在生理腔内压下对小肺静脉中的 Ca²⁺ 信号进行成像

在该协议中，我们提出了一种新技术，用于在生理腔内压下记录和分析肺内静脉（小肺静脉或 PV）中的 Ca^{2 +} 信号。该技术包括分离小 PV、用 Ca²⁺ 指示剂孵育、插管和加压、Ca²⁺ 信号的共聚焦成像和数据分析。

钙信号调节血管功能，其来源和作用各不相同。我们的目标是了解它们在血管壁中的特定功能，并识别与疾病相关的异常。大多数肺血管研究侧重于动脉或毛细血管，而不是肺静脉。

没有研究检查过正常腔内压下肺静脉中的钙信号，尽管它们具有生理相关性。肺静脉在心动周期中经历压力变化，但它们对钙信号的影响尚未得到研究。我们的协议能够在常压下采集和自动分析小肺静脉中的钙信号。

我们的协议使未来能够研究腔内压如何影响小肺静脉中的钙信号，从而促进对它们在健康和疾病中的调节和作用的理解。首先，用 100% 乙醇清洁解剖工具和培养皿，然后用去离子水清洗。用一把剪刀。

打开安乐死小鼠的胸腔。使用镊子小心地从胸腔中取出心脏和肺，尽量减少对肺部的接触。接下来，将组织放在含有冷 HEPES 缓冲生理盐溶液的密封保护涂层板上。

使用夹层针固定心脏和肺，以便清楚地看到大肺静脉和肺动脉，并略微拉伸肺的左叶。使用大肺静脉作为参考点，在细剪刀的帮助下小心地去除小肺间静脉周围的组织。然后轻轻地将小肺静脉与周围组织隔离开来。

接下来，用 DMSO 制备 2.5 毫摩尔 Fluo-4 AM 的储备液浓度。使用储备液，制备上样溶液。将小肺静脉放入装有上样溶液的 1.5 毫升试管中。

用铝箔盖住试管，在 37 摄氏度的水浴中孵育 1 小时。要插管小肺静脉，请从洗涤液中取出一条静脉。将其放入准备好的压力肌层成像室中。

用一对细尖镊子，小心地将小肺静脉的一端插管到其中一个插管上，然后用尼龙线微丝在小肺静脉的插管端和插管尖端打一个结以固定它。轻轻将生理盐溶液推入套管，以去除肺静脉内的血液。使用尼龙线将另一端与使用微丝的玻璃套管系在一起。

对于钙成像，首先将伺服压力控制器连接到含有 HEPES 缓冲生理盐溶液的管道上。使用控制器从一端对小肺静脉加压。现在将蠕动泵连接到入口、出口和出口，并对溶液进行超级熔注。

平衡期后，使用 40 倍水浸物镜和转盘共聚焦成像系统获取 1， 000 帧的钙图像。要执行图像分析，请启动自定义设计的 Spark 和软件。使用 5 x 5 滤镜和中值滤镜对图像进行平滑处理，然后画出一个框，勾勒出肺静脉的平坦区域，其中包含多个单元，用于事件自动检测。

单击 view 和 Event Auto Detection。将事件阈值设置为 F0 上 1.3F 的振幅，将容差设置为 20%，扫描框设置为 7 x 7 像素，将运行平均值设置为 7 个图像。点击 开始搜索 或眼睛图标。

通过单击视图菜单下的 small events 表找到事件表，然后通过将检测到的钙离子信号数量除以所选帧的面积来计算每平方微米的事件数。在基础条件下，在 5 毫米汞柱腔内压下，小肺静脉中自发发生的钙信号数量为每分钟每平方微米 0.73 个正负 0.2 个事件。兰尼碱的添加大大降低了钙信号活性。