动，以确保全面覆盖且无重复。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>通过该方法获得的数据为可视化图像。请检查图像中是否存在DNA泄漏或细胞核出泡现象。出泡和泄漏的示例如代表性结果部分所示。</li>
</ol>

<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
<li>Dittmer, T. A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lamin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The lamin protein family.</a> Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina comes of age.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).</li>
<li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+and+ZMPSTE24+%28FACE-1%29+defects+cause+nuclear+disorganization+and+identify+restrictive+dermopathy+as+a+lethal+neonatal+laminopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).</li>
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<li>Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-translational+processing+of+prelamin+A+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The post-translational processing of prelamin A and disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).</li>
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<li>Fong, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygosity+for+Lmna+deficiency+eliminates+the+progeria-like+phenotypes+in+Zmpste24-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).</li>
<li>Pendas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+prelamin+A+processing+and+muscular+and+adipocyte+alterations+in+Zmpste24+metalloproteinase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice.</a> Nat Genet. 31, 94-99 (2002).</li>
<li>Goldman, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mutant+lamin+A+causes+progressive+changes+in+nuclear+architecture+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).</li>
<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
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<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案包含多个关键步骤，其中最重要的步骤是对固定后的细胞进行一抗和二抗处理。使用高质量的一抗针对目标分子，并选用与所用显微镜荧光检测范围相匹配的合适荧光标记二抗，将获得最佳结果19。抗体质量会显著影响该技术的结果，因为不合格的抗体可能与非特异性靶点结合，或无法识别目标分子19,20。此外，若信号过弱或无信号，应调整一抗和二抗的稀释比例，以确保信号强度高于背景水平，同时注意避免信号过度饱和19,20。优化封闭条件有助于减少成像伪影20。对于免疫荧光实验，抗体的最佳稀释比例通常需要根据不同实验体系进行调整，但成功的稀释比例一般位于生产商推荐的范围内。除稀释比例外，还应严格遵循实验步骤的时间安排。细胞在溶液和抗体处理过程中若时间过长或不足，均可能导致成像伪影或细胞损伤19</sup...

核纤层是一种位于核膜下方的纤维网络，由称为核纤层蛋白（lamins）的蛋白质组成。核纤层在细胞核结构、核孔定位、基因表达调控、染色质组织、DNA复制以及DNA修复中发挥着重要作用1,2,3。参与核纤层蛋白表达的基因发生突变会导致一类称为核纤层蛋白病（laminopathies）的遗传性疾病3。
限制性皮肤症（RD）是一种严重的核纤层蛋白病，主要由ZMPSTE24基因中的复合杂合突变引起，这些突变在基因中产生提前终止密码子4，导致金属蛋白酶ZMPSTE24缺失。该核纤层蛋白病的特征包括宫内生长迟缓、皮肤紧绷僵硬、小口、毛发稀疏以及骨矿化缺陷1。由于肺功能不全，RD患者通常无法存活超过出生后第一周1。另外两种核纤层蛋白病——非典型Hutchinson-Gilford早衰综合征（AT-HGPS）和B型下颌骨发育不良（MAD-B）——与ZMPSTE24表达降低有关，表现为寿命缩短，并具有早衰样表型特征5。这些核纤层蛋白病所影响的ZMPSTE24蛋白酶在核纤层蛋白A的翻译后修饰过程中起关键作用，而核纤层蛋白A是核纤层的重要组成成分。ZMPSTE24缺乏会导致一种未完全加工的法尼基化核纤层蛋白A前体（称为前体核纤层蛋白A）在细胞内积聚2。
<img alt="核纤层蛋白A加工示意图；正常情况与ZMPSTE24缺乏症的比较；法尼酰化、甲基化通路。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1正常情况下的核纤层蛋白A加工 与RD 细胞 正常细胞中的核纤层蛋白A加工通路（左）与限制性皮病（RD）或ZMPSTE24缺陷细胞中异常的核纤层蛋白A加工（右）。图中显示了法呢基（Fa）和甲基（Me）基团。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
如图1所示，在正常的核纤层蛋白A（lamin A）加工过程中，法尼基（一种脂质）基团会连接到靠近C末端的一个半胱氨酸残基上，随后通过蛋白水解作用切除C末端的三个氨基酸3,6。接着，该半胱氨酸残基被甲基化。这两个修饰使前体核纤层蛋白A（prelamin A）能够靶向定位于核内膜2。随后，ZMPSTE24酶执行一次切割反应，将最后15个C末端氨基酸以及法尼基和甲基基团一并去除，从而生成成熟的核纤层蛋白A，并将其运送至核纤层结构6,7,8。在限制性皮病（RD）、典型早老综合征（AT-HGPS）和代谢性异常早老综合征B型（MAD-B）中，由于ZMPSTE24金属蛋白酶缺失或功能不全，导致该加工过程的最后一步无法有效完成8,9。这导致前体核纤层蛋白A积累，并持续保持法尼基化和甲基化状态9。这些修饰基团使得前体核纤层蛋白A滞留在核内膜上，而非正常地定位于核纤层——即成熟核纤层蛋白A应有的归宿位置，如图1所示。因此，ZMPSTE24缺乏会对核结构及多种核功能产生深远影响10,11,12,13,14,15。这些核结构的改变可能包括核出芽（核膜凸起）甚至核破裂，进而导致DNA泄漏至胞质溶胶中，同时胞质溶胶成分也可能侵入细胞核内。异常形态的细胞核确实是核纤层蛋白病的典型特征，此外还有多种由前体核纤层蛋白A加工缺陷引起的表型变化16,17。核纤层结构的缺陷会引发一系列有害后果，包括核蛋白质量控制机制相关蛋白和DNA修复蛋白在核质中的错误定位，进而导致多种核功能障碍18。因此，建立一种简便的技术手段来识别和监测核纤层蛋白病的这些标志性特征，对于推动针对改善核纤层蛋白病表型的治疗策略研究具有重要意义。在核纤层蛋白病小鼠模型中已证实，核出芽现象的消除与整体疾病表型的广泛缓解密切相关16。若能建立一种可在人类细胞中监测核完整性的技术，将有助于深入研究潜在治疗方法，以期消除或显著改善疾病的表型表现。
间接免疫荧光（IF）是一种灵敏且广泛应用的技术，该技术使用一种未标记的一抗和一种可识别一抗的荧光素标记二抗，以检测目标分子19。IF 方法能够有效可视化特定的细胞内组分和结构。此外，多个二抗分子可能与同一一抗结合，从而实现信号放大19。间接免疫荧光是一种多功能技术，仅需少量二抗即可检测多种不同的一抗，因为二抗是针对一抗的 Fc 区域产生的，而该区域在同一种属内具有高度保守性19。
本文介绍了一种间接免疫荧光（IF）方法，用于评估ZMPSTE24缺陷细胞中的核出芽和DNA泄漏现象，该方法使用针对双链DNA（dsDNA）和lamin B1的抗体分别检测DNA和核纤层。为验证该方法的有效性，将其应用于ZMPSTE24基因敲除的HeLa细胞系以及表达ZMPSTE24的HeLa细胞系，并对两种细胞系的实验结果进行了比较。

<table><tbody><tr><td>22 mm 方形玻璃盖玻片</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>只要能够固定在标准显微镜载玻片上，任何尺寸或形状均可使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>36.5% 甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>固定剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>75 cm² 培养瓶</td><td>康宁</td><td>430725U</td><td>用于细胞培养。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>抗体稀释缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含1 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的DMEM培养基 &amp;& 毒性丙酮酸钠</td><td>康宁</td><td>10-014-CV</td><td>用于细胞培养。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>在封片前对样品进行脱水处理，并稀释以制备多种浓度。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EVOS FL 数字倒置荧光显微镜</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>成像。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>鱼明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>抗体稀释缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>防止光漂白的封片剂。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm（4 英寸）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>只要所使用的盖玻片能够容纳，任何尺寸均可替换。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>用于细胞培养。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>在实验室中制备并灭菌，用于组织培养和溶液配制。</td></tr><tr><td>优质胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>用于细胞培养。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Superfrost Premium 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>可使用任何标准显微镜载玻片。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>组织培养处理的6孔平底板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>用于细胞培养。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A16046.AP</td><td>用于洗涤。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%）</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>用于细胞培养。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>细胞渗透试剂&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过免疫荧光法检测哺乳动物细胞中的核出芽和dna泄漏

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

核纤层是位于核膜下方的纤维网络结构，由核纤层蛋白（lamins）和核纤层相关蛋白组成。它在核结构维持、核孔定位、基因表达调控、染色质组织、DNA复制以及DNA修复等过程中发挥关键作用。参与核纤层蛋白表达或翻译后加工的基因发生突变，会导致一类称为核纤层蛋白病（laminopathies）的遗传性疾病。具体而言，LMNA 或 ZMPSTE24 基因的突变可导致前体核纤层蛋白A（lamin A）未能完全加工，从而保留了法尼基（farnesyl）和甲基（methyl）基团，而这些基团在完全加工成熟的核纤层蛋白A中是不存在的。这些未完全加工的核纤层蛋白A会定位于内层核膜，而非成熟核纤层蛋白A所在的核纤层区域。错位定位的核纤层蛋白会严重破坏细胞核的功能与结构，常导致核出芽（nuclear blebbing）。在严重情况下，可能发生核破裂，造成核内外区室化丧失，基因组DNA泄漏至细胞质中。异常的核结构及区室化丧失可通过固定细胞的间接免疫荧光（IF）技术进行识别。本研究概述了该方法，采用特异性针对核纤层蛋白和双链DNA（dsDNA）的抗体，同时可视化核膜和DNA，从而实现对核结构完整性的快速评估，并检测核DNA是否可能泄漏至细胞质中。

本研究介绍了一种用于可视化核纤层与双链DNA（dsDNA）的免疫荧光（IF）方法。完成免疫荧光染色后，可对所获取的图像进行分析，以观察核出泡和DNA泄漏的迹象。
<img alt="HeLa细胞核研究；荧光显微镜图像及出芽差异的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：HeLa对照（CT）和 ZMPSTE24基因敲除（KO）细胞中的核出芽现象。 用于确定核出芽数量频率的两种细胞系的代表性图像。（A）使用红色（Alexa Fluor 594标记的...

层蛋白病常导致核膜发生改变，进而引起核出芽和泄漏。本研究介绍了一种免疫荧光方法，用于同时可视化核纤层和双链DNA（dsDNA），从而评估哺乳动物细胞的核结构与完整性。

通过免疫荧光法检测哺乳动物细胞中的核出芽和DNA泄漏

核纤层是位于核膜下方的纤维网络，由核纤层蛋白（lamins）和核纤层相关蛋白组成。它在……中发挥关键作用。

我们的研究主要聚焦于DNA修复与衰老之间的关联。具体而言，我们关注不同的层蛋白病（laminopathy）疾病，并希望了解这些疾病可能如何影响DNA修复。我们已证实，一种与早衰和寿命缩短相关的层蛋白病——Hutchinson-Gilford早衰综合征——实际上与DNA损伤的增加以及不精确的DNA修复密切相关。我们的实验室希望研究潜在疗法对层蛋白病患者的影响，以了解这些方法是否也会对DNA修复和DNA损伤产生积极影响。首先，使用镊子将一张盖玻片放入无菌6孔板的每个孔中。向6孔板的每孔中加入2毫升添加补充物的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。吸出培养瓶中 HeLa 细胞的培养基，加入 15 毫升 PBS 洗涤细胞。轻轻摇晃培养瓶以洗涤细胞，吸去 PBS，然后加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液以覆盖细胞。将含有胰蛋白酶的培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 2 分钟，使细胞脱落。然后向含有消化后细胞的培养瓶中加入8毫升添加了补加物的DMEM培养基，反复吹打数次以分散成团的细胞。将细胞悬液收集到15毫升聚苯乙烯离心管中。计数细胞后，将500,000个细胞逐滴直接接种到6孔板中每个盖玻片上。将培养板放入37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中，使细胞过夜生长。进行细胞固定时，于次日吸去6孔板各孔中的培养基。每孔加入2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后彻底吸去各孔中的全部PBS。然后每孔加入 2 毫升 4% 多聚甲醛溶液，室温孵育 10 分钟，随后彻底吸除各孔中的溶液。接着每孔加入 2 毫升通透液，室温静置 10 分钟，然后彻底吸除。 用每孔 2 毫升的 PBS 洗涤细胞三次，每次洗涤后彻底吸净。待所有 PBS 从孔中完全吸出后，向每孔加入 2 毫升抗体稀释缓冲液（ADB），以封闭细胞，用于免疫荧光染色。在室温下孵育30分钟，并轻轻进行圆周振荡。在封闭阶段即将结束时，通过将腔室B1和双链DNA抗体加入ADB中混合，制备一抗稀释液。孵育结束后，吸去孔中的 ADB。将一片石蜡膜平整地贴在平面上，确保其面积足够容纳所有待处理的盖玻片。对于每一片盖玻片，用移液器吸取 75 µL 一抗稀释液滴加到石蜡膜上，注意避免产生气泡。用镊子将每张盖玻片有细胞的一面朝下放置在抗体液滴上。用6孔板的盖子盖住正在孵育的盖玻片，于室温孵育1小时。然后用镊子小心地将盖玻片从石蜡膜上取下，并将其放回6孔板中，细胞面朝上。用两毫升 PBST 将盖玻片振荡洗涤三次，每次五分钟。在最后一次洗涤期间，配制二抗稀释液。最后一次洗涤后，彻底吸除 PBST。将二抗加入石蜡膜上，将盖玻片细胞面朝下放置于石蜡膜上。然后在盖玻片上加盖一层轻质保护罩，避免细胞暴露于光线下，室温孵育30分钟。使用镊子小心地将盖玻片从石蜡膜上取下，并放回6孔板中，确保细胞面朝上。随后通过依次向孔中加入2 mL 70%、90%和100%乙醇进行脱水处理，每种溶液孵育1至2分钟后再移除。用镊子将盖玻片从孔中取出，放置在无绒擦拭纸上，在避光条件下晾干。将盖玻片细胞面朝下，用封片剂（每张盖玻片20 µL）封固于玻璃显微镜载片上。与HeLa对照细胞中17%的细胞核出现出芽相比，HeLa ZMPST24基因敲除细胞中核出芽现象更为普遍，约50%的细胞核表现出出芽结构。在HeLa ZMPSTE24基因敲除细胞中主要观察到DNA泄漏，而在HeLa对照细胞中未观察到DNA泄漏；即使在无可见细胞核出泡的情况下，部分ZMPSTE24基因敲除细胞中仍出现DNA泄漏。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

免疫荧光检测哺乳动物细胞中的核泡和 DNA 泄漏

本文描述了一种在活细胞中观察单个DNA分子的方法。该技术基于荧光标记的lac阻遏蛋白与已构建到目的DNA上的结合位点之间的结合。此方法可被用于在活细胞中随时间追踪多种重组DNA。...

通过荧光显微镜在活体哺乳动物细胞中监测质粒在多个世代中的复制

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。...

基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

在本视频中，我们介绍了免疫荧光显微技术，用于检测定位于人单个核细胞DNA双链断裂位点的特定DNA损伤应答蛋白。这些蛋白可被特异性的一抗识别，一抗进而结合带有荧光染料标记的二抗；在显微镜观察时，二抗发出荧光，从而使得细胞核内这些蛋白呈现为清晰可辨的荧光焦点，实现可视化观察。...

用于分析DNA双链断裂的免疫荧光显微镜技术

本手稿描述了一种新技术，该技术能够在荧光标记的纳米颗粒被内吞后，直接在活细胞内检测其细胞内基因表达。该方法无需对细胞进行操作，且不受目标基因或物种的限制。...

利用荧光标记纳米颗粒检测小鼠、人类和猪源性活细胞内的基因表达

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。...

激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

活细胞成像能够提供单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息仅通过固定细胞成像无法获得。本文描述了在使用抗有丝分裂药物紫杉醇处理后，通过活细胞成像技术评估细胞命运决定的实验方案。...

长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

中子混合束在硼中子俘获治疗（BNCT）中的应用所引发的辐射诱导DNA损伤应答尚未完全阐明。本方案提供了一步一步的操作流程，用于在中子混合束辐照后，通过免疫荧光染色法检测人结肠癌细胞系中DNA修复蛋白的辐射诱导焦点（RIF）。...

人结肠癌细胞中DNA损伤与修复灶的免疫荧光成像

在本实验方案中，我们演示了如何利用基于免疫荧光的方法，在细胞周期的 S/G2 期可视化 DNA...

利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

学习使用免疫荧光技术在HeLa细胞中检测核泡和DNA泄漏，研究早衰综合征相关的DNA损伤修复机制。该方法有助于揭示核膜结构完整性对DNA修复效率的影响，为早衰症治疗提供潜在靶点。

通过免疫荧光法检测哺乳动物细胞中的核出芽和DNA泄漏

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