Name: 在小鼠骨髓损伤模型中通过膜内骨化研究产后成骨的改进方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: 了解小鼠骨髓损伤模型中膜内骨化的产后成骨机制。本方法通过手术消融建立可控环境，用于评估骨骼干细胞在骨修复中的贡献及治疗靶点。

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本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）R01-DE030716-01 和 NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 项目资助，受资助人为 AS；由美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）R01AR080131 项目资助，受资助人为 RG；以及由康涅狄格大学研究与教育合作（UConn REP）融合计划资助，受资助人为 RG 和 AS。

以下操作均获得康涅狄格大学健康中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。所有手术均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南所述的无菌条件进行。通过使用适当的镇痛剂和防腐剂控制疼痛和感染风险，以确保手术成功。
1. 手术区域和器械的准备
<ol>
	<li>使用临床级消毒清洁剂对操作台面进行消毒，准备手术操作室。 
	注意：手术人员应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括无菌一次性手套、头帽、手术衣和口罩。</li>
	<li>准备覆盖有无菌手术垫的加热垫。收集并摆放所有无菌器械和试剂（材料表），确保取用方便。</li>
</ol>
2. 术前麻醉
<ol>
	<li>手术前称量所有小鼠的体重。根据所用的丁丙诺啡镇痛剂剂型，计算所需镇痛剂的使用剂量。</li>
	<li>在无菌工作区域内组装动物麻醉装置，包括诱导室和鼻罩组件。将氧气输出量设置为 2 L min-1 异氟烷浓度根据小鼠年龄和体重调整至1.5–3%（v/v）。</li>
	<li>小鼠麻醉后，将其从诱导室中取出，置于无菌手术垫上，保持仰卧位。在双眼涂抹眼用润滑剂。将鼻罩罩住头部。轻轻捏压脚趾以检查小鼠是否已充分麻醉，确认无后肢反射反应后方可继续操作。</li>
	<li>手术前，短暂地将小鼠从鼻罩中取出&#160;通过皮下途径注射缓释丁丙诺啡的总剂量；总剂量为3.25 mg/kg。</li>
</ol>
3. 手术操作描述
注意：本手术使用 10 至 24 周龄的 C57BL/6 雄性和雌性小鼠。根据已有研究10,11，该手术也可在 6 周龄至 33 周龄的小鼠以及多种近交系小鼠上进行。较年轻的小鼠可能需要较短的针头长度，而较年长或体型较大的小鼠可能需要较长的针头。
<ol>
	<li>使用带有26 G针头的3 mL注射器吸取无菌生理盐水。将其放置一旁备用。</li>
	<li>使用电动或电池驱动的剪毛器（#40刀头）去除将要进行操作的后肢部位的毛发，并清除手术区域内的松散毛发。用无菌棉签蘸取碘伏类消毒剂（10%聚维酮碘），从膝关节中心开始向外做环形擦拭，随后使用70%异丙醇进行擦拭。擦洗完成后让手术区域自然干燥。重复上述消毒步骤3次。&#160;</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定，屈曲手术侧肢体的膝关节。用非优势手握住小鼠腿部，使膝关节弯曲并搭在中指上，食指置于股骨上，拇指置于胫骨上。</li>
	<li>使用手术刀在髌骨下方做一个小而浅的横向切口。 
	注意：此步骤有助于更好地观察进针位置。随着操作经验的积累，此步骤可省略。</li>
	<li>将针头水平置于屈曲的膝关节处，通过触诊寻找股骨与胫骨之间的关节间隙。以此解剖位置为引导，使用25 G针头手动钻入（通过旋转针头并同时施加适度压力），从膝关节方向向近端钻入远端股骨。针头可穿过或绕过髌骨进入。</li>
	<li>对小鼠进行X射线成像，以确认针头已正确置于骨髓腔内，并尽可能接近中心位置（图1）。</li>
	<li>取出25 G针头，立即在同一骨髓腔孔道中插入26 G针头。以环形动作在骨髓腔内壁研磨至少5次，直至感觉光滑。每只小鼠的研磨次数应保持一致。 
	注意：若操作不慎，步骤3.5和3.7可能造成术者针刺伤。</li>
	<li>取出26 G针头，换上连接生理盐水注射器的26 G针头。冲洗骨髓腔，直至回流液变得澄清。通常需要1.5–2 mL生理盐水。冲洗完成后取出注射器和针头，并将其安全丢弃至锐器盒中。 
	注意：推注液体时不应有明显阻力。如有阻力，应重新插入针头以确保其位于骨髓腔内，必要时可将针头退出一半再调整位置。</li>
	<li>使用皮肤黏合剂关闭皮肤切口。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>手术后立即使用步骤 2.4 中的剂量给予剩余半剂量的缓释丁丙诺啡。 
	注意：缓释丁丙诺啡可提供长达 72 小时的镇痛作用。</li>
	<li>将动物置于加热垫上，监测其是否出现正常、无阻塞的呼吸迹象，直至从手术中苏醒。一旦能够自主活动，即将小鼠放回其笼中。</li>
	<li>术后每天监测小鼠一次，持续 3 天，以确保其正常愈合且活动能力完全恢复，并观察是否存在疼痛迹象。</li>
</ol>
5. 用于µCT扫描和分析的骨骼处理
<ol>
	<li>根据 IACUC 或其他适用的机构政策所规定并批准的人道安乐死方法对小鼠实施安乐死。本实验中主要采用 CO2 吸入法进行安乐死，随后以颈椎脱位法作为辅助手段。</li>
	<li>剥离后肢周围的皮肤，并在髋关节处将整个下肢取下，以获取股骨。</li>
	<li>将每条下肢夹在包埋盒中的两块海绵之间。将装有骨骼的包埋盒转移至10%福尔马林溶液中，在4 °C下固定5–7天，具体时间根据小鼠的年龄和体型调整。 
	注意：固定时间过长或过短均会导致骨髓分辨率不佳。</li>
	<li>固定完成后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗包埋盒，每次5分钟，共清洗3次。</li>
	<li>从包埋盒中取出下肢，根据需要使用解剖刀剔除肌肉组织。 
	注意：根据后续应用的不同，粗暴操作可能会破坏骨的骨膜层。</li>
	<li>使用小型手术剪或解剖刀小心切断韧带，在膝关节处分离股骨。 
	注意：胫骨可用于其他实验或予以丢弃。</li>
	<li>将股骨转移至1.7 mL或15 mL的锥形管中，放入70%乙醇溶液。骨骼可在4 °C下保存于70%乙醇中，直至进行µCT扫描。</li>
	<li>对股骨进行扫描并评估其骨小梁参数，获得定性和定量数据。</li>
</ol>
6. 骨组织的冷冻切片与组织学处理
注意：骨骼在完成µCT扫描后，可进行冷冻切片和组织学处理。扫描不会影响荧光标记或后续的抗体染色。
<ol>
	<li>将骨骼从70%乙醇转移至PBS中，洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在4 °C下依次使用10%、20%至30%的PBS蔗糖溶液进行孵育，每种浓度均过夜孵育。骨骼可在4 °C下保存于30%蔗糖溶液中最多5天，或在-20 °C下保存6至12个月，直至准备包埋。 
	注意：使用蔗糖梯度可获得更好的组织渗透效果。在完成步骤6.1后，骨骼可直接放入30%蔗糖溶液中过夜。</li>
	<li>使用冷冻包埋模具将骨骼包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在-80 °C下保存，直至准备切片。</li>
	<li>采用胶带辅助冷冻切片法（cryofilm tape method），在恒温冷冻切片机温度设定为-24 °C至-26 °C的条件下对包埋的骨骼进行切片。</li>
	<li>将胶带上的切片转移至防脱玻片上，使用光学胶粘剂粘附，并用紫外（UV）交联仪照射至胶体完全固化。</li>
</ol>
7. 流式细胞术样品处理
注意：本方案适用于多种抗体。为鉴定骨骼干细胞及其前体细胞，建议将3至4块骨骼合并处理，因为这些细胞在骨髓中较为稀少。
<ol>
	<li>制备荧光激活细胞分选（FACS）染色缓冲液（FSM）。配制1000 mL FSM溶液：将100 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）、10 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、20 mL 胎牛血清（FBS）和870 mL 去离子水（dd H₂O）混合。将FSM溶液经0.2 µm滤膜过滤。</li>
	<li>在收获组织前，向培养皿中加入4–5 mL无钙镁的无菌PBS。</li>
	<li>制备消化液
	<ol>
		<li>每4–6根股骨，配制10 mL PBS溶液，其中含0.005 g胶原酶P和0.02 g透明质酸酶。轻轻涡旋混匀，并经0.22 µm滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤5.2所述，在术后第3天收获骨骼。用手术刀片彻底去除所有肌肉和结缔组织。</li>
	<li>向培养皿中加入5 mL消化液。将4–6根骨骼放入消化液中，精细剪碎，先做纵向切割，再做横向切割。</li>
	<li>将组织转移至14 mL圆底离心管中，用封口膜密封，并用铝箔包裹。</li>
	<li>将离心管水平置于摇床上，37 °C振荡20分钟。</li>
	<li>从摇床取下离心管。细胞会聚集在管底。轻柔收集消化后的上清液，避免扰动底部细胞，将消化液经70 µm滤膜过滤，滤液收集至另一含有10 mL冷FSM的新50 mL离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>向管中残留的细胞加入剩余的5 mL消化液。再次用封口膜密封，并用铝箔包裹。按上述方法振荡。重复步骤7.7–7.8。</li>
	<li>37 °C孵育20分钟后，将消化液再次经70 µm滤膜过滤，加入另10 mL FSM，转移至与步骤7.8相同的收集管中。</li>
	<li>将悬液在4 °C下以274 × g离心。吸除上清液，收集细胞沉淀。通过轻敲离心管使沉淀松散。 
	注：离心力（g）基于170 mm转子半径。请核对实际转子半径并相应调整转速。</li>
	<li>进行红细胞裂解时，加入1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液。所有试剂和细胞均需保持在冰上。</li>
	<li>室温下在ACK缓冲液中孵育约5分钟。孵育时间不得超过5分钟，以免过度裂解细胞。</li>
	<li>加入9 mL FSM，于4 °C以274 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液。通过在试管架上轻轻刮动离心管使细胞沉淀重悬。</li>
	<li>加入10 mL FSM（适用于4根骨骼，可根据合并骨骼数量调整体积），重悬细胞。</li>
	<li>取各样品等分试样，按制造商说明书加入碘化丙啶（PI）。使用细胞计数仪计数活细胞和总细胞数。</li>
	<li>使用目标标记物对样品进行抗体染色，用于流式细胞术分析12,13,14。</li>
</ol>

Improved Bone Marrow Injury Model for Intramembranous Bone Repair Studies

<ol><li>Bahney, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+biology+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular biology of fracture healing.</a> J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).</li>
<li>Ko, F. C., Sumner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+faithfully+does+intramembranous+bone+regeneration+recapitulate+embryonic+skeletal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development.</a> Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).</li>
<li>Patt, H. M., Maloney, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+regeneration+after+local+injury%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow regeneration after local injury: a review.</a> Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).</li>
<li>Chitnis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+bone+fractures%3A+treatment+patterns+and+factors+contributing+to+use+of+intramedullary+nailing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing.</a> Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).</li>
<li>Singaram, S., Naidoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+impact+of+long+bone+fractures+on+adults+in+KwaZulu-Natal%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+J+Physiother%22%5BJournal%5D)">The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal.</a> S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopedic+implants+and+devices+for+bone+fractures+and+defects%3A+past%2C+present+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective.</a> Eng Regen. 1, 6-18 (2020).</li>
<li>Marsell, R., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">The biology of fracture healing.</a> Injury. 42 (6), 551-555 (2011).</li>
<li>Katagiri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein-induced+heterotopic+bone+formation%3A+what+have+we+learned+from+the+history+of+a+half+century%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+Dent+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century.</a> Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).</li>
<li>Wise, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+gene+expression+profiling+during+rat+femoral+marrow+ablation-induced+intramembranous+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration.</a> PLoS One. 5 (10), e12987(2010).</li>
<li>Chen, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan-deficient+mice+have+delayed+osteogenesis+after+marrow+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation.</a> Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).</li>
<li>Moran, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+bone+regeneration+differs+among+common+inbred+mouse+strains+following+marrow+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation.</a> J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).</li>
<li>Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+periosteal+skeletal+stem%2Fprogenitor+cells+contribute+distinct+to+bone+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair.</a> Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).</li>
<li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol. 13, 930358(2022).</li>
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<li>Moran, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+bone+regeneration+in+diversity+outbred+mice+is+heritable%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable.</a> Bone. 164, 116524(2022).</li>
<li>Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+bone+healing%3A+fracture%2C+marrow+ablation%2C+and+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).</li>
<li>Cooper, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+critical+size+in+calvarial+bone+defects%3A+revisiting+the+concept+of+a+critical-size+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect.</a> Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).</li>
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<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomic+interrogation+of+the+murine+bone+marrow+signaling+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape.</a> Bone Res. 11 (1), 59(2023).</li>
<li>Yu, V. W. C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the bone marrow niche.</a> Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).</li>
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<li>Mizuhashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+zone+of+the+growth+plate+houses+a+unique+class+of+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.</a> Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).</li>
<li>Muruganandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FoxA2%2B+long-term+stem+cell+population+is+necessary+for+growth+plate+cartilage+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).</li>
</ol>

作者无任何披露事项需要报告。

本研究旨在建立一种可靠且可重复的方法，用于研究调控骨修复的分子与细胞过程，重点关注骨骼干细胞和祖细胞（SSPCs）在骨髓腔内直接转化为成骨细胞并沉积骨组织的过程。本文所述的机械性骨髓清除方法，是一种经过优化和验证的通过机械损伤实现骨髓清除的实验方案，可用于研究膜内成骨过程。该方案中的多个步骤至关重要，以确保损伤后出现显著的骨形成，并保证技术的可重复性。首先是将针头精确插入股骨髓腔。此步骤若发生错位，可能导致骨髓损伤不完全，并损害周围组织，从而引起实验结果的变异性。为确保针头位置正确，必须在扩髓前利用X射线成像观察针头位置。另一个关键步骤是用生理盐水冲洗骨髓腔，以清除骨髓残留物并松解骨髓组织，为后续新骨形成腾出空间。根据具体的研究问题、小鼠品系、基因型或小鼠年龄与体重的不同，可能需要对该方案进行相应调整11。 例如，若要评估骨再生潜力，可在清除术后第7天取材；而若要探究炎症反应如何影响骨形成，则应在术后约第3天（即炎症反应高峰期）取材股骨15。针头尺寸及生理盐水冲洗体积可根据动物体型和年龄进行调整。该手术技术常见的问题包括...

长&#160;骨损伤通过软骨内成骨或膜内成骨途径愈合。与需要软骨前体阶段的软骨内成骨途径不同，膜内骨化介导的骨修复涉及骨骼干细胞和祖细胞（SSPCs）直接转化为成骨细胞1。&#160;在临床上，该过程与多种情况下的骨愈合相关，包括临界尺寸缺损、稳定骨折、皮质骨缺损、牵张成骨、肿瘤切除后的创伤以及关节置换假体的骨整合2,3。有趣的是，在对长骨骨折患者的研究中，66%–82%的患者存在移位性骨折，需要使用固定装置来稳定骨骼4,5。这些被刚性固定的骨骼主要通过膜内骨化实现愈合，因为骨折端直接接触彼此6,7。然而，相较于通过软骨内成骨途径的骨形成，膜内骨再生的机制调控研究仍相对不足。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的促进骨愈合疗法由于临床疗效有限、成本高昂，并伴随显著的不良反应，其应用受到限制8。
机械性骨髓消融为研究膜内成骨提供了一个有价值的模型。这种简单的损伤模型可在不破坏皮质骨的情况下，用于研究骨髓内的骨再生过程。在骨髓消融后，愈合过程包括若干明确但相互重叠的阶段。初始阶段发生在术后第1至5天，涉及血凝块形成和炎症反应，此时炎症细胞和细胞因子启动修复过程。第3至14天为第二阶段，其特征是再生过程，包括新生血管形成、间充质干细胞（MSC）的迁移与增殖、成骨细胞分化以及编织骨的形成。最终的重塑阶段大约从术后第10天开始，骨组织持续成熟和重构，直至第56天骨髓完全恢复9。由于该模型具有较快的愈合时间线，因此非常适合研究早期骨修复反应，尤其是在炎症、前体细胞募集和成骨细胞分化等关键时期。通过组织学、流式细胞术和定量µCT分析等技术，可评估早期修复阶段的细胞反应和骨形成情况。利用上述技术，骨髓消融模型有助于揭示膜内骨再生的机制，并为发现促进骨愈合的关键治疗靶点提供依据。

<table><tbody><tr><td>10% 甲醛溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>25 G 0.625 英寸 Air-tite EZ Flo 皮下注射针头</td><td>Ait Tite/ Fisher Scientific</td><td>14-817-239; 货号#NEZ25058</td><td></td></tr><tr><td>26 G 1/2&quot; 一次性皮下注射针头</td><td>Exel International/ Fisher Scientific</td><td>14-840-83; 货号#26402</td><td>可使用任何 26 G 针头，但必须可与注射器分离&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 mL 无菌注射器</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-955-457</td><td></td></tr><tr><td>AB 无菌垫</td><td>McKesson/ Fisher Scientific</td><td>NC0593755</td><td>也可使用可高压灭菌的吸水垫&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0073</td><td>需稀释至 1%</td></tr><tr><td>氯化铵-氯化钾 (ACK) 溶解缓冲液</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td>用于流式细胞术前的红细胞裂解&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2 L 动物麻醉诱导室</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（碘伏）溶液&amp;nbsp;</td><td>Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific</td><td>NC0158124</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mL&amp;nbsp;</td><td>Generic/ Covetrus</td><td>59122</td><td>购买管制药品需取得州和联邦 DEA 许可证</td></tr><tr><td>钙黄绿素-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>206700-1MG</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 P&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11249002001</td><td>用于骨组织消化</td></tr><tr><td>棉签和涂抹棒</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22-363-172</td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm II 型 C(10)，3.5 cm</td><td>Section Lab, Japan</td><td>CFS 105</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 染色液&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td></td></tr><tr><td>数字克重天平</td><td>Toprime/ Amazon</td><td>B06X6LW4V9</td><td>可使用任意品牌天平称量小鼠</td></tr><tr><td>解剖镊&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-953E; 08-953F</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Endure 低剖面冷冻切片机/切片刀片</td><td>Tanner Scientific</td><td>TNR315LP</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR 缓释盐酸丁丙诺啡 1.3 mg/mL</td><td>Ethiqa XR/ Cevetrus</td><td>72117</td><td>购买管制药品需取得州和联邦 DEA 许可证</td></tr><tr><td>快绿，0.2%</td><td>Electron Miscroscopy Sciences EMS</td><td>50-319-57</td><td></td></tr><tr><td>经热灭活的胎牛血清</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A5256801</td><td>用于配制 FACS 染色介质 (FSM)</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片液&amp;nbsp;</td><td>SouthernBiotech&amp;nbsp;</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>GLUSEAL 外用皮肤粘合剂&amp;nbsp;</td><td>AD Surgical&amp;nbsp;</td><td>GLU-550</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21244</td><td>1:300 稀释</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific</td><td>14065056</td><td>用于配制 FACS 染色介质 (FSM)</td></tr><tr><td>加热垫（大号）</td><td>Boncare/ Amazon</td><td>B0CLHSWXSX</td><td>可使用任意品牌加热垫，需拆除布质外罩&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>MilliporeSigma/ Fisher Scientific</td><td>M1051740500</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>HX0514</td><td>用于骨组织消化</td></tr><tr><td>异氟烷动物麻醉系统</td><td>VetEquip</td><td>901810</td><td></td></tr><tr><td>KUBTEC Parameter 2D 柜式 X 射线成像系统</td><td>OncoMed Solutions</td><td>N/A</td><td>可使用任意柜式 X 射线成像系统</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Corning/ Thomas Scientific&amp;nbsp;</td><td>8600A52</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片，18 mm × 18 mm，#1 厚度</td><td>Globe Scientific</td><td>1414-10</td><td></td></tr><tr><td>N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸 HEPES (1M)&amp;nbsp;</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific</td><td>156300-80</td><td>用于配制 FACS 染色介质 (FSM)</td></tr><tr><td>Norland 光学胶 NO61</td><td>Edmund Optical</td><td>37-322</td><td>用于将冷冻切片粘附于载玻片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Osterix 兔单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab209484</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>Peroxigard 即用型一步消毒剂</td><td>Virox Technologies</td><td>29101</td><td>可替换为其他临床/实验室级消毒剂</td></tr><tr><td>碘化丙啶 (PI)&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P1304MP</td><td>核荧光染料，用于活率检测中识别死细胞</td></tr><tr><td>可充电电动剃毛器</td><td>Wahl/ Amazon</td><td>B001FWXKUE</td><td>可使用任意剃毛器，较小尺寸更便于为小型动物剃毛</td></tr><tr><td>啮齿类动物鼻罩</td><td>VetEquip</td><td>921609</td><td></td></tr><tr><td>固绿 SF，85% 纯度，经认证</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC419211000</td><td></td></tr><tr><td>Seal'N Freeze 冷冻托盘方形模具</td><td>Electron Miscroscopy Sciences EMS</td><td>62642-01</td><td>用于包埋，也可使用其他包埋模具。此型号模具较深，并配有密封盖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6506</td><td>用于 von Kossa 染色</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>也可使用过滤并高压灭菌的新鲜配制 PBS</td></tr><tr><td>无菌标准手术刀</td><td>Integra Miltex/ Fisher Scientific</td><td>12-460-455</td><td></td></tr><tr><td>无菌标准手术刀</td><td>Integra Miltex/ Fisher Scientific</td><td>12-460-455</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖粉末 1 kg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>036508-A1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>1255015</td><td>带粘附性的载玻片</td></tr><tr><td>Sure-Tek 组织处理/包埋盒</td><td>Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific</td><td>22-048-141</td><td></td></tr><tr><td>组织冷冻包埋剂（O.C.T. Compound）</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>组织海绵</td><td>Epredia/ Fisher Scientific</td><td>84-53</td><td>组织海绵可防止组织过度处理&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC348600050</td><td></td></tr></tbody></table>

通过小鼠骨髓损伤模型研究出生后膜内成骨的改进方法

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

长骨损伤通过软骨内成骨或膜内成骨两种途径愈合。与需要软骨模板的软骨内成骨途径不同，膜内成骨过程涉及骨骼干细胞和祖细胞（SSPCs）直接转化为成骨细胞。目前可用于在实验小鼠中模拟该过程的外科方法十分有限。本文中，我们改进了一种小鼠骨髓损伤模型，以促进通过膜内成骨研究骨修复过程，并评估成骨的出生后调控因子。该方法具有高度可重复性和良好的操作性，可在短时间内（损伤后3-7天）利用微型计算机断层扫描（µCT）和冷冻切片组织学对新骨形成进行时间动态评估。此外，结合荧光报告小鼠与该膜内成骨骨髓损伤模型，可方便地评估SSPCs和成熟成骨细胞的贡献。在临床背景下，膜内成骨与大段骨缺损修复、稳定骨折愈合、皮质骨缺损、肿瘤切除后的创伤修复以及关节置换密切相关。

通过X射线成像验证了机械性骨髓（BM）消融手术的成功，此时将26G针头插入髓腔（图2A）。当X射线成像显示针头插入角度不当或穿透骨组织时，需调整针头至正确角度后重新插入，并再次成像以确认其准确位置。若无法达到成功的位置，则将该实验动物排除在分析之外。尽管放射学二维（2D）成像可确认针头已插入骨髓腔内，但仍需三维（3D）成像来确认针头路径的精确轨迹。损伤的范围和位置在组织收获后通过股骨的定性µCT分析进一步评估（图2B）。损伤后7天，小梁骨出现快速而显著的再生，表现为骨体积分数增加七倍、小梁数目增加一倍（图2C-E），同时小梁厚度增加、小梁间距减小（图2F-G）。
通过甲苯胺蓝染色显示了完整和受损骨骼的生长板和骨髓...

小鼠骨髓损伤模型是研究出生后通过膜内成骨进行骨形成的有效工具。该简化的手术方案描述了骨髓消融操作，可用于后续评估损伤后新骨形成及细胞反应。

长骨损伤通过软骨内成骨或膜内成骨两种成骨途径进行愈合。与需要软骨模板的软骨内成骨途径不同……

我们的研究致力于利用骨髓损伤模型来理解骨修复机制。我们旨在揭示在骨愈合过程中膜内成骨是如何被调控的，并探索可用于促进骨再生的治疗策略。该领域近期的研究已确定了定义骨骼干细胞及其祖细胞的表面标志物，揭示了它们在骨骼发育与修复中的关键作用。本方案能够研究这些细胞在膜内成骨过程中的作用，从而探索其在骨修复过程中的调控机制及作为治疗靶点的潜力。本方案通过采用具有临床相关性的模型，弥补了目前对出生后环境中仅通过膜内成骨进行骨修复的理解空白。与其他用于研究膜内成骨的损伤模型相比，本方案在长骨中提供了更可控的实验环境以及可重复的损伤反应。未来，我们的实验室将结合骨髓损伤模型与局部药理学方法， transiently 调控成骨作用的表观遗传调节因子。我们的目标是通过新型治疗手段增强骨再生与愈合。首先，使用临床级消毒清洁剂准备并消毒所有工作表面。用无菌手术垫覆盖加热平台。收集并摆放所有无菌器械以及试剂。现在，使用精密天平称量小鼠的体重。根据现有的丁丙诺啡制剂，计算镇痛给药所需的体积。麻醉小鼠后，小心地将其从诱导室中取出。将动物置于无菌手术垫上，呈仰卧位，并将鼻罩套在小鼠头部。短暂将小鼠从鼻罩中取出，通过皮下注射途径给予计算剂量的缓释布托啡诺镇痛剂。然后小心地将小鼠重新放回鼻罩式麻醉装置中。用无菌生理盐水填充一支配有26号针头的3毫升注射器，并将其放置在旁边备用。使用电动或电池驱动的剪毛器去除将要进行操作的后肢部位的毛发。用无菌棉签将10%聚维酮碘溶液涂抹于手术区域，随后使用70%异丙醇溶液擦拭，并让该区域完全干燥。然后将小鼠仰卧放置，并屈曲手术侧肢体的膝关节。用非惯用手握住腿部，使膝盖弯曲并置于中指上方，第二根手指放在股骨上，拇指放在胫骨上。使用手术刀，在髌骨下方做一个小而浅的横向切口。将针头水平置于屈曲的膝关节上，触摸股骨与胫骨之间的间隙以确定关节腔位置。以此解剖标志为引导，用手持方式从膝关节向近端方向，用25号针头钻入股骨远端。将针头穿过或绕过髌骨插入。通过X射线确认针头在骨髓腔内的正确位置，确保其尽可能接近中心。拔出25号针头后，立即在同一骨髓腔孔洞中插入26号针头。以环形动作在骨髓腔内壁扩髓至少五次，直至感觉光滑为止。然后移除26号针头，用1.5至2毫升生理盐水冲洗创腔，直至回流液变清亮。将注射器和针头安全弃置于指定容器中。接下来，使用医用粘合剂闭合皮肤伤口。手术后立即给予先前计算好的剩余剂量的缓释丁丙诺啡。将动物置于加热垫上，监测其是否出现正常、无阻塞的呼吸迹象。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在小鼠骨髓损伤模型中通过膜内骨化研究产后成骨的改进方法

本文介绍了一种基于改良Ilizarov外固定器应用的长骨骨折稳定方法1-3。在安装固定器并制造骨损伤后，可对骨愈合过程进行评估，实施牵张成骨，或制造骨不连或临界尺寸缺损，用于研究治疗干预措施。...

创建刚性固定的骨折模型以评估膜内成骨、牵张成骨或临界尺寸缺损的愈合

对骨折愈合过程中骨祖细胞功能进行定量测量，需要高分辨率的连续成像技术。本文提供了利用活体显微镜结合成骨谱系示踪技术，对内源性成骨干细胞/祖细胞在修复骨骨折过程中的迁移、增殖和分化进行连续成像与定量分析的实验方案。...

依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

在生物医学研究中，动物模型常被用于模拟严重的骨损伤。由于小鼠体型较小，大多数研究团队难以在其体内建立稳定的骨缺损模型。本文中，我们描述了一种在小鼠中建立和分析实验性股骨缺损的简便方法。...

一种简单的小鼠股骨临界尺寸缺损模型

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。...

建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。...

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

本方案描述了一种使用髓内锁定钉进行股骨截骨标准化固定的骨接合技术，可用于分析小鼠正常及缺陷性骨愈合过程。...

一种用于小鼠股骨截骨术标准化固定的髓内锁定钉以分析正常与缺陷性骨愈合

在软骨内骨愈合过程中，评估骨折愈合组织中组织发育情况对于监测愈合进程至关重要。本文报道了一种适用于小鼠股骨的磁共振成像（MRI）兼容外固定装置，可在小鼠骨再生过程中实现MRI扫描。...

体内评估小鼠股骨骨折愈合过程中骨痂发育：采用一种适用于小鼠股骨的磁共振成像兼容骨固定装置

本方案描述了一种使用髓内螺钉进行股骨骨折标准化固定的微创接骨技术，可用于分析小鼠的软骨内成骨愈合过程。...

一种在标准化生物力学条件下分析小鼠软骨内骨折愈合的微创模型

小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合及加速骨再生新型治疗策略的有力平台。本手术方案的目标是通过使用髓内钢针固定股骨，在小鼠体内建立单侧闭合性股骨骨折。...

小鼠闭合性股骨骨折的建立：一种用于研究骨愈合的模型

本方案描述了一种在小鼠股骨上建立骨干骨折并用髓内钢针固定的外科手术方法，用于骨折愈合研究。...

建立小鼠股骨骨干骨折模型

本方案介绍了一种全面且高效的下颌骨修复分析方法。我们描述了一种在小鼠模型中建立非稳定型下颌骨骨折的可重复技术，可在组织损伤和骨量丢失最小化的情况下，用于分析软骨内成骨修复过程。...

小鼠模型中非固定性下颌骨骨折的微创技术

了解小鼠骨髓损伤模型中膜内骨化的产后成骨机制。本方法通过手术消融建立可控环境，用于评估骨骼干细胞在骨修复中的贡献及治疗靶点。

通过小鼠骨髓损伤模型研究出生后膜内成骨的改进方法

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