在生理管腔压力下对小肺静脉中的 Ca²⁺ 信号进行成像

钙信号调控血管功能，其来源和作用各不相同。我们的目标是明确这些信号在血管壁中的特定功能，并识别与疾病相关的异常变化。目前大多数肺血管研究集中于动脉或毛细血管，而非肺静脉。

尽管肺静脉中的钙信号具有生理相关性，但尚无研究在正常管腔压力下对其进行过考察。肺静脉在心动周期中会经历压力变化，但这种变化对钙信号的影响尚未被研究。本方案可实现对正常压力下小肺静脉中钙信号的采集与自动分析。

本方案可为未来研究肺小静脉内腔压力如何影响钙信号提供支持，从而加深对肺小静脉在健康与疾病状态下调控机制及其作用的理解。首先，用100%乙醇清洗解剖器械和培养皿，然后用去离子水冲洗。使用一把剪刀。

打开已安乐死小鼠的胸腔。使用镊子小心地将心脏和肺从胸腔中取出，尽量减少对肺组织的触碰。随后，将组织置于含有冷的HEPES缓冲生理盐溶液的防污染涂层培养皿中。

使用解剖针固定心脏和肺，使肺静脉和肺动脉清晰可见，并使肺的左叶轻微拉伸。以较大的肺静脉作为参考点，在精细剪刀的辅助下，小心去除小肺间静脉周围的组织。然后轻柔地将小肺静脉从周围组织中分离出来。

接下来，用DMSO配制2.5毫摩尔/升的Fluo-4 AM储备液。使用该储备液配制染色工作液。将小肺静脉置于含有染色工作液的1.5毫升离心管中。

用铝箔覆盖试管，在37摄氏度水浴中孵育1小时。为插管小肺静脉，从清洗液中取出一条静脉，放入已准备好的压力肌动图腔室中。

用一对尖头镊子小心地将小肺静脉的一端套入其中一个套管，然后使用尼龙线微丝在小肺静脉的套管端与套管尖端周围打结固定。轻轻通过套管推注生理盐溶液，以清除肺静脉内的血液。使用尼龙线并通过微丝将另一端用玻璃套管结扎封闭。

进行钙成像时，首先将伺服压力控制器连接到装有HEPES缓冲生理盐溶液的管路上。使用该控制器从一端对小肺静脉加压。然后将蠕动泵连接至一个入口和一个出口，并对组织进行灌流。

平衡期结束后，使用40倍水浸物镜和转盘共聚焦成像系统采集1000帧钙成像图像。进行图像分析时，启动自行设计的Spark软件。采用5×5滤波器和中值滤波对图像进行平滑处理，随后框选肺静脉中包含多个细胞的平坦区域，用于事件自动检测。

单击“查看”和“事件自动检测”。将事件阈值设置为 F0 以上 1.3F 的振幅，容差设为 20%，扫描框设为 7×7 像素，运行平均值设为 7 幅图像。单击“开始搜索”或眼睛图标。

通过点击“视图”菜单下的小型事件表找到事件表，然后将检测到的钙离子信号数量除以所选帧的面积，计算每平方微米的事件数。在基础条件下，当腔内压力为5毫米汞柱时，小肺静脉中自发性钙信号的发生率为每分钟每平方微米0.73 ± 0.2个事件。加入雷尼丁（ryanodine）后，钙信号活性显著降低。